全 文 ：2008 年 1 月　第 10 卷　第 1 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jan.2008　Vol.10　No.1
[ 通讯作者] 　＊袁丹 , Tel:(024)23986502 , E-mail:yuandan kampo@163.com。
S cience and techno logy
中药科技
茶属植物及茶多酚类成分对抗原诱导
RBL-2H3细胞过敏反应的抑制作用
王启隆 , 袁丹＊
(沈阳药科大学 ,辽宁 沈阳　110016)
[ 摘要] 目的:研究茶属植物及茶多酚类和嘌呤碱类成分对抗原刺激 RBL-2H3 细胞脱颗粒及肿瘤坏死因子α(TNF-
α)和白细胞介素 4(IL-4)释放的抑制作用。方法:测定 β-hexo saminida se的释放以评价脱颗粒反应的指标 , 酶联免疫吸
附法测定 TNF-α和 IL-4 的释放 , 评价茶中主要成分的抗过敏活性。结果:茶属植物均有抑制 RBL-2H 3 细胞脱颗粒作用 ,
其中花类表现出较叶类更强的抗过敏活性;EGCG 对抗原刺激的 RBL-2H 3 细胞即刻相(IC50 :234μmo l·L-1)和延缓相反
应(IL4 , IC50 :158μmo l·L-1), 及钙离子载体 A23187 诱导的脱颗粒反应均有抑制作用(IC50 :126μmol·L-1)。结论:茶
属植物和 EGCG 具有明显的抗过敏作用。
[ 关键词] 茶属植物;EGCG;RBL-2H3 细胞;脱颗粒;肿瘤因子α;白细胞介素 4
茶属植物在我国分布广泛 , 主要作为饮品服用 ,
其主要成分为茶多酚类和嘌呤碱类 , 具有中枢兴
奋[ 1] 、 抗氧化[ 2] 、 降血脂[ 3] 、 利尿等药理作用 。Ya-
mashi ta
[ 4] 报道了茶中的表儿茶素(EC)和表没食子儿
茶素没食子酸酯(EGCG)能抑制 RBL-2H3细胞受抗
原刺激诱发的组胺释放 , 且其中 EGCG 活性最强 。
日本蔬菜和茶叶研究所研究报道 , EGCG 甲基化衍
生物也具有抗过敏活性 , 但至今未见对茶属植物和
其中成分抗过敏活性的系统报道。
RBL-2H3细胞常作为肥大细胞体外模型进行化
合物筛选和机制研究 , 其过敏反应机理为特异性抗
原与靶细胞表面 IgE 分子结合而形成桥联反应 , 通
过酪氨酸激酶磷酸活化 , 刺激细胞内钙释放和外钙
离子内流 , 细胞内钙离子浓度增加至异常状态会进
一步导致细胞膜通透性增加 , 细胞骨架蛋白变化 ,
进而诱发细胞脱颗粒反应 , 也称为即刻相反应[ 5] 。
同时细胞还会合成细胞因子 , 如肿瘤坏死因子
(TNF-α)和白细胞介素 4(IL-4)等 , 释放后引起周
围组织和器官发生炎症反应 , 即为延缓相反应[ 6] 。
本研究采用该细胞模型考察了绿茶 Camel lia
sinensis 、山茶花 C.japonica 、阿萨姆茶 C.assam i 、
日本碾茶和茶树花对 RBL-2H3细胞脱颗粒反应的抑
制作用 , 并测定其中 5 种儿茶素类成分和 2 种嘌呤
碱成分(化学结构见图1)的抗过敏活性 , 为其在抗
过敏方面的合理应用提供药理学依据 。
化学结构 R1 R2
(-)-epicatechin(EC) H H
(-)-epicatechin gallate(ECG) H G
(-)-epig allocatechin(EGC) OH H
(-)-epig allocatechin gallate(EGCG) OH G
(+)-catechin(C) H H
图 1　儿茶素类和嘌呤碱类成分化学结构
1　仪器与试药
1.1仪器
细胞培养超净台(Show a Science 公司 , 日本),
Model 550酶联免疫检测仪(BIO-RAD公司 , 美国),
超声波细胞破碎仪(microsonTM Misonix 公司 ,美国)。
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DOI :10.13313/j.issn.1673-4890.2008.01.006
2008 年 1 月　第 10 卷　第 1 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jan.2008　Vol.10　No.1
1.2 试药
RBL-2H3 (Rat basophilic leukemia 2H3)细胞
株购于日本 Health Science Research Resources
