全 文 ：收稿日期:2008-11-13
基金项目:国家林业科技支撑计划项目(2006BAD01A16)
作者简介:段永红(1974-),女 ,山西太谷人 ,博士 ,讲师 ,主要从事生物化学和分子生物学研究。
通讯作者:牛西午(1947-),男 ,山西兴县人 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事干旱区生态及资源的开发利用研究。
锦鸡儿属植物遗传多样性的 RAPD分析
段永红1 , 2 , 3 ,牛西午2 ,李素清4 ,孙　毅1 , 2
(1.山西大学 生物技术研究所 ,山西太原　030006;2.山西省农业科学院 ,山西太原　030006;
3.山西农业大学,山西 太谷　030801;4.山西太原师范学院 ,山西太原　030012)
　　摘要:应用 RAPD技术 , 对我国不同产地的锦鸡儿属植物 30 份材料进行遗传多样性分析 , 从 40个随机引物中筛
选出 15 个有效引物 , 共扩增出 87条 DNA片段 , 其中 74 条为多态性条带 , 约占总数的 84.1%。 30 份材料聚类结果可
将供试材料分为 4个类群:Ⅰ .中间锦鸡儿材料区 , Ⅱ .小叶锦鸡儿材料区 , Ⅲ .柠条锦鸡儿材料区和Ⅳ.秦晋锦鸡儿材
料区 , 中间锦鸡儿 、小叶锦鸡儿和柠条锦鸡儿种间差异不大 ,有较近的亲缘关系 , 它们与秦晋锦鸡儿的亲缘关系较远 ,
同时反映出品种间关系与地理起源有一定的相关性。
关键词:锦鸡儿属;RAPD;遗传多样性;聚类分析
中图分类号:Q3　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2009)01-0143-06
Genetic Diversity Analysis of Peashrub in China by RAPD
DUAN Yong-hong1, 2 , 3 ,NIU Xi-wu2 , LI Su-qing4 , SUN Yi1 , 2
(1.Institute of Bio-technology ,Shanxi University ,Taiyuan　030006 ,China;
2.Shanxi Academy of Agriculture Sciences ,Taiyuan　030006 ,China;
3.Shanxi Agricultural University ,Taigu　030801 ,China;4.Department of Geography ,
Taiyuan Normal University ,Taiyuan　030012 ,China)
Abstract:Peashrub , in common name of Caragana Fabr , there is about 66 species of peashrub were recorded in
China ,which are mainly distributed in arid and semi-arid areas of North China.All species of peashrub developed typical
biological features ,which are highly drought-tolerant and good shrubs for dune-fixation , animal feeding , and biological re-
sources for fuel energy and fiber material.They are valuable plants for the ecological restoration of North China.It is very
important to analyze the genetic diversity of peashrub for protecting and utilizing them.In this paper , the genetic diversi-
ties of 30 peashrubs form different places in North China were analyzed by RAPD markers.Among 87 RAPD bands ob-
tained form 15 primes ,74 bands were polymorphic which occupied 84.1% of the total.Cluster analysis showed that the
tested materials of 30 peashrubs could be divided into 4 groups:population of C .intermedia;population of C.microphyl-
la;population of C .korshinskii Kom and population of C.purdomi , the relationships among population of C.intermedi-
a ,population of C.microphylla and population of C.korshinskii Kom are nearer than population of C.purdomi , it also
showed that their relationships are related with the geographic origin.
