全 文 ：园　艺　学　报　2002 , 29 (4):372 ～ 374
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:2001-10-23;修回日期:2001-12-17
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (39830260);国际科学基金资助项目 (D/ 3001-2);湖北省自然科学基金资助项目
(2000J113)
电场诱导原生质体融合获得柑橘属间四倍体体细胞
杂种
刘继红　胡春根　邓秀新
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 武汉 430070)
摘　要:采用电融合方法诱导澳洲指橘 (Microcitrus papuana Swingle)悬浮系原生质体与 柑 (Citrus
reticulata Blanco)叶肉原生质体融合 , 得到了再生植株。染色体检查表明再生植株为四倍体 (2n=4x=36),
6 个 10-mer碱基随机引物 PCR扩增结果表明 , 尽管再生植株带型表现多样 , 但仍然可以证明为体细胞杂种。
对再生植株田间生长异常的现象进行了讨论。
关键词:柑橘;电融合;体细胞杂种;四倍体;RAPD
中图分类号:S 661;Q 943　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2002)04-0372-03
1　目的 、 材料与方法
自Ohgawara等〔1〕得到枳与 Trovita甜橙的体细胞杂种以来 , 已得到 200余例种 、属间体细胞杂种 ,
为柑橘育种提供了大量可供选择或直接利用的材料。 柑 (Citrus reticulata Blanco)品质极佳 , 但最大
不足是种子多。澳洲指橘 (Microcitrus papuana Swingle)具有较短的童期 , 其线粒体基因组与无籽性状
有关 。作者试图通过原生质融合获得二者的体细胞杂种 , 为获得无籽 柑提供新的育种途径和材料。
取生长在固体培养基 (MT+50 g/L 蔗糖+0.7 %琼脂)中的澳洲指橘愈伤组织建立悬浮系 , 每
12 d继代 1次 , 继代 3次后 , 于第 7 ～ 10天时取愈伤组织分离原生质体。用NaOH (1 mol/L)脱去
柑种子表面的果胶 , 再用 10%次氯酸钠表面消毒 20 min , 用无菌蒸馏水冲洗 5次 , 播种于MT 基本培
养基 (含 30 g/L 蔗糖和 0.7 %琼脂)中 。
参照Grosser等〔2〕的方法分离和纯化原生质体 , 电场诱导融合的条件参考以前的方法〔3〕 。细胞团
增殖培养基为 EME500 (MT+麦芽提取物500 mg/L+50 g/L 蔗糖+0.7 %琼脂), 胚状体增殖培养基为
EME1500 (MT+麦芽提取物 1 500 mg/L+50 g/L 蔗糖+0.7 %琼脂), 生芽培养基 、 生根培养基分别为
MT+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L KT+25 g/L 蔗糖+0.7 %琼脂和 1/2MT+0.1 mg/L IBA
+0.5 mg/L NAA+0.5 g/L 活性炭+25 g/L 蔗糖+0.7 %琼脂 。切下不能生根的丛芽进行试管嫁接以
获得完整植株。
参考Grosser等〔2〕的方法采用铁矾 —苏木精染色法检查再生植株的染色体 , 用 SDS 法提取澳州指
橘愈伤组织 、 柑及再生植株叶片的总 DNA。DNA提取 、 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳均参照史永忠
等〔4〕的方法进行 。
2　结果与分析
2.1 　植株再生
澳洲指橘悬浮系原生质体与 柑叶肉原生质体融合后 , 2个月左右得到胚状体 , 子叶期胚状体在
生芽培养基中很快长出丛芽 (图版 , 1), 但丛芽在生根培养基中较难生根 。虽然切下很多丛芽培养在
生根培养基中 , 但大部分培养一段时间后叶片掉落 , 出现枯死状态 , 仅得到 1棵自根小植株。澳洲指
橘与 柑在叶片形态上差别很大 , 前者叶片极小 , 后者叶片大 , 长椭圆形 , 有翼叶 。试管中的再生苗
叶片较小 , 近圆形;当小苗移到温室后 , 刚长出的新叶与 柑叶片相似 (图版 , 2)。
2.2 　再生植株倍性鉴定
对再生植株嫁接苗的茎尖和生根苗的根尖及茎尖进行染色体检查 , 观察到细胞均具有 36条染色
体 , 表明它们为四倍体 (图版 , 3)。
2.3 　再生植株杂种特性分析
共用 6个引物对自根苗进行杂种特性的鉴定。这 6个引物都能够将澳洲指橘和 柑分开 , 但所分
析植株的带型情况较复杂 , 在 OPV-07 、 OPW-09和 OPA-20引物的扩增产物中出现双亲的特异带 (图
版 , 4 、 5 、 6), 但在其它 3个引物中均未表现出双亲带型之和 , 而是与双亲有较大差别。如在引物
OPA-08的扩增产物中 , 再生植株与融合双亲都不一样 , 但具有澳洲指橘的 1条特异带 (图版 , 7);
在引物OPE-05和OPA-07的扩增图中 , 再生植株都具有 柑的特异带 (图版 , 8 、 9), RAPD分析结果
证明融合再生植株为体细胞杂种。与融合双亲相比 , 再生植株发生了较多带的丢失 (在引物 OPW-09 、
OPA-07 、 OPE-05和 OPA-08中), 此外 , 在 OPE-05的扩增产物中 , 再生植株出现了一条新带 。
2.4 　再生植株在田间的生长情况
自根苗在移到温室盆栽钵中后 , 刚开始生长较为正常 , 但随着时间的推移 , 顶端部分小枝条枯
死 , 然后再长出新的小枝条。这样的现象持续了较长时间。最为严重的是 , 该植株地上部全部枯死 ,
与土壤接触处又长出新芽和叶 (图版 , 10)。
无籽是鲜食柑橘品种的一个优良性状 , 现有无籽柑橘品种大部分为温州蜜柑和脐橙系列 , 主要通
过芽变和实生变异产生。除上述途径外 , 还可以通过二倍体与四倍体杂交 、胚乳培养等途径获得无籽
品种 。但四倍体缺乏以及胚乳再生植株生长很弱等不利因素限制了这些技术的发展 。近年来发展较快
的原生质体融合技术则是获得无籽柑橘类型的新方法 , 同时 , 原生质体融合是实现胞质基因组 (如线
粒体)转移的有效手段。而且现有研究表明 , 目前所得到的柑橘种间和属间体细胞杂种的线粒体基本
上都来自于悬浮系亲本〔5〕 。本研究将澳洲指橘悬浮系原生质体与 柑叶肉原生质体融合 , 以期转移前
者线粒体基因组在理论上是可行的 。本研究得到的生根苗移栽温室后出现枝条枯死的现象 , 在以往已
有类似的报道。史永忠等发现 6年生伏令夏橙与宁波金柑属间体细胞杂种植株移栽到田间后 , 新梢经