Bank (No.JCRB0023);表儿茶素(EC)、 表没食子
儿茶素(EGC)、 表儿茶素没食子酸酯(ECG)、 表没
食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、 儿茶素(C)(フナ
コシ株式会社 , 日本), 咖啡因(caffeine , Caf)
(Aldrich Chem 公司 , 美国), 茶碱(theophy lline ,
The)(山东新华制药股份有限公司), 面积归一化
纯度均>95%;绿茶 、 茶树花 、 山茶花 、 碾茶 、 阿
萨姆茶由京都药科大学吉川雅之教授提供并鉴定 ,
取粗粉各 10g , 加甲醇 50mL 加热回流 1h , 提取 2
次 , 提取液冷冻干燥成干粉。
MEM 培 养基 、 免 疫 球蛋 白 E (Anti-DNP
IgE )、 p-Nitrophenyl-N-Acetyl-β-D-G lucosaminide
(PNAG)(Sigma公司 ,美国), 二硝基苯基化牛白蛋
白(DNP-BSA)(自制[ 7] ), 钙离子载体 A23187 (和
光纯药工业株式会社 ,日本), TNF-α和 IL-4 酶联
免疫吸附测定试剂盒(GE Healthcare公司 ,美国),
24孔 、 96孔细胞培养板(SUM ITOMO BAKELIT E
Co., 日本)。
Sirag anian 细胞培养液:119mmo l·L-1 NaCl 、
5mmol·L -1KCl 、 0.4mmol·L-1 MgCl2 、 25mmo l·
L
-1
PIPES 、 5.6mmol · L-1 g lucose 、 1mmo l · L-1
CaCl2 、 0.1%BSA 、 40mmo l·L -1NaOH , 加 1mo l·
L
-1
N aOH 溶液调节 pH 为 7.2;枸橼酸缓冲液:
0.1mol·L-1枸橼酸水溶液(C6 H 8 O 7·H 2 O)和
0.1mol·L-1枸橼酸钠(C6H5N a3O 7·2H 2O)水溶液混
合 , 调节 pH 为 4.5 ;碳酸钠缓冲液:0.1mol·L-1
碳酸氢钠水溶液(NaHCO3)和 0.1mo l·L-1碳酸钠
水溶液(Na2 CO 3)混合 , 调节 pH 为 10.0;PBS 溶
液 , NaCl 8g , Na2HPO 4·12H2O 2.9g , KC l 0.2g ,
KH2 PO 40.2g , 加超纯水溶解 , 定容至 1L;化合物 、
植物提取物溶解于含 1%DMSO 的 Sirag anian细胞
培养液中;其他试剂均为分析纯。
2　统计学处理方法
统计学处理数据用 x±s表示 , 组间比较采用单
因素方差分析(one-way ANOVA analy sis), 以P <
0.05为有显著性差异 。
3　方法与结果
3.1 茶属植物提取物对抗原刺激 RBL-2H3 细胞脱颗
粒的抑制作用
RBL-2H3细胞在含有体积分数为 10%的胎牛
血清 , 青霉素 1 ×105U·L-1及链霉素 1 ×105U·L-1
的 MEM 培养基中 , 37 ℃, 5 %CO 2条件下培养 。2
～ 3d换液传代 1 次 , 取生长状态良好的细胞以
5 ×108· L-1 密 度 接种 24 孔培 养 板上 , 每 孔
400μL , 分为 6 组:正常细胞组 , 过敏反应组 ,
过敏反应加样品小 、 中 、 大剂量组 , 全部释放
组 , 每组设 4个平行孔 。37 ℃培养 1h 后加入 IgE
(0.45mg·L-1)致敏 , 培养箱中培养 24h 后 , 用
Sirag anian 细胞培养液洗涤 2 次 , 洗液全部吸净
后 , 依次加入 160μL 培养液 、 20μL 样品溶液(正
常组和过敏组加含1%DMSO 的 Sirag anian 细胞培
养液)、 20μLDNP-BSA 抗原(终浓度为 10mg ·
L-1)或钙离子载体 A23187(终浓度为0.3μmo l·
L-1), 诱发抗原抗体反应 10min 后 , 放入冰盒中
终止反应 。转移 50μL 上清液(全部释放组的细胞
经超声破碎)至 96孔板 , 加入 50μL 溶解 1mmol·
L-1 PNAG 的枸橼酸溶液(枸橼酸溶液为空白对
照), 37 ℃反应 1h , 细胞脱颗粒反应释放的 β-
hexo sam inidase 可将 PN AG 水解为对硝基苯酚 ,
加 200μL 碳酸缓冲液显色 , 测定波长 405nm , 酶
联免疫检测仪上测定各孔吸光度值 。
样品对 RBL-2H3细胞释放 β-hexosaminidase 的