Key words:Caragana Fabr;RAPD;Genetic diversity;Cluster analysis
　　锦鸡儿属(Caragana Fabr.)植物系落叶灌木 ,是
欧—亚草原植物亚区的典型植物种类。全球锦鸡儿
属植物约有百余种[ 1] ,主要分布在欧亚大陆干旱和
半干旱地区。我国现已查明的锦鸡儿属植物有 66
种[ 2] ,从森林区 、草原区到荒漠区都有分布 ,但主要
集中分布在草原和荒漠区。锦鸡儿属植物不仅具有
防风固沙 、保持水土的生态功能 ,而且具有饲用 、绿
肥 、能源 、蜜源 、入药 、木质纤维等资源价值[ 3] 。锦鸡
儿属植物在我国北方种植广泛 ,其栽培种在我国通
称柠条(Caragana korshinskii Kom.)[ 4] 。柠条的种子
华北农学报·2009 , 24(1):143-148
不仅是重要的油脂资源[ 5] ,而且是潜在的饲用植物
蛋白资源[ 6] 。作为重要的资源植物 ,锦鸡儿属植物
从定名至今已有 200多年的研究历史[ 7] ,以往对锦
鸡儿属植物的研究工作多数集中于生物地理学 、资
源分布与生态学 、系统分类学 、化学成分分析 、孢粉
学及引种驯化等方面 ,但是这些研究大都是在传统
的形态学和育种原理的基础上进行的 ,染色体核型
和带型分析也为细胞学水平上认识锦鸡儿属植物的
遗传差异起了积极作用 ,但由于锦鸡儿属植物种类
繁多 、种内变异复杂 ,因此在分类上仍然存在一些困
难[ 8-14] 。
分子标记技术的快速发展为在 DNA 水平上进
一步分析锦鸡儿属植物遗传差异提供了可能性。随
机扩增多态性 DNA(RAPD)分子标记技术 ,是以 PCR
为基础的有效种质鉴定手段 ,由于它具有多态性高 ,
分析手段相对快速 、简便和经济的优势 ,目前已被广
泛应用于动植物种内品系区分 、种间或种内的亲缘
关系和遗传变异水平的检验 、杂种优势的鉴定等方
面[ 15-20] 。本研究选取不同产地的锦鸡儿属植物 30
份材料(表1),通过 RAPD技术对其种质资源的遗传
多样性进行筛查 ,确定它们之间的亲缘关系 ,旨在为
进一步筛选其优良品种及分子标记辅助育种提供分
子生物学依据 。
1　材料和方法
1.1　试验材料
本研究的试验材料包括 4种锦鸡儿属植物:秦
晋锦鸡儿(C.purdomi)、小叶锦鸡儿(C.microphyl-
la)、中间锦鸡儿(C.intermedia)和柠条锦鸡儿(C.
korshinskii Kom),它们的种子均采集于各地的人工
林。从中选取颗粒饱满 、无虫蛀 、无霉变的种子 ,用
于本试验 。
表 1　试验材料来源
Tab.1　Origin of materials
材料编号
Materials
numbers
产地
Origin
种名
Species
生态类型
Ecotype
年均降水量/ mm
Annual average
precipitation
1 　内蒙古包头 中间锦鸡儿 SX 308.8
2 　内蒙古呼和浩特 小叶锦鸡儿 X 417.4
3 　内蒙古清水河 柠条锦鸡儿 X 409.0
4 　青海民和 中间锦鸡儿 SX 301.1
5 　内蒙古二连浩特 小叶锦鸡儿 X 142.3
6 　内蒙古鄂尔多斯 中间锦鸡儿 SX 200.0
7 　山西岢岚 小叶锦鸡儿 X 448.0
8 　内蒙古阿拉善 小叶锦鸡儿 X 195.1
9 　内蒙古凉城 秦晋锦鸡儿 XM 400.0
10 　山西保德 小叶锦鸡儿 X 400.0
11 　陕西榆林 秦晋锦鸡儿 XM 413.9
12 　山西河曲 柠条锦鸡儿 X 379.0
13 　陕西靖边 秦晋锦鸡儿 XM 395.4
14 　山西左云 小叶锦鸡儿 X 432.4
15 　山西五寨 小叶锦鸡儿 X 463.0
16 　内蒙古杭锦旗 中间锦鸡儿 SX 251.3
17 　内蒙古四子王旗 中间锦鸡儿 SX 250.0
18 　山西广灵 小叶锦鸡儿 X 418.2
19 　陕西吴旗 中间锦鸡儿 SX 495.3
20 　陕西定边 小叶锦鸡儿 X 323.6
21 　山西平鲁 柠条锦鸡儿 X 435.2
22 　山西神池 小叶锦鸡儿 X 450.0
23 　山西兴县孟家坪 柠条锦鸡儿 X 494.4
24 　内蒙古和林格尔 中间锦鸡儿 SX 417.6
25 　山西右玉 秦晋锦鸡儿 XM 443.0
26 　陕西横山 中间锦鸡儿 SX 478.4
27 　内蒙古准格尔旗 小叶锦鸡儿 X 401.5
28 　陕西神木 中间锦鸡儿 SX 441.2
29 　山西大同 柠条锦鸡儿 X 384.0
30 　山西兴县蔡家会 柠条锦鸡儿 X 494.4
　注:XM.旱中生;X.旱生;SX.沙生旱生。
　Notes:XM.Xero-mesophyte;X.Xerophyte;SX.Sandy xerophyte.
