全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(4)：451— 454 2008年 7月
曼地亚红豆杉 RAPD反应体系与程序的优化
黄夕洋，蒋水元，李 虹，李 锋
(； 广西植物研究所，广西桂林54106)
摘 要：以曼地亚红豆杉为研究对象，采用 L16(4s)正交组合实验和单因素梯度实验对 MgCI2、dNTP、随机引
物 、Taq酶、模板 DNA浓度和退火温度、循环次数等影 响 RAPD扩增 的重要 因素进行优化 ，以期建立最优 的
RAPD反应体 系与程 序。实验结果 表明，各 因素最适 条件为 ：25~LPCR反应体 系中 10×Buffer 2．5 L，
MgC12 1．5 mmol／L，dNTP 0．2 mmol／L，随机引物 0．6／~mol／L，Taq酶 1．0 U，模板 DNA 80 ng；退火温度为
37℃，循环次数为 45次。
关键词：曼地亚红豆杉；RAPD优化；反应体系和程序；正交组合；单因素
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2008)04—0451—04
Optimization of the RAPD reaction system
and procedure of Taxus media
HUANG Xi—Yang，JIANG Shui-Yuan，LI Hong，LI Feng
(Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences，Guilin 541006，China)
Abstract：Regarded Taxus media as the research object，several important factors included MgClz，dNTP，ran—
dora primer，Taq polymerase，template DNA and annealing temperature，amplification were optimized by L16
(4 )orthogonal design experiment and single factor experiment in order to establish optimal RAPD system
and procedure．The results showed that a tota1 volume of 2 5 L PCR reaction system conditioned 1 0×Buffer
2．5 L，MgCI2 1．5 mmol／L，dNTP 0．2 mmol／L，random primer 0．6／2mol／L，Taq polymerase1．0 U，template
DNA 80ng，and annealing temperature was 37℃ ，amplification for 45 cycles．
Key words：Taxus media；RAPD optimization；reaction system and procedure；orthogona1 design；single factor
随着分子生物学技术的迅速发展，特别是其在
药用植物研究中发挥的重要作用，为实现中药现代
化提供了很好的基础。目前，现代分子生物学技术
在药用植物上应用主要是分子标记技术和生物技术
二大技术(傅荣昭等，1998)。随机扩增多态性 DNA
分子标记(Random Amplified Polymorphic DNA，
RAPD)由于其操作简便快速、省时省力、DNA用量
少 ，已在药用植 物研究 中得 到了广 泛的应用 。由于
RAPD分子标记一般表现为显性遗传，其 PCR易受
到实验条件的影响，对反应条件要求严格。并且
RAPD的稳定性与重复性较差，不太令人满意，反应
中的诸多因素都对扩增结果有一定的影响，因此优
化并统一反应体系是 RAPD成功的基础(普晓兰
等，2003；盛丽等，2005)，可获得理想的 RAPD图
谱。目前，关于专门对影响RAPD反应结果的因素
进行优化的研究已有了报道(王金刚等，2002；徐莉
等，2005；张辉等，2005；沈一岚等，2006)。
曼地亚红豆杉(Taxus media)是从北美加拿大
引种的一种杂交红豆杉，多为常绿灌木，从其枝、叶、
茎、根中提取的具有较高抗癌活性的紫杉醇，是新型
的天然植物抗癌药物，正由于红豆杉属药用价值很
高，已日益受到世人瞩 目，开发和利用其资源己成为
收稿日期：2007-11-19 修回日期 ：2008-02-27
基金项目：广西科技攻关项目(0537017—11)[Supported by Key Technologias Research and Development Program of Guangxi(0537017一l1)]
作者简介：黄夕洋(1981一)，女 ，广西南宁人，硕士，研究实习员，主要从事分子生物学与保护生物学等研究 。
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当今研究的热点(毛锁云等，2002)。RAPD标记关
于曼地亚红豆杉方面的研究较少，而对于红豆杉科
中其它物种的研究则较多(陈毓亨等，1999；王艇等，
2000；张宏意等，2003；王贵荣等，2005；Karin Hil—
fiker等 ，2004；Li等 ，2006)，因此本研究首先对其反
应条件进行筛选，应用正交组合实验，并结合单因素
梯度筛选实验，对影响RAPD结果的Mg抖、dNTP、
随机引物、Taq DNA聚合酶、模板 DNA的浓度和
退火温度、循环次数等因素进行优化，旨在建立一套
适用于曼地亚红豆杉稳定的 RAPD反应技术体系。
为今后运用 RAPD分子标记技术对曼地亚红豆杉
种内以及品种间进行遗传多样性等分析研究，并提
高实验的准确性奠定理论与实践基础。
1 材料与方法
1．1实验材料
曼地亚红豆杉新鲜枝条叶片采自位于广西桂林
资源县越城岭林场的广西植物研究所与晖昂生化药
业有限责任公司共建的曼地亚红豆杉种植基地。带
回实验室后，用清水洗涤除去灰尘等杂物，室温晾干
后保存于-70℃冰箱备用。
1．2试剂药品
dNTP和随机引物购于上海生工生物工程技术
服务有限公司；Taq DNA聚合酶购于上海中科开瑞