抑制率计算公式:抑制率(%)= [ 1 -(样品组吸光
度-空白组吸光度-正常组吸光度)/(过敏反应组吸
光度-正常组吸光度)] ×100%。
过敏反应组:抗原(+), 样品(-), PNAG
(+);样品组:抗原(+), 样品(+), PNAG(+);
正常细胞组:抗原(-), 样品(-), PNAG
(+);空白对照组:PNAG(-), 样品(+)。
IgE 致敏后的 RBL-2H3细胞 , 受抗原刺激发生
过敏反应 , 将储存在细胞颗粒中的炎症介质释放到
细胞外 , 引起周围组织和器官发生炎症 , 本实验选
用 β-hexosaminidase 的释放率作为评价细胞脱颗粒
反应的指标 , 结果见表 1。
由表 1可知 , 茶属植物均能抑制抗原刺激 RBL-
2H3细胞释放的 β-hexosaminidase , 与过敏反应组
相比有显著型差异 , 山茶花和茶树花提取物对抗原
刺激 RBL-2H3细胞脱颗粒抑制作用较叶类强 , 如绿
茶和阿萨姆茶 , 而日本碾茶活性最弱 , 曲尼斯特为
阳性对照。
3.2儿茶素类和嘌呤碱类成分对抗原或钙离子载体
A23187刺激 RBL-2H3细胞脱颗粒的抑制作用
结果见表 2 、表 3 。
·9·
2008 年 1 月　第 10 卷　第 1 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jan.2008　Vol.10　No.1
表 1　茶属植物对抗原刺激 RBL-2H3细胞脱颗粒的作用
名称 抵制率/ %
0μg·mL -1 30μg·mL -1 100μg·mL-1 200μg·mL -1300μg·mL-1 IC50/μm ol·L
-1
绿茶 0.0±3.5 2.2±4.3 22.6±2.4＊＊ 45.6±1.5＊＊ 59.1±1.8＊＊ 280
茶树花 0.0±2.3 5.9±2.2 45.6±0.7＊＊ 58.9±0.5＊＊ 69.7±2.5＊＊ 150
山茶花 0.0±5.7 6.9±3.2 37.6±6.9＊＊ 64.4±5.8＊＊ 89.6±4.7＊＊ 135
碾茶 0.0±0.6 1.8±6.2 14.1±1.0＊＊ 29.6±1.9＊＊ 43.8±2.5＊＊ >300
阿萨姆茶 0.0±2.5 -2.9±1.6　 17.2±3.7＊＊ 51.9±3.7＊＊ 54.6±3.9＊＊ 232
曲尼斯特 0.0±1.7 22.4±2.5＊＊ 56.9±3.4＊＊ 75.0±0.6＊＊ 96.6±2.7＊＊ 92
　注:和过敏反应组相比 , ＊P <0.05 , ＊＊P<0.01。
表 2　儿茶素类和嘌呤碱类成分对抗原刺激 RBL-2H3 细胞脱颗粒的作用
名称 抵制率/ %
0μmol·L-1 100μmol·L -1 200μmol·L-1 300μmol·L -1 IC50/μmol·L -1
EGCG 0.0±3.7 18.9±4.4＊＊ 40.6±4.2＊＊ 60.5±2.5＊＊ 234
C 0.0±2.8 2.0±2.0 - 20.5±3.2＊＊ >300
EC 0.0±1.4 3.0±1.0 - 18.5±5.2＊＊ >300
ECG 0.0±1.4 3.3±1.3 - 42.9±4.3＊＊ >300
EGC 0.0±1.4 3.5±1.9 - 20.9±2.2＊＊ >300
Caf 0.0±3.4 14.5±3.8＊ - 33.1±2.2＊＊ >300
The 0.0±2.8 2.5±1.9 - 32.1±4.0＊＊ >300
　注:和过敏反应组相比 , ＊P <0.05 , ＊＊P<0.01
表 3　儿茶素类和嘌呤碱类成分对钙离子载体 A23187 刺激 RBL-2H3 细胞脱颗粒的作用
名称 抑制率/ %
0μmol·L-1 100μm ol·L -1 200μmol·L-1 300μmol·L -1 IC50/μmol·L -1
EGCG 0.0±1.2 39.6±1.3＊＊ 70.8±1.8＊＊ 86.9±0.8＊＊ 126
C 0.0±3.9 - - 24.7±4.1＊＊ >300
EC 0.0±2.8 - - 29.9±4.6＊＊ >300
ECG 0.0±2.8 - - 40.4±2.7＊＊ >300
EGC 0.0±2.8 - - 35.5±3.6＊＊ >300
Caf 0.0±0.5 - - 29.3±0.7＊＊ >300
The 0.0±1.7 - - 22.0±3.3＊＊ >300
　注:和过敏反应组相比 , ＊P <0.05 , ＊＊P<0.01
由表 2可知茶中主要成分儿茶素类和嘌呤碱类成
