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Vol． 34 No． 5
520 ～ 524
分 析 试 验 室
Chinese Journal of Analysis Laboratory
2015 年 5 月
第 34 卷 第 5 期
收稿日期:2014-12-20
基金项目:国家自然科学基金(21405075)、福建省工业科技计划重点项目(2014H0040)、福建省自然科学基金
(2013J01052)、福建省中青年教师教育科研项目(JA14248，JA14257)和闽江学院科技育苗项目
(YKY13013)资助
E-mail:fjcyt@ foxmail． com
DOI:10. 13595 / j． cnki． issn1000-0720. 2015. 0115
苋菜红的解离常数及与 BSA 的相互作用
陈毅挺* ，黄 露，李艳霞，林 棋，赵晓虹
(闽江学院化学与化学工程系，福州 350108)
摘 要:利用紫外光谱法和荧光光谱法研究了苋菜红的解离常数及其与牛血清
白蛋白( BSA) 的结合行为。应用荧光猝灭现象和 Frster理论，考察了不同环境
温度和酸度下苋菜红与牛血清白蛋白的结合常数和结合位点，并对其热力学常
数进行了研究。苋菜红的解离常数 pKa 为 10. 43，与牛血清白蛋白间主要存在
的是疏水作用和静电作用，二者间的结合距离为 3. 83 nm。结合过程中静态猝
灭和非辐射能量转移是导致牛血清白蛋白荧光猝灭的原因。通过同步荧光光谱
和荧光探针技术证明与苋菜红作用后的 BSA 分子二级结构发生了变化，苋菜红
与其在亚结构域 IIA( Site I) 发生了结合。研究结果将为苋菜红在环境和生物体
内的吸收、分布、代谢等行为的探索提供一定的理论基础。
关键词:苋菜红;牛血清白蛋白;解离常数;结合常数;相互作用
中图分类号:O657. 3 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(2015)05-0520-05
苋菜红(AT)常用于物品，特别是食品的染色
和着色［1］，随着各行业的发展，AT 进入环境的数
量不可忽视。而研究显示，AT 可能导致生育力
下降，并具有致癌、致畸性。解离常数(pKa)影响
了 AT在环境中的溶解度、存在形态等，开展苋菜
红 pKa 的研究，有助于了解 AT 在环境以及生物
体内的存在状态［2］。血清白蛋白是血浆中最丰
富的载体蛋白，通过研究它与 AT 的相互作用可
以探索 AT 在体内蓄积、代谢、排泄和危害机理。
因此，对 AT 的解离常数及其与 BSA 的结合过程
进行研究，有助于阐明该物质在生物体内的作用
机制。
目前可用于分子解离常数和相互作用分析的
方法有平衡透析法［3］、色谱法［4］、毛细管电泳
法［5］、纸电泳法［6］、吸收光谱法［7］、荧光光谱
法［8，9］、电化学法［10］、原子力显微镜法［11］等。蔡雪
梅等［12］曾利用荧光光谱法研究过 AT和 BSA 的结
合常数等。本文应用紫外可见分光光度法和荧光
光谱法研究了 AT 的解离常数及其与 BSA 的结合
行为。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
F-280 型荧光分光光度计(天津港东公司);
UV-2450 型双光束紫外可见分光光度计(日本岛津
公司);pH 700 酸度计(新加坡优特公司);SYC 智
能超级恒温水槽(巩义市予华公司)。
苋菜红(上海晶纯试剂公司);牛血清白蛋白
(生化试剂，国药集团化学试剂公司);布洛芬(对
照品)、酮洛芬(对照品)(中国食品药品检定研究
院);洋地黄毒甙(百灵威公司);三羟甲基氨基甲
烷(天津福晨化学试剂厂)。所有试剂未注明的均
为分析纯，实验用水为去离子水。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 解离常数测定 取 14 只 10 mL的容量瓶，
各加 入 1. 0 mL Tris-AT 储 备 液 (c (AT) =
4. 20 × 10 －5mol /L)，并分别用 pH 1. 0 ～ 14. 0 的三
(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲溶液(Tris-HCl 溶液)
定容，将其放置 30 min 后，以空白为参比，扫描各
AT溶液的吸收谱图。
1. 2. 2 相互作用分析 配制不同比例的 BSA-AT