常枯死。染色体检查表明 , 该植株中 , 除了四倍体细胞外 , 还观察到部分非四倍体的细胞 (比例高达
20.0 %～ 31.6 %), 表明植株的核基因组处于一种不平衡状态〔6〕 。虽然本研究未在自根苗中观察到异
常倍性的细胞 (可能是该植株培养只有 1 年 , 时间太短), 但其 RAPD分析与史永忠等的结果较为接
近 , 融合亲本特异带在再生植株中出现了丢失 , 表现出遗传上的不稳定性 , 其原因可能是澳洲指橘与
柑橘属亲缘关系较远 , 存在体细胞不亲和性 (Somatic incompatibility), 从而导致再生丛芽生根较难 ,
以至植株在田间生长异常 。未来克服这一困难的方法是开展非对称融合或胞质杂交 , 达到既避免体细
胞杂交不亲和障碍 , 又能够转移澳洲指橘线粒体基因组的目的 。
参考文献:
1　Ohgawara T , Kobayashi S , Ohgawara E , et al.Somatic hybrid plants obtained by protoplast fusion between Citrus sinensis and Poncirus trifoliata.
Theor.Appl.Genet., 1985 , 71:1～ 4
2　Grosser J W , Gmitter F G.Protoplast fusion and citrus improvement.Plant Breed Rev., 1990 , 8:339～ 374
3　刘继红 , 胡春根 , 邓秀新.原生质体电融合再生柑橘属间体细胞杂种.实验生物学报 , 2000 , 33:325～ 332
4　史永忠 , 郭文武 , 邓秀新.柑橘 RAPD技术体系建立与体细胞杂种鉴定.园艺学报 , 1998 , 25 (2):105～ 110
5　刘继红 , 邓秀新.粗柠檬与哈姆林甜橙二倍体体细胞杂种胞质基因组初步分析.植物学报 , 2000 , 42 (1):102～ 104
6　Wijbrandi J , Posthuma A , Kok J M , Asymmetric somatic hybrids between Lycopersicon esculentum and irradiated Lycopersicon peruvianum .1:Cytoge-
netics and morphology.Theor.Appl.Genet., 1990 , 80:305～ 312
3734 期　　　　　　　　　刘继红等:电场诱导原生质体融合获得柑橘属间四倍体体细胞杂种　　　　　　　　　
Production of Citrus Intergeneric Tetraploid Somatic Hybrids Plant from Elec-
tricity-mediated Protoplast Fusion
Liu Jihong , Hu Chungen , and Deng Xiuxin
(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvements , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , China)
Abstract:Ponkan(Citrus reticulata Blanco), which is very seedy , is one of the most widely grown mandarin
cultivars in China for its good quality.Mitochondrial genome of Microcitrus papuana is related to seedlessness.But
it is of difficulty to transfer the cytoplasmic genome of the latter.The present research involves electrofusing embry-
onic protoplasts of M.papuana and leaf-derived protoplasts of Ponkan , from which plants were obtained.Chromo-
some detection showed that the plants were tetraploids with 36 chromosomes.Amplification with six 10-mer arbitrary
primers identified the plant as true somatic hybrids though complex band profiles of the regenerated plant were ob-
served.The somatic hybrid plant holds great potential for breeding seedless varieties of Citrus.In addition , abnor-
mal growth of the plant in field is discussed herein.
Key words:Citrus;Electrofusion;Somatic hybrid;Tetraploid;RAPD
图版说明　1.再生丛芽;2.再生植株;3.四倍体细胞 (2n=2x=36 , 1500×);4 ～ 9.分别为 OPV-07、 OPW-09 、 OPA-20 、 OPA-08 、
OPE-05和OPA-07引物的 RAPD扩增带型 , 泳道中前两道分别为澳洲指橘和 柑 , 第 3道为再生植株;10.再生植株新梢枯死。
Explanation of plates　1.The regenerated shoots;2.The regenerated plant;3.A tetraploid cell (2n=2x=36 , 1500×);4-9.Band pattern of
RAPDs amplified by OPV-07, OPW-09 , OPA-20 , OPA-08, OPE-05 andOPA-07, respectively.The former two lanes are Microcitrus papuana and Ponkan
and the third one is the regenerated plant;10.Die back of the plant.
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