生物芯片科技股份有限公司；Lambda DNA／Hind
Ⅲ+EcoR I Markers购于华美生物工程公司。
1．3实验方法
1．3．1正交组合优化 RAPD反应体 系 采用 CTAB
法提取植物 DNA，经初步实验筛选后选择 $92(5
CAGCTCACGA3 )为优化 实 验用 的随机 引物。
RAPD反应采用 25／~LPCR反应体系，设计 Mg抖、
dNTP、随机引物、Taq酶和模板 DNA五因素四梯
度水平(表 1)，查正交表 L16(4。)(杜荣骞，1999)进
行正交组合设计(表 2)。
在 Biometra UNO 1I PCR仪上进行扩增，基本
反应程序为：95℃ 3 min；94℃ 1 min，36℃ 1 min，
72℃ 2 min，40个循环；最后 72℃ 延伸 10 min。
PCR产物经 1．5％琼脂糖凝胶电泳后在生物电泳图
像分析系统(复 日科技 FR一2OO)上观察并照相。
1．3．2单因素优化反应程序 进一步对 RAPD反应
程序中的退火温度和循环次数进行单因素梯度优化
筛选，并比较两者对扩增条带数和清晰度的影响。
退火温度、循环次数分别设计 4个梯度，35℃、36
℃、37℃、38℃和 35次 、38次、4O次、45次。
表 l 反应体系正交组合各因素水平表
Table 1 Orthogonal design factorial
levels of RAPD reaction system
表 2 反应体系正交组合设计实验方案
Table 2 Experiment scheme of orthogonal
design of RAPD reaction system
实验号 MgClz dNTP 引物 Taq酶
No． (mmol／L) (mmol／I ) (,umol／L) (U)
O．1O
0．15
0．20
O．25
O．1O
0．15
0．2O
O．25
O．1O
0．15
O．2O
0．25
O．10
0．15
O．20
O．25
1．3．3最优反应体 系与程序的稳 定性检测 根据反
应体系与反应程序的优化结果，更换随机引物进行
PCR反应，实验重复 3次，从扩增条带的清晰度、重
复性来检测 RAPD的稳定性。
2 结果分析
2．1正交组合对 RAPD反应体 系的影响
RAPD反应扩增所得到的结果之中，每一因素
的改变均对扩增条带有影响，并且各因素之间存在
一 个动态的适合浓度比例，可以说 RAPD标记得到
的结果是各因素相互之间优化的综合。
根据正交组合设计的实验方案 ，一共有 16个组
合实验，不同组合的 PCR扩增结果存在一定的差
异，结果依次如图 1中 1～16泳道所示。这 16个正
洲 的∞ 姗姗 印的印的姗 姗的印
O 5 O O O 5 O 5 O O 5 O L L L L LL L L L LL 二二
1 2 4 6 2 1 6 4 4 6 1 2 6 4 2 1
c； c； c；c； c= c；c； c； c； c； c=c；
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次实验得到的结果是一致的，扩增的 DNA条带清
晰明显，无拖尾模糊现象，重复性强。因此该优化建
立的曼地亚红豆杉 RAPD反应体系与程序是最适
的，并且稳定性和重复性好。
图4 随机引物 $111、S128、$139、Sio6扩增
RAPD的稳定性检测结果
Fig．4 The experiment results of the stability of
RAPD by random primer$111，$128，S139，S106
3 讨论
RAPD标记的重复性不是很好，其谱带对实验
程序和条件的变化很敏感，因此利用 RAPD分子标
记时，为了保证结果的稳定性和可重复性，首先对其
反应条件进行优化是必不可少(高燕会等，2006)。
因此，本研究对曼地亚红豆杉 RAPD-PCR反应中
的7个因素进行了优化处理探索。
首先对 RAPD反应体系中的重要因素(Mg抖、
dNTP、随机引物、Taq DNA聚合酶、模板 DNA)采
用正交组合实验来优化。正交设计是用正交表来安
排试验，用统计学原理来研究各因子试验的一种设
计方法，它具有均衡分散、综合可比和效用明确的特
性(张彦萍等，2005)。因此，正交设计用于 RAPD
反应体系的建立，具有工作量小，信息量大，数据分
析简单，并 可分析交互作用等优点 (王家保等，
2005)；既可避免了传统的繁琐优化过程，也可考察
出不同因素之间的相互作用，得出正交表中最佳的
处理。同时为了保证 RAPD反应结果的稳定性和
重复性，仍需对反应程序的参数作进一步的研究实
验，所以参照许多的研究报道(高燕会等，2006；张彦
萍等，2005；王金刚等，2002)对退火温度、循环次数
进行单因素优化实验，即可在短时间内快速得到一
个最优反应程序。
根据优化研究结果与稳定性检测表明，所获得
的曼地亚红豆杉最优 RAPD反应体系与反应程序
的稳定性好、重复性强、扩增带型清晰，完全可以满
足 RAPD实验分析的需要；并可为以后研究曼地亚
红豆杉及其近缘种的遗传多样性、分子育种等方面
提供扎实的理论基础与技术保证，以及缩短实验进
程和消耗。同时还须注意在应用 该 RAPD反应条
件时，应保持其各因素条件的不变，并尽可能的使用
同一厂家的药剂和同一 PCR仪器设备等，以提高
RAPD分析结果的重复性和可靠程度。
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in China(我国境内几种红豆杉的RAPD分析和染色体鉴定)
(下转第 472页 Continue on page 472)
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植物区系成分的组合特征、演化的历史和近代趋势、
区系的多样性和独特性。由此也说明群落学取样方
法在区系分析中能得到可靠的结果。
综上所述，九连山自然保护区是泛热带及热带
亚洲植物区系与北温带植物区系过渡的交汇地带，
是泛热带植物区系成分的分布最北缘地区之一，以
及东亚——北美区系成分的分布最南端地区之一。
致谢 本文得到了九连山国家级 自然保护区管
理局的大力帮助和支持；成军锋、周华、罗淑琴、杨盛
锋、王琴、占青等参与了野外调查与数据整理，在此一
并表示感谢!
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