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第 5 期 陈毅挺等:苋菜红的解离常数及与 BSA的相互作用
的 Tris-HCl溶液，在指定温度下恒温 30 min。以
284 nm为激发波长，扫描 300 ～ 450 nm 范围内各
溶液的荧光光谱。固定荧光发射和激发的波长差
分别为 15 nm和 60 nm，扫描同步荧光光谱。
2 结果与讨论
2. 1 苋菜红解离常数的测定
考查了 525 nm 处 AT 溶液的吸光度随 pH 变
化的情况，结果如图 1 所示。吸光度在不同的 pH
下，出现了 2 个平台，当 pH 1 ～ 10 时，最大吸光度
维持在 0. 310 左右;在 pH 10 ～ 11 时，出现了最大
吸光度随着 pH 的增大而减小的现象，当 pH ＞ 11
时，最大吸光度趋于稳定，维持在 0. 201 左右。在
不考虑离子强度的影响时，AT 的 pKa 可根据下式
求得:
pKa = － log［
AHA － A
A － AA－
］+ pH (1)
式中 AHA和 AA 分别为 AT 未发生电离和完全
电离时体系的吸光度，pH 为 AT 处于部分解离时
相对应的溶液的酸度，A 为 AT 发生部分电离时的
吸光度。因此，将 pH 10 ～ 11 时 AT 的吸光度代入
式(1)可得 AT的解离常数为 10. 43。
图 1 A-pH曲线
Fig. 1 A-pH curves
2. 2 苋菜红对 BSA的荧光猝灭效应
控制溶液温度为 19℃，pH 7. 2，以 284 nm 为
激发波长，测定了不同浓度的 AT与 BSA的荧光光
谱图，结果如图 2 所示。
由图 2 可知，随着 AT 的浓度的增加，BSA 荧
光强度呈现减弱的趋势，说明 AT与 BSA在相互作
用的过程中，形成复合物，改变了 BSA 的荧光活
性，使 BSA的荧光强度下降。荧光猝灭作用因猝
灭机制不同可分为动态猝灭与静态猝灭。在动态
猝灭过程中，蛋白质等荧光体与荧光猝灭剂分子间
的相 互 作 用 可 用 Stern-Volmer 方 程 式 进 行
描述［13］:
图 2 AT对 BSA荧光光谱的影响
Fig. 2 The fluorescence emission spectra of BSA
dependence on the concentration of AT
曲线 1→10:c(BSA)= 2. 1 × 10 －6 mol /L，c(AT)分别为 0，
2. 10 × 10 －6，4. 20 × 10 －6，6. 30 × 10 －6，8. 40 × 10 －6，1. 05 ×
10 －5，1. 26 × 10 －5，1. 47 × 10 －5，1. 68 × 10 －5，1. 89
× 10 －5 mol /L
F0
F = 1 + Kqτ0
[ ]Q (2)
式中 F0 与 F 分别为未加入和加入 AT 后 BSA
的荧光强度，τ0 为没有猝灭剂存在时荧光分子的平
均寿命，［Q］为猝灭剂浓度。在实验中所用的猝灭
剂的浓度为 BSA的 1 到 9 倍，因此可以用猝灭剂的
初始浓度代替其平衡浓度进行计算。将 F0 /F 对
［Q］作图，可由斜率求得 Kqτ0 ，由于生物大分子的
荧光平均寿命约为 10 －8s，故可得 AT对 BSA的动态
荧光猝灭速率常数 Kq 约为 1. 3 × 10
13 L /(mol·s)，
远大于生物大分子最大扩散碰撞猝灭速率常数 2. 0
×1010 L /(mol·s)［14］。因此，AT 对 BSA 体系的荧
光猝灭作用主要不是由于动态猝灭，而是与 BSA形
成复合物而引起的静态猝灭。
2. 3 结合参数的测定
对于静态猝灭过程而言，可以根据 Lineweaver-
Burk双对数方程获得 AT 与 BSA 的结合常数和结
合位点数:
lg F0
( )－ F[ ]F = lgKa + nlg[ ]Q (3)
式中 Ka 为结合反应的结合常数;n 为结合位点数。
选择了 19℃，22℃，32℃，42℃为结合环境温度，将
lg(F0 － F)/F对 lg［Q］作图，得到表 1。
由实验结果可见，不同温度下 AT和 BSA的结
合常数均较大，说明在不同温度下，AT 与 BSA 之
间均有较强的作用力，可以在体内被蛋白质所储
存、转运。在 19℃ ～42℃之间，结合常数和结合位
点随着温度的上升而减小，这与 AT对 BSA体系的
荧光猝灭作用主要是静态猝灭的情况相吻合。
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分 析 试 验 室 第 34 卷