144　 华　北　农　学　报 24卷
1.2　试验方法
1.2.1　总 DNA 的提取 　种子发芽后取幼叶作为
DNA提取的材料 ,参照 CTAB[ 21]法 ,并略有改动。提
取缓冲液中含 0.35 mol/L 葡萄糖 , 0.1 mol/L Tris-
HCl ,5 mmol/L Na2EDTA , 2%PVP , 1%(V/ V)β-Me 。
裂解缓冲液中含 1.4 mol/L NaCl , 0.1 mol/L Tris-
HCl , 20 mmol/L Na2EDTA , 2% CTAB , 2% PVP , 1%
(V/ V)β-Me。最后将提取的 DNA 溶于适量的 TE
(pH 8.0)缓冲液中 ,于-70℃冰箱中保存。
1.2.2　DNA 的检测　取 10 μL 的 DNA 溶液 ,加水
至1 mL ,用北京 752型紫外分光光度计测定其 A260 ,
A280值 ,用A260的值计算 DNA的浓度 ,用 A260/A280的
值计算 DNA 的纯度。取 200 ng DNA 用 0.8%的琼
脂糖凝胶电泳测定 DNA的质量和 RNA的含量。
1.2.3　RAPD反应　PCR反应体系为25μL ,其中含
有10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3),50 mmol/L KCl ,2.0
mmol/L MgCl2 , 0.001% 明胶 , 4 种 dNTP 各含0.15
mmol/L , 60 ng 模板 DNA , 0.4 μmol/L 引物 , 1.0 μL
Taq酶 ,双蒸水补足 25 μL ,上覆 30 μL矿物油 。
PCR反应程序:94℃预变性 2 min;94℃变性 1
min ,36℃退火 2 min ,72℃延伸 2 min ,共 44个循环;
最后 , 72℃延伸 10 min , 4℃保温。反应完毕 ,取 20
μL扩增产物经 1.4%的琼脂糖电泳 ,胶中加入 0.5
μg/mL EB 。电泳结束后 , 紫外检测 ,凝胶成像分析
系统扫描照相。
每次试验均重复 2次 ,只有 2次重复均相同的
扩增带才被用作特征带分析。
1.2.4　数据分析　RAPD扩增产物以 0 ,1统计建立
数据矩阵。在相同迁移位置上有带记为 1 ,无带记
为0 ,使用 NTSYS-pc软件 ,计算遗传距离(GD),根据
UPGMA方法构建树状图。
2　结果与分析
2.1　RAPD扩增分析
本研究采用上海生工 S 系列的随机引物 ,从 40
个随机引物中筛选出 15个有效的随机引物 ,分别属
于上海生工S系列的 S3 、S5 、S11 、S13 、S18 、S19 、S20 、
S22 、S23 、S26 、S27 、S34 、S35 、S116 、S117。这 15个引
物对 30 个材料均有扩增产物 ,总共扩增出 87条
DNA带 ,其中 74条具有多态性 ,占 84.1%。引物不
同扩增的片段数也不同(表 2),平均每个引物可扩
增出 5.8条 DNA带。从表 2可以看出 ,不同引物扩
增出的 DNA 带差异极大 , 最多的可扩出 10 条带
(S27),最少的仅有 2条(S116),而且多态性也不同 ,
多态性带所占比例变化幅度也大 。15 个引物对 30
个柠条品种均表现出多态性 ,反映了不同品种的柠