分在浓度为 300μmol·L-1时均对抗原刺激的 RBL-2H3
细胞脱颗粒有抑制作用 , 与过敏反应组比较有显著性
差异 , 其 中 EGCG 活 性最强 , 半 数抑 制率 为
234μmol·L-1 ;钙离子载体A23187能携带钙离子通过
细胞膜 , 促进钙离子内流 , 进而诱发 RBL-2H3细胞
脱颗粒。
由表 3可知茶中主要成分儿茶素类和嘌呤碱类
在浓度为 300μmol·L -1时均对钙离子载体 A23187
刺激的 RBL-2H3细胞脱颗粒有抑制作用 , 与过敏反
应组比较有显著型差异 , 其中 EGCG 半数抑制率为
126μmol·L-1 。
3.3 EGCG对抗原刺激 RBL-2H3 细胞合成并释放
TNF-α和 IL-4的抑制作用
取生长状态良好的 RBL-2H3细胞以 5×108·L-1
密度接种在 24孔板上 , 每孔 400μL , 分成 5组:正
常细胞组 , 过敏反应组 , 过敏反应加供试样品小 、
中 、大剂量组 , 每组设 3 ～ 4 个平行孔 , 37℃培养
1h 后加入 IgE抗体(0.45mg·L-1)致敏 , 培养箱中
培养 24h , 用 MEM 培养液清洗 2 次后 , 加 320μL
培养液 , 培养 10min , 再加 40μL 供试品溶液共培养
10min , 最后加 40μL DN P-BSA 抗原(最终浓度为
10mg·L-1), 诱发抗原抗体反应 4h 后 , 取 50μL 上
清液转移到 ELISA 试剂盒的 96 孔板中 , 按操作说
明依次添加试剂 , 最后在酶联免疫检测仪上 450nm
测定 。样品对 RBL-2H3细胞释放 TNF-α和 IL-4的
抑制率计算公式:抑制率(%)= [ 1 -(样品组吸光
度-正常组吸光度)/(过敏反应组吸光度-正常组吸
光度)] ×100%。
样品组:DNP-BSA(+), 样品(+);正常组:
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DNP-BSA(-), 样品(-);过敏反应组:DNP-
BSA(+), 样品(-)。测定结果见表 4 。
表 4　EGCG对 RBL-2H3 细胞释放 TNF-α和 IL-4 的抑制作用
名称
抑制率/ %
0
μm ol·L -1
100
μmol·L-1
200
μmol·L-1
300
μmol·L -1
IC 50/
μmol·L-1
T NF-α0.0±8.1-7.7±13.2　-0.6±5.1　20.8±9.6＊ >300
IL-4 0.0±3.4 31.5±1.2＊＊ 53.1±3.0＊＊ 84.3±0.3＊＊ 158
　注:和过敏反应组相比 , ＊P <0.05 , ＊＊P<0.01
RBL-2H3细胞受抗原刺激后 , 细胞因子基因过
量表达 , 细胞合成并释放 TNF-α和 IL-4等细胞因子
到细胞外 , 2 ～ 4h时细胞培养液中 TNF-α和 IL-4含
量最高且浓度保持稳定。ELISA 测定结果表明茶中
主要活性成分 EGCG 对抗原刺激的 RBL-2H3 细胞
释放 IL-4 有抑制作用 , 与对照组比较有显著型差
异 , 但对 TNF-α释放作用较弱。
4　讨论
超敏反应(hype rsensi tivity), 又称为变态反应
(allergy), 是指机体对某些抗原初次应答后 , 再次
接受相同抗原刺激时 , 发生的一种以机体生理功能
紊乱或组织损伤为主要表现的特异性免疫应答 。花
粉症 、支气管哮喘 、 荨麻疹 、 过敏性鼻炎 、 哮喘和
休克均属于 I 型超敏反应。现今 , 生活方式的改变
和环境污染严重使人类更容易受到呼吸过敏原的攻
击 , 导致过敏性疾病发生率逐年上升[ 8] 。在过敏性
疾病的治疗中因找不到致敏原 , 常使用抗组胺药进
行对症治疗以达到解除症状目的 , 但使用该类药物
有嗜睡 、 中枢镇静以及有可能诱发心脏问题等严重
的副作用 , 并且抗过敏药物多具有即时有效的特点 ,
出现过敏症状后人们习惯长期反复服用 , 这也增大
了诱发肝功能低下病人发生肝损伤的几率 。因此探
索开发出一种药效高又无明显毒副作用的抗过敏药
物是近年来药物学研究领域的热点 。
本研究采用肥大细胞体外模型实验研究茶属植
物及其化学成分抗过敏的活性 , 结果茶属植物均有
抑制 RBL-2H3细胞脱颗粒作用 , 且花类表现出较叶
类更强的抗过敏活性 , 如山茶花和茶树花的半数抑
制率均小于绿茶和阿萨姆茶 , 吉川教授对茶树花中
化学成分研究表明 , 其中除儿茶素类成分外还含有
较多的皂苷类成分 , 也具有抗过敏活性[ 9] 。茶属花