表 1 不同温度双对数方程与结合常数、结合位点(pH 7. 2)
Tab. 1 Double logarithmic equation，the binding constants and the binding numbers at different temperature(pH 7. 2)
t /℃ 线性方程a 相关系数 R2
结合常数
K/(L /mol·s) 结合位点
19 lg［(F0-F)/F］= 1． 1050 × lg［Q］+ 5． 3291 0． 9933 2． 13 × 105 1． 1050
22 lg［(F0-F)/F］= 1． 0929 × lg［Q］+ 5． 3013 0． 9973 2． 00 × 105 1． 0929
32 lg［(F0-F)/F］= 1． 0943 × lg［Q］+ 5． 2551 0． 9954 1． 80 × 105 1． 0943
42 lg［(F0-F)/F］= 1． 0950 × lg［Q］+ 5． 1998 0． 9977 1． 58 × 105 1． 0950
a:［Q］/(mol /L)
控制结合环境温度为 22℃，考察了不同酸度
(pH 7. 2，8. 2，9. 0)下 AT 与 BSA 的结合情况。将
lg(F0 －F)/F对 lg［Q］作图，可得到表 2。实验结果
表明，当 pH ＜10时，AT与 BSA结合常数和结合位点
受到 pH的影响并不大。pH 11 时，结合常数则下降
明显，这可能有两个方面的原因，一是 AT 的 pKa 为
10. 43，此时 AT与 BSA所带均为负电荷，静电作用使
得结合常数下降;另一个原因可能是强碱溶液中的-
OH不利于 AT中的磺酸根与 BSA的结合。
2. 4 苋菜红与 BSA结合的热力学参数
根据 lnK = － (ΔH /RT)+ ΔS，以 lnK 对 1 /T
作图，由所得曲线的斜率和截距可以获得焓变 ΔH
与熵变 ΔS，进而根据方程 ΔG = － RT lnK = ΔH －
TΔS求得反应的自由能 ΔG，结果见表 3。
表 2 不同酸度下双对数方程与结合常数、结合位点(t = 22℃)
Tab. 2 Double logarithmic equation，the binding constants and the binding numbers at different pH(t = 22℃)
pH 线性方程 相关系数 R2
结合常数
K/(L /mol·s) 结合位点
7． 2 lg［(F0 － F)/F］= 1． 0929 × lg［Q］+ 5． 3013 0． 9973 2． 00 × 105 1． 0929
8． 2 lg［(F0 － F)/F］= 1． 1007 × lg［Q］+ 5． 2944 0． 9873 1． 97 × 105 1． 1007
9． 0 lg［(F0 － F)/F］= 1． 0372 × lg［Q］+ 4． 9904 0． 9990 9． 78 × 104 1． 0372
10． 0 lg［(F0 － F)/F］= 1． 0091 × lg［Q］+ 4． 8097 0． 9892 6． 45 × 104 1． 0091
11． 0 lg［(F0 － F)/F］= 0． 9937 × lg［Q］+ 4． 2028 0． 9801 1． 60 × 104 0． 9937
表 3 AT与 BSA结合的热力学常数
Tab. 3 The thermodynamic constants for of AT-BSA system
t /℃
ΔG /
(kJ·mol －1)
ΔS /
(J·mol －1·K －1)
ΔH /
(KJ·mol －1)
19
22
32
42
－ 29． 765
－ 29． 973
－ 30． 667
－ 31． 360
69． 344 － 9． 517
从表 3 中的热力学参数可见，各温度下反应的
吉布斯自由能 ΔG均小于零，说明 AT 与 BSA 的结
合可以自发进行。两者之间的作用类型则可以根
据焓变 ΔH与熵变 ΔS的大小来进行判断。由表 3
可知，ΔH ＜ 0，ΔS ＞ 0，且 ΔS对 ΔG的贡献明显大于
ΔH对 ΔG 的贡献，因此可以判断 AT 与 BSA 的结
合主要是依靠疏水作用力和静电作用力［15，16］。
2. 5 苋菜红与 BSA的结合距离
AT和蛋白质的物质的量为 1∶ 1 时 AT 的紫外
可见吸收光谱与 BSA的荧光光谱如图 3 所示，BSA
荧光发射光谱与 AT吸收光谱有一定程度的重叠。
图 3 BSA的荧光光谱和 AT的吸收光谱的重叠图
