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遗传育种 牛属遗传多样性及种间的遗传分化
研究进展 (下 )
涂正超 　邱 怀
(西北农业大学动物科学系　陕西杨陵　 712100)
4　牛种间的 mtDN A遗传分化
线粒体 DN A( m tDNA)为核外遗传物质 ,以母
系遗传方式遗传 ,序列简单 ,核苷酸岐异度大 ,在种
间、近缘种间具有丰富的遗传多样性。 作为一种遗
传标记在研究家畜的起源进化、亲缘关系、畜群的
群体遗传结构、考察地方品种资源具有一定的意
义。
Ander son等 ( 1982)测定了牛的 mtDN A全序
列长度为 16338bp.近 10年来 ,关于牛的 mtDN A
多态性研究已做了很多工作 ,已用 AatⅠ 、 ApaⅠ 、
Ava Ⅰ 、 AvaⅡ 、 Bam HⅠ 、 Bg1Ⅰ 、 Bg1Ⅱ 、 DraⅠ 、
Eco RⅠ 、 Eco RV、 HindⅢ 、 HpaⅠ 、 KpnⅠ 、 MluⅠ 、
MspⅠ 、 PstⅠ 、 PvuⅡ 、 SacⅠ 、 ScaⅠ 、 SmaⅠ 、 StuⅠ 、
StyⅠ 、 TaqⅠ 、 XbaⅠ 、 XhoⅠ 等内切酶进行分析。其
中发现 AvaⅡ 、 Bam HI、 Bg lⅡ 、 Eco RⅠ 、 HindⅢ 、
HpaⅠ 、 KpnⅠ 、 M spⅠ 、 PstⅠ 、 SacⅠ 、 ScaⅠ 、 Tap
Ⅰ 、 StyⅠ 等内切酶图谱具有多态性。 m tDNA多态
性除了通过限制性内切酶酶切来检测外 ,还可以通
过 PCR扩增后再用内切酶酶切分析查找更丰富的
多态性。 Suzuki ( 1993 )设计了 D-loop 引物和
M TND5 引物来 扩增 牛的 mtDN A D-loop 和
N ADH脱氢酶 5基团 ,用 16种内切酶检测其多态
性 ,发现了 5个多态性位点位于 D-1oop内 ,另一多
态性位点位于 N ADH5脱氢酶内。用这种方法检测
mt DNA多态性取样方便 ,只需少量的血样就可以
了 ,同时操作简单 ,而且很经济。 mtDN A多态性最
直接的方法就是进行序列分析 ,一般衡量近缘种 、
亚种或种内 mt DNA的多态性可测定 D-loop的序
列 ,因其进化速度较快。 衡量种属以上的 mtDN A
多态性可测定 cy to. c、 cy to、 b、 tRN A等基因序列 ,
因其比较保守。另外还有一种检测 mtDN A多态性
的 方 法 是 单 链 构 象 多 态 性 ( single str and
confo rma tion po lymo rphism, SSCP ) , 就 是 将
m tDNA部分序列进行 PC R扩增后的产物变性后
经过聚丙烯酰氨凝胶电泳可检测其多态。 这方面
在马的 m tDN A研究中已有报道 ,牛的还未见报
道。 不过这种检测方法用来衡量群体的遗传多样
性程度较为有限 ,它用于检测同一母系的 mt DNA
突变将具有一定的意义。
由于 mtDN A以母系遗传方式遗传 ,不发生基
因重组等 ,它的变异能够反映其历史特征 ,所以
m tDNA的多态性可作为衡量不同牛种的起源与
分化的有力工具。 Lo ftus( 1994)用 7种内切酶分析
了欧洲、非洲和印度 13个不同的牛品种 ,发现了
16个不同的 mt DNA限制性类型 ( M ito types) ,表
现为两个主要血统:非欧型和亚洲型。 并计算出这
两个血统分化的时间在 575 000至 1 150 000年之
前 ,有力地证明了亚洲瘤牛为一个独立的驯养牛
种。这与 Baker和 Manw ell( 1980)用同工酶多态性
证明印度牛和欧洲牛具有显著的差别是一致的。
Lo ftus( 1994)同时测定了 6个欧洲牛品种、 3个印
度牛品种和 4个非洲牛品种的 D-loop的 375bp高
变区序列 ,同样发现存在非欧型和亚洲型 2个血
统 ,按照分子钟理论计算出至少在 200 000年前这
2个血统的牛就发生了分化。根据其核苷酸岐异度
推测这两种类型的牛可能是欧洲野牛的两个不同
亚种独立驯养而成。 Kikkaw a等 ( 1995)用 10种内
切酶分析了东亚和东南亚 170个个体包括 3种主
要家牛: 欧洲牛、瘤牛、巴厘牛的 m tDN A、 RFLP,