产量较大 , 且还未作为药用食品和商品买卖 , 价格
低廉 , 因此具有较大的开发价值。茶长期被人们服
用 , 安全性高 , 其中儿茶素类成分还有肝保护作
用[ 10] , 因此我们推测茶属植物提取物与抗过敏药物
联合服用能有效降低抗过敏药物的服用量 , 还可能
降低抗过敏药物的肝损伤几率。
Yamashita仅测定了两种儿茶素类成分的体外
抗过敏活性 , 但针对嘌呤碱类和其他儿茶素类成分
未见该方面报道 。本研究首次全面测定了茶中主成
分的抗过敏活性 , 各成分的浓度在 300μmol·L-1时
均对抗原刺激的 RBL-2H3细胞脱颗粒有抑制作用 ,
且 EGCG 活性最强 , EGCG 可抑制抗原刺激的
RBL-2H3细胞即刻相(IC50 :234μmol·L-1)以及钙
离子载体 A23187诱导的脱颗粒反应(IC50 :126μmo l
·L-1), 同时对抗原刺激 4h后释放的 I L-4 有较强的
抑制作用(IC50 :158μmo l·L-1), 作用机制可能与
EGCG 抑制钙离子超载引起的脱颗粒反应和细胞因
子释放 , 以及抑制 pp125FAK蛋白的酪氨酸磷酸化[ 4]
有关 , 该方面有待于今后进一步研究 。
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参 , 而镁 、锂 、 锰 、 钴 、 铜 、 钛等 6 种元素含量低
于紫花丹参。这也许是白花丹参和紫花丹参药理作
用不同的原因之一。
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(收稿日期　2007-07-15)
Determination and Comparative of Trace Elements in the Stem and Leaf of
Salvia mil tiorrhiza Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li and Salvia mil tiorrhiza bge
Zhang Ling , Cai Hongxin , Xia Zuo li
(Research Insti tute of L i fe Science , Taishan Medicine College , Taian　Shandong , 271000 , China)
[ Abstract] Objective:To dete rmine and compare the t race elements in the stem and leaf o f Salv ia m i lt i-
orrhiza Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li and S alvia mi l tiorrhiza bge.Methods:T race elements in the
stem and leaf of Salv ia mi lt iorrhiz a Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li and S alviam i ltiorrhiza bge w ere de-
termined w ith induct ive coupled plasma emission spect rome ter.The contents of t race elements w ere analyzed
and compared.Results:Contents of Fe , Zn , Sn , Cr , Cd , B , Ba , S r , V , Ni , Pb in the leaf of Salv ia mi lt ior-
rhiza Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li w ere highe r than tho se in the leaf of S alvia mi l tiorrhiza bge , and
contents of M g , Li , Mn , Co , Cu , Ti in the leaf of Salv ia mi lt iorrhiza Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li
were low er than those of Salv ia mi lt iorrhiz a bge.Contents of Ni , Sn , Li , Cu , Cd , Ti in the stem of the two