Fig. 3 Overlap spectra of BSA fluorescence spectra and
AT absorption spectra
c(BSA)= c(AT)= 2. 1 × 10 －6 mol /L
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第 5 期 陈毅挺等:苋菜红的解离常数及与 BSA的相互作用
通常情况下，为了求得物质与 BSA 的距离可
采用 Frster能量转移理论。根据该理论的基本原
理，结合距离越小越有利于 AT与 BSA的结合。
根据 Frster 理论，能力转移效率 E 和给体—
受体间的距离 r的关系为［17］:
E = 1 － FF0
=
R60
R60 + r( )
6 (4)
R60 = 8. 8 × 10
－25K2·n－4·Φ·J (5)
式中，E为实验条件下的能量转移率;R0 为能量转移
率 E在 50%的临界距离;K2 为偶极空间取向因子，
n为介质的折射指数，Φ为供体的荧光量子产率，J为
供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重合积分。在
上述实验条件下，K2 = 2 /3;Φ = 0. 15，n = 1. 366，而光
谱重叠部分的面积为 J =4. 05 ×10 －14cm3·L·mol －1，
可得临界距离 R0 =3. 22 nm，进而可求出 BSA中色氨
酸残基与 AT分子间的作用距离 r =3. 83 nm。当供体
荧光谱和受体吸收谱之间有足够重叠且两者之间距
离不超过 7 nm时，会发生非辐射能量转移，导致供体
荧光猝灭［18］，因此实验结果表明AT与 BSA作用过程
中发生了非辐射能量转移。同时，由于结合距离 r大
于临界距离 R0，说明非辐射能量转移引起荧光猝灭的
概率比静态猝灭要小［19］。
2. 6 同步荧光光谱
蛋白质分子的内源荧光色色团的普通荧光光
谱发射峰严重重叠，而用同步荧光光谱则可以将其
区分开来。固定 Δλ = 15 nm和 60 nm 的同步荧光
分别表现蛋白质中酪氨酸残基和色氨酸残基的特
征荧光［20］，结果如图 4 所示。
图 4 BSA-AT体系的同步荧光光谱
Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of BSA-AT．
(A)Δλ = 15 nm;(B)Δλ = 60 nm ;c(BSA)= 2. 1 × 10 －6 mol /L;曲线 1→9，c(AT)= 0，2. 10 × 10 －6，4. 20 × 10 －6，6. 30 ×
10 －6，8. 40 × 10 －6，1. 05 × 10 －5，1. 26 × 10 －5，1. 47 × 10 －5，1. 68 × 10 －5 mol /L
由图 4可见，在相同条件下，BSA中色氨酸残基
的荧光强度约为酪氨酸残基荧光强度的 5 倍左右，
说明 BSA的荧光主要是由于色氨酸残基的特征荧
光［21］。而 AT对 BSA的酪氨酸残基和色氨酸残基
的荧光均有猝灭现象，相同浓度的 AT 导致 BSA 的
酪氨酸残基和色氨酸残基同步荧光的猝灭程度分别
为 57%和 77%，表明 AT分子可以进入 BSA的立体
结构中，不但可以直接猝灭色氨酸残基的荧光，还能
阻断酪氨酸和色氨酸之间的能量传递，表现为对酪
氨酸残基的荧光猝灭［21］。同时，随着 AT 浓度的增
加，Δλ =15 nm 的猝灭光谱波长略有蓝移，而 Δλ =
60 nm的光谱波长则有红移现象，说明与 AT作用后
的 BSA分子二级结构发生了变化，色氨酸残基所处
微环境极性增加，更多地暴露在亲水性环境，肽键的
伸展程度有所增加［22］，而酪氨酸残基的微环境疏水
性有所增加，BSA的结构变得紧密。
2. 7 结合位置的确定
选择酮洛芬、布洛芬、洋地黄毒苷作为 Site I，
Site II，Site III 的标记药物加入 AT-BSA 体系中。
以加入探针前后的相对荧光强度对探针的浓度作
图，得到图 5。
图 5 标记探针对 BSA-AT体系的荧光强度影响
Fig. 5 Effect of site maker probe on the fluorescence of
BSA-AT
c(BSA)= 2. 0 × 10 －6 mol /L;c(AT)= 1. 0 × 10 －5 mol /L;
pH 7. 4;λex /λem = 284 /345 nm
由图 5 可见，加入布洛芬和洋地黄毒苷的 AT-
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分 析 试 验 室 第 34 卷