条有丰富的遗传多样性 。扩增结果如图1所示。
图 1　用引物 S34扩增得到的 RAPD 图谱
Fig.1　Profile amplified by RAPD primer S34
表 2　15 个引物对 30份柠条种质资源 DNA扩增的带数
Tab.2　The total number of polymorphic bands
for the 30 materials amplified by 15 RAPD primers
引物
Primers
引物序列
Sequences
扩增带
Total
bands
多态带
Scorable
polymorphic bands
S3 CATCCCCCTG 8 8
S5 TGCGCCCTTC 8 6
S11 GTAGACCCGT 4 4
S13 TTCCCCCGCT 3 3
S18 CCACAGCAGT 5 4
S19 ACCCCCGAAG 6 5
S20 GGACCCTTAC 4 4
S22 TGCCGAGCTG 7 6
S23 AGTCAGCCAC 4 4
S26 GGTCCCTGAC 5 3
S27 GAAACGGGTG 10 9
S34 TCTGTGCTGC 8 7
S35 TTCGGAACCC 6 5
S116 TCTCAGCTGG 2 2
S117 CACTCTCCTC 4 4
2.2　聚类分析
根据 15个随机引物所检测出的 87 个基因位
点 ,以此遗传信息为基础 ,计算出不同地理生态类群
的 30个个体间的遗传距离(表 3)。依据遗传距离 ,
采用 UPGMA法进行聚类分析 ,得到树状分支图(图
2)。从图 2看出 ,在相似系数 0.71处可将 30 份材
料明显划分为 4大类:Ⅰ .中间锦鸡儿材料区 , Ⅱ.小
叶锦鸡儿材料区 , Ⅲ.柠条锦鸡儿材料区和Ⅳ.秦晋
锦鸡儿材料区 。
Ⅰ.中间锦鸡儿材料区:包括 9 份中间锦鸡儿
(1 ,28 ,16 ,26 , 17 ,4 , 24 , 6 ,19)和 4份小叶锦鸡儿(8 ,
10 ,20 ,27)材料 ,该类型以沙生旱生灌木中间锦鸡儿
为主 ,植物区系的地理成分属典型的戈壁-蒙古成
分 ,主要分布于干草原和荒漠草原地带 ,为适应该地
带气候干旱多风沙的恶劣生境 ,中间锦鸡儿形成了
具刺 、落叶 、沙生旱生灌木等明显的旱生结构和形态
特征 。
Ⅱ.小叶锦鸡儿材料区:包括 7份小叶锦鸡儿
1期 段永红等:锦鸡儿属植物遗传多样性的 RAPD分析 145　
146　 华　北　农　学　报 24卷
(2 ,14 ,7 ,22 ,5 , 18 ,15)材料 ,该类型由旱生灌木小叶
锦鸡儿组成 ,植物区系的地理成分典型的达乌里-蒙
古成分 ,主要分布于典型草原地带 ,为适应该地带气
候干旱少雨的生境 ,小叶锦鸡儿形成了具刺 、小叶 、
旱生灌木等明显的旱生结构和形态特征 。
Ⅲ.柠条锦鸡儿材料区:包括 6份柠条锦鸡儿
(3 ,29 ,30 , 21 , 23 , 12)材料 ,该类型主要由旱生高大
灌木柠条锦鸡儿组成 ,植物区系的地理成分属典型
温带亚洲成分 ,主要分布于半干旱草原地带。
Ⅳ.秦晋锦鸡儿材料区:包括 4份秦晋锦鸡儿
(9 , 11 ,13 , 25)材料 ,该类型主要由旱中生灌木秦晋
锦鸡儿组成 ,植物区系的地理成分属典型温带亚洲
成分 ,主要分布于森林草原和半干旱草原地带 。