kinds of danshen w ere the same.The contents of Fe , Zn , Mn , C r , V in the stem of S alvia mi lt iorrhiza
Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li w ere highe r than those in Salv ia mi lt iorrhiza bge , and the stem of Salv ia
mi lt iorrhiza Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li contained some low er contents o f Pb , Mg , Co , B , Ba , S r ,
comparing wi th those in S alviam i lt iorrhiza bge.Conclusion:The tw o kinds of danshen bo th have impo rtant
pharmaceutical function , and the contents of partial t race elements in them were different.
[ Key words] S alvia m i ltiorrhiza Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li;Salv ia mi l tiorrhiza bge;Stem;
Leaf;Trace element
(上接第 11 页)
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(收稿日期　2007-07-03)
Inhibitory Effects of Tea Plants and Catechins on Antigen-induced Allergic Reaction in RBL-2H3 Cells
Wang Qilong , Yuan Dan
(Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , S henyang Liaoning 110016 , China)
[ Abstract] Objective:To investigate the ef fects of ext ract of tea plants , catechins and purine bases on de-
g ranulation and releases of TNF-αand IL-4 in rat basophilic leukemia (RBL-2H3)cells induced by ant igen.
Methods:To determine the release of β-hexosaminidase , as a marker of degranulat ion , and to examine releases
of TNF-αand IL-4 by ELISA .Results:Tea plants inhibited the degranula tion in RBL-2H3 cell , and ext ract of
tea f low er show ed more potent activi ty than that of leaf.EGCG executed inhibitory activity on deg ranulation
(IC50 :234μmo l·L-1) and releases of IL-4 (IC50 :158μmo l·L -1)induced by antig en or calcium ionophore
A23187 (IC50 :126μmol·L-1).Conclusion:Tea plants and EGCG have signif icantly antiallergic activit ies.
[ Key words] Tea plant ;EGCG ;RBL-2H3 cel l;Deg ranulation;TNF-α;IL-4
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