BSA体系的荧光强度并未发生明显变化，而加入
酮洛芬后，随着酮洛芬浓度的最大，AT-BSA 体系
的相对荧光强度明显下降。这说明酮洛芬置换了
与 BSA结合的 AT，即 AT 和 BSA 是在其亚结构域
IIA(Site I)发生了结合。
3 结论
在本文中主要选用荧光光谱法和紫外光谱法
对 AT的 pKa 及其与牛血清蛋白的结合机理进行
研究。AT 的解离常数为 10. 43，与 BSA 之间主要
是通过疏水作用和静电作用结合在 BSA 的亚结构
域 IIA(Site I)，引起了 BSA 分子二级结构发生了
变化，导致 BSA内源性荧光的降低，作用类型为静
态猝灭。此外，根据 Frster 能量转移理论计算得
到 AT与 BSA的结合距离为 3. 83 nm，表明 AT 与
BSA作用过程中发生了非辐射能量转移。该研究
将为从分子水平上了解苋菜红在环境以及生物体
内的存在、转运、代谢等提供重要信息。
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The amaranth dissociation and its interactions with bovine serum albumin
CHEN Yi-ting* ，HUANG Lu，LI Yan-xia，LIN Qi and ZHAO Xiao-hong(Chemistry and Chemical Engineering
Department of Minjiang University，Fuzhou 350108)，Fenxi Shiyanshi，2015，34(5):520 ～ 524
Abstract:In this thesis，the dissociation constant of amaranth(AT)and its combination with bovine serum
albumin(BSA)were studied by UV-visible spectrometry and fluorescence spectrometry． Based on the fluorescence
quenching of BSA and Frster energy transfer mechanism，the binding constant and binding site of AT with BSA
were investigated at different temperatures and acid values，and the thermodynamic constants were also studied．
The results showed that the dissociation constant of AT was 10. 43． The hydrophobic force and electrostatic force
played the main role in combination，and the binding distance was 3. 83 nm． In the binding process，the
fluorescence quenching of BSA was resulted from non-radiative energy transfer and static quenching． The secondary
structure of BSA molecules was changed after BAS binding with AT through IIA(Site I)，which could be confirmed
by synchronous fluorescence and the fluorescent probe technique． The study results would provide a certain
theoretical basis for the absorption，distribution，and metabolism of AT in the environment and in vivo．
Keywords:Amaranth;Bovine serum albumin;Dissociation constant;Binding constant;Interaction
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