图 2　柠条不同地理生态类群的聚类图
Fig.2　Dendrogram generated
by UPGMA method using RAPD
从30份材料的聚类分析可见 ,物种的地理分布
并不完全由植物本身特征决定 ,也与各自生活的生
态环境有关[ 22] 。在适者生存的自然选择下 ,各种适
应当地自然环境的类型逐步演化成各个生态类群 。
中间锦鸡儿 、小叶锦鸡儿和柠条锦鸡儿这 3种锦鸡
儿属植物聚为一类 ,形成了自己典型的生态类群 ,说
明这 3 种锦鸡儿属植物的亲缘关系较近。长期以
来 ,人们对这 3种锦鸡儿属植物在分类学上的地位
一直存在着较大的分歧。贾丽等[ 23]从解剖学的角
度认为中间锦鸡儿绝非小叶锦鸡儿和柠条锦鸡儿的
杂交种 ,而是一个完全独立的种;徐朗然等[ 9] 通过
杂交试验认为中间锦鸡儿应该是柠条锦鸡儿的一个
亚种[ 9] 。通过本试验我们进一步证实这 3种锦鸡儿
属植物种间差异不大 ,有较近的亲缘关系。这 3种
锦鸡儿属植物是属于同一种还是不同的种 ,还需要
应用多种检测方法进行遗传分析 ,还需要将分子标
记的研究结果与形态学和其他方法结合起来。本试
验同时也发现 ,秦晋锦鸡儿与它们的亲缘关系较远 ,
但由于选取的秦晋锦鸡儿材料较少 ,这尚待进一步
的研究证实。从聚类结果也反映出品种间关系与地
理起源有一定的相关性 ,中间锦鸡儿 、小叶锦鸡儿和
柠条锦鸡儿这 3种锦鸡儿植物的分布是地带性的分
布 ,各自分别在一定的植被生态区域出现[ 24] ,这从
分子水平上验证了吴征镒先生[ 25]关于“灌木状的锦
鸡儿属 Caragana 为典型温带亚洲分布 ,其乔木状种
最原始 ,可能源于阿尔泰-萨扬岭和秦岭 ,但可向草
原荒漠和高原草原扩散的观点”。
3　讨论
目前 ,由于对锦鸡儿属植物的遗传背景 、亲缘关
系没有系统的研究和记载 ,尽管人们应用形态学 、细
胞学手段分析了柠条锦鸡儿的遗传多样性 ,但这些
手段所含的信息较少 ,而生化标记技术的应用能很
好地分析柠条的遗传多样性 ,魏伟等[ 26]用 RAPD 标
记对柠条群体遗传多样性进行分析 ,确定了柠条群
体及种间存在基因流动;马成仓等[ 27]用RAPD技术
对柠条锦鸡儿 、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿种群遗传
结构进行了分析 ,发现 3个种在内蒙古高原自东向
西形成一个地理连续渐变群;宋俊双等[ 28] 用 ISSR
技术对柠条锦鸡儿 、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿种群
遗传多样性进行分析 ,指出 3个物种分子水平的遗
传多样性比较丰富 ,种间差异不大 ,亲缘关系较近 ,
难以明确区分 。本研究采用 RAPD技术对不同产地
的 30个柠条基因组 DNA进行多态性分析 ,构建了
聚类分析图 ,粗略分析了它们之间的亲缘关系 ,中间
锦鸡儿 、小叶锦鸡儿和柠条锦鸡儿亲缘关系较近 ,与
秦晋锦鸡儿亲缘关系较远;指出品种间关系与地理
起源有一定的相关性。尽管运用试验手段不同 ,但
是结论还是相近的 ,希望本研究能为柠条品种资源
的有效利用在分子水平上提供一些参考。
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