发现在欧洲牛和瘤牛之间有 51对碱基的差异 ,而
在欧洲牛和巴厘牛之间有 91对碱基差异 ,并由此
推测家牛的祖先在 3百万年前首先分化巴厘牛和
11998年第 24卷第 1期　　　　　　　黄　牛　杂　志　　　　　　　　　　　　　　
现在复旦大学遗传所工作
欧洲牛及瘤牛 2个血统 ,后者在 1百万年前又分化
为欧洲牛及瘤牛。兰宏等 ( 1993)通过对大额牛 (Bos
f rontalis)的 m tDNA多态性研究发现 ,大额牛的限
制性内型与瘤牛的相同 ,认为大额牛的起源与瘤牛
有密切的关系。
Po lzieh n等 ( 1995)分析了 269头美洲野牛
(Bison Bison )的 D-loop序列 ,发现在美洲野牛内
部 m tDN A单倍型间有 2. 2%的核苷酸序列变异 ,
野牛和牛的全序列 D环区比较存在 11. 8%的核苷
酸序列差异。
mt DNA以母系遗传方式遗传 ,在不同的
mt DNA类型之间没有重组 ,当群体杂交以后核基
因组出现混合不能保持群体结构的原有特征 ,而
mt DNA仍然保持原有的群体遗传特征。这对追溯
地方牛品种的形成、起源具有重要的意义。
Watanade ( 1985)用 7种限制性内切酶分析了 4头
日本黑牛、 3头日本短角牛和 6头荷斯坦牛 ,发现
每一品种内都存在不同的类型 ,说明这与它们的血
统来源比较复杂。 Watanabe( 1989)又用 6种内切
酶分析了 9头菲律宾土著牛种 ,发现存在两种类
型 , 5头牛为限制性类型 A型 ,定为菲律宾 1型 ,另
外 4头为限制性类型 B型 ,定为菲律宾Ⅱ型。由此
证明了菲律宾土著牛种含有欧洲牛和印度牛的血
液。
Miyamoto等 ( 1989)在构建牛科部分牛种的分
子系统进化树时 ,测定了 mt DNA 2 726bp的保守
区域 (包括 SRN A和 3个两侧的 t RN A基因序列 )
和 247bp的 D-loop高变区 ,发现野牛和牦牛、普通
牛的保守区核苷酸岐异度百分比分别为 2. 6% 、
3. 9%。 牦牛和普通牛的保守区核苷酸岐异度为
4. 1% ,在 D-loop内 ,野牛和普通牛、牦牛的核苷酸
歧异度均为 9. 1% ,牦牛和普通牛的核苷酸岐异度
为 9. 5%。 并用似然法进行聚类 ,下图是其中的聚
类图之一 ,并得出牦牛与野牛更接近而比普通牛较
远。
图 4　牛种的 m tDN sRNA和
t RN A序列变异聚类图
图 5　牛种的 mtDN的 D-loop序列
变异聚类图
注: 3. 牦牛 ; 4. 普通牛 ; 6.美洲野牛 ; 8. 水牛 ; 10. 长颈鹿 ; 11.野猪
　　以上 2个聚类图中 ,只用牛属牦牛、野牛、普通
牛 3个牛种 , 2种聚类图是一致的 ,体现出牦牛和
野牛的关系较近 ,然后才和普通牛相聚在一起 ,这
结果和 Groves( 1981)的头颅骨聚类相一致。
5　 RAPD技术与牛种的遗传多样性研究
RAPD技术是用寡核苷酸引物 ,在较低的退火
温度下对整个基因组 PCR随机扩增来检测 DN A
多态性的方法 ( W illiams et al, 1990)。 RAPD检测
出现多态的原理是: 当基因组中与引物互补位点发
生碱基突变 ,异致位点减少 ,或因碱基突变产生新
的互补位点 ,或者互补位点之间的 DNA序列发生
插入或缺失 ,均使扩增片段增长或长度发生变异 ,
从而出现多态。 因 RAPD技术需要 DN A模板量
少 ,取样方便 ,在不需知道 DNA任何序列的情况
下能够检测群体的多态性。 所以 , RAPD技术已成
功地应用于不同种动植物的遗传多样性研究
( Welsh et al, 1991; Baird et al, 1992; Chapco et
al, 1992)。
Kemp等 ( 1994)用 80个 10个碱基的引物通
2 遗　传　育　种
过 RAPD来分析瘤牛和普通牛的多态性标志 ,首
先检测达摩牛品种和波全牛 ,发现这 2个品种牛的
混合 DNA文库中 RAPD扩增时 ,有 1L0 526、 1L0
868和 1L0 8 76S3个引物 ,其中 1L0 526和 1L0
8762个引物在 Bo ran牛出现有特征的带 ,而达摩
牛则没有 ,然后用 1L0 526扩增 4个普通牛群体 ( 3
个 N` mama和 1个 Friesian)和 3个瘤牛群体 ( 1个
Bo ran, 1个 Maasa l瘤牛和 1个婆罗门牛群体 ) ,同
时也检测了 1个杂种牛群体 ( Ca ribbean Creole) ,
发现用 1L0 526引物扩增的 480bp带出现在含瘤
牛群体之中的牛 ,然后又与普通牛和瘤牛 RAPD
产物杂交 ,同样普通牛没有该带。
Gwakisa等 ( 1994)用 141对寡核苷酸引物 ,检
测坦桑尼亚本地 3个不同黄牛品种: 波仑牛 ,卡塔
卡尼短角瘤牛 ( TSZ)和 mpwapw a牛 (瘤牛和普通
牛杂种 ) ,每个品种取 30个个体的基因组 DNA混
合进行扩增 ,发现 1L0 1865和 1L0 1127两对引物
扩增具有品种特征。 可见 , RAPD多态性是牛品种
特征性的有用遗传标记。
RAPD技术分析物种或群体的遗传多样性不
是根据等位基因在不同物种的频率不同来衡量 ,它
虽然不能够确定带的杂合子 ,并且它的图谱比较难
于分析 ,但是它比同工酶更能检测到较为丰富的基
因组多态性 ,在种内不同群体间 (或品种间 )可靠性
较大 ,但在检测种以上的遗传差异时要慎重 ,因为
相同的带并不一定代表基因组同源序列。
6　牛属核糖体 DNA的遗传分化
核糖体 DNA包括一系列串联重复的序列 ,在
每一重复单位中含有 18S, 5. 8S, 28S核糖体基因
和它们周围的间隔区。 在这些不同区域内 ,其序列
进化速率是不同的 ,编码基因区域具有高度的保守
性 ,它的变异性可以用来估计生物界的基本进化树
( Hasegawa e t al, 1985) ,转录的间隔区具有中等
程度的保守性 ,可用业重建大约在 5千万年前分化
的物种树 ,非转录的间隔区进化速度比较快 ,在种
内和种间均存在变异。 ( Ranzxani et al, 1984;
Suzuki e t a l, 1986)。
Wall等 ( 1992)用核糖体 DN A探针和 15个内
切酶分析了牛科 14个种的 rDNA多态性 ,其中包
括牛属野牛 (美洲野牛 , Bison Bison;欧洲野牛 ,
Bison gaurus ) ,牦牛 ( Bos grunniens) ,牛曷牛 (Bos
gaurus ) ,巴厘牛 (Bos javanicus )、 普通牛 ( Bos
taurus ) ,瘤牛 (Bos indicus) ,共检测出 137个限制
性位点 ,其中有 27个座位没有发现有多态 ,这 27
个位点中 ,有 24个位点出现在高度保守的编码区 ,
其他位点均在牛种中表现有多态。 在牛属中 ,发现
美洲野牛和欧洲野牛有相同的图谱。 普通牛和瘤
牛也有相同的图谱。 用似然法对牛种不同种进行
了聚类分析 ,其中牛属几个种的聚类如图 6:
图 6　牛属核糖体 DNA限制性位点之数据聚类图
1. 牛曷牛 ; 2. 巴厘牛 ; 3.牦牛 ; 4.普通牛 ;
5. 欧洲野牛 ; 6.美洲野牛 ; 7. 瘤牛。
上图提示 ,巴厘牛和牛曷牛聚类较近 ,牦牛单独
聚为一类 ,野牛与普通牛和瘤牛的关系较近而和牦
牛关系较远 ,这与 Miyamo to ( 1989)的 mtDN A聚
类和 Groves( 1981)的头颅骨聚类相悖。
Amano等 ( 1994)在研究沼泽水牛和河流水牛
的 rDN A多态性时 ,同时比较了普通牛、山羊、绵
羊的 rDN A多态性 ,认为 rDNA RFLP在估计反刍
亚目的系统进化是一个很有用的工具。
综上所述 ,不同牛种无论在形态外貌、细胞遗
传学、血液蛋白多态性、核基因组以及核外基因组
等方面都存在一定的遗传差异 ,有些方面的研究只
阴于少数牛种 ,不能系统地反映种间的遗传分化关
系 ,特别是大额牛与其它牛种的起源与分化关系研
究的很少。 牦牛与其它牛种的起源与进化关系在
形态、头颅骨特征、血液蛋白多态性、m tDNA部分
序列分析、 rDN A RFLP分析等表现不一致。 从多
个座位来比较牦牛与其它牛种血液蛋白的多态性 ,
将有助于了解牦牛与其它牛种在核基因组上的分
化程度 ,用多个内切酶来检测牦牛 mtDN A限制性
片段长度多态性 ,将有助于了解 m tDN A整个基因
组的概况 ,与其它牛种比较将能够从核外基因组上
来反映牦牛与其它牛种的分化程度。
(参考文献略 )
31998年第 24卷第 1期　　　　　　　黄　牛　杂　志