全 文 ：新 疆 农 业 大 学 学 报　2009 ,32(6):8 ～ 11
Journal o f Xinj iang Agricultural University
文章编号:1007-8614(2009)06-0008-04
新疆紫草种子萌发过程中生理生化变化
龚德洲 , 林　杰 , 李翠芳 , 李信军 , 王　芳
(新疆农业大学 农学院 , 乌鲁木齐　830052)
摘　要:　测定了新疆紫草种子萌发过程中过氧化物酶(POD)活性及酚类物质含量的变化 , 考察了其对新疆紫草
种子萌发的影响。结果表明 ,新疆紫草种子在萌发过程中 ,随 POD 活性的增强 ,发芽率逐渐升高 , POD活性增强促
进新疆紫草种子的萌发。福林试剂与 10%Na2CO 3 之比为 2∶1(V∶V),反应温度为 25 ℃, 反应时间为 45 min , 体
积为 0.5～ 3.0 mL 时与其吸光度值呈良好的线性关系 ,建立了酚类物质的提取及测定方法。总酚含量随发芽进程
呈先降低后升高趋势 ,酚类物质的合成和积累抑制新疆紫草种子萌发。
关键词:　新疆紫草;过氧化物酶;酚类物质;种子萌发
中图分类号:Q949.777.4　　　　　　文献标识码:A　
The Physiological and Biochemical Changes of
Arnebia euchroma (Royle)Johnst Seed during Germination Process
GONG De-zhou , LIN Jie , LI Cui-fang , LI Xin-jun , WANG Fang
(Col lege of Ag riculture ,Xinjiang Ag ricultural University , Urumqi 830052 ,China)
Abstract:　This study dete rmined the course of seed germination of Arnebia euchroma in seed coat , em-
bryo Pe ro xidase(POD)activity and changes in polyphenol content , examined their impact on Arnebia eu-
chroma seed germinat ion.The resul ts show ed that the germinat ion percentage of seeds in Arnebia euchro-
ma (Roy le)Johnst gradually was increased w ith the rising o f POD activity during i ts germination process.
In the Folin reagent , the ratio o f nutgall acid to 10%N a2CO 3 was tw o to one (V∶V).When the reaction
temperature w as 25 ℃, react ion time w as 45 min.When the volume w as 0.5 ～ 3.0 mL , i ts absorbance value
w as a good linear relationship.The method for ext racting and determining phenolic substances w as estab-
li shed.In addi tion , the po lyphenol content f irst w as reduced then increased w ith the pro ceeding of germina-
tion.The synthesis and accumulation of phenolic substances inhibi ted the germination percentage of
Arnebia euchroma (Royle)Johns.
Key words:　Arnebia euchroma (Roy le)Johnst;pe ro xidase;phenolic substances;seed ge rmination
　　新疆紫草〔Arnebia euchroma(Roy le.)Johnst〕
为紫草科多年生草本植物 ,是我国传统药用紫草类
植物临床药效最好的一种 ,其主要成分为萘醌类色
素 ,具有抗生育 、抗炎 、抗肿瘤 、杀菌抗病毒和免疫调
节等药理作用 ,被广泛用于医药 、保健 、食品等行
业[ 1] 。目前关于种子萌发与 POD活性关系的研究
多有报道 , 一般认为 , 种子萌发与过氧化物酶
(POD)活性成正相关[ 2-5] ,但未见新疆紫草种子萌
发与 POD活性的报道 。关于种子萌发与酚类物质
含量的报道仅见于杨晓玲等的报道 ,认为晚采收的
山楂种子酚类物质含量高 ,酚类物质含量高抑制种
子萌发[ 6] 。关于新疆紫草种子及其萌发过程中有无
酚类物质 ,酚类物质在萌发过程中的变化如何 ,对种
子萌发有无影响均未见报道 。本研究对新疆紫草发
芽过程中酚类物质含量 、过氧化酶活性的变化以及
酚类物质在新疆紫草萌发中的作用进行了探讨 。
收稿日期:2009-09-07
基金项目:国家自然科学基金项目(30560059);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(200821170)
通讯作者:王　芳 , E-mail:Wangfang1hao@126.com
　第 6 期 龚德洲 , 等:新疆紫草种子萌发过程中生理生化变化
1　材料和方法
1.1　材 料
新疆紫草种子采自新疆温泉县 。
仪器:721分光光度计(上海光学仪器五厂),高
速冷冻离心机(德国 Beckman 公司),恒温水浴锅
(上海一恒科技有限公司),恒温培养箱(宁波江南仪
器厂)。
药品及试剂:愈创木酚(天津化学试剂研究所),
H 2O2(天津致远化学试剂有限公司),福林试剂(北
京鼎国生物科技有限公司), Na2HPO4 、N aH2 PO 4 、
Na2CO 3(天津市化学试剂三厂),没食子酸(天津市
光复精细化工研究所),无水乙醇(天津市化学试剂
三厂),三氯乙酸(上海化学试剂采购供应站),所用
药品均为分析纯 。
1.2　方 法
1.2.1　发芽试验
除去果壳 ,种子用 0.1%升汞表面消毒 5 min 。
消毒后用蒸馏水迅速冲净 ,冲洗过程中防止种子吸
水过度 ,冲洗 5次 ,然后将种子置于垫有 2层滤纸的
消毒培养皿中 ,加入等量的水湿润纸床。每个处理
3次重复 ,每个重复 50粒种子 ,于 25 ℃下暗培养 。
1.2.2　过氧化物酶活性测定
测定方法采用愈创木酚法[ 7] 。
种子置床后第 1天至第 3天 ,每天分别测定种
皮和种胚的过氧化物酶活性。第 5天后每两天测定
幼苗的过氧化物酶活性。
分别称取种皮 、种胚或幼苗各 0.5 g ,放入研钵
中 ,先倒入研钵 2 mL pH 6.0的磷酸盐缓冲液 ,研
磨成匀浆 ,将匀浆液全部转入离心管中 ,用少量缓冲
液清洗研钵 , 清 洗液一并倒入离心管中 , 以
4 000 r/min离心 10 min ,上清液转入25 mL 的容量
瓶中 ,定容至刻度 ,即为酶粗提液 ,低温保存 ,用于测
定活性。
反应混合液:取 0.1 mo l/L 磷酸缓冲液
(pH 6.0)50 mL 于烧杯中 ,加入 0.05 mol/ L 愈创
木酚 28 μL ,加热搅拌 ,反应温度 25 ℃,直至愈创木
酚溶解 ,待溶液冷却后 ,加入 30%过氧化氢 19 μL ,
混合均匀 ,保存在冰箱中 。
取比色杯 2只 ,在 1只中加入反应混合液 3 mL
及 0.02 mol/ L N a2HPO4 溶液 0.2 mL 作为校零对
照。另一只加入反应混合液 3 mL 及酶粗提液
0.2 mL ,立即记录时间 ,于 470 nm 下分光光度计测
定吸光度值 ,每隔 1 min 读数一次 , 共测定 5 min 。
以每分钟内 A470 变化 0.01为 1个酶活性单位(U)。
　　过氧化物酶活性= ■A470 ×V t
W ×Vs ×0.01 ×t
式中:■A470 为反应时间内吸光度的变化;W 为样
品鲜重(g);t为反应时间(min);V t 为提取酶液总
体积(mL);V s 为测定时取用酶液体积(mL)。
1.2.3　总酚的测定
参照朱广廉等[ 8] 方法。
没食子酸标准溶液(100 μg/mL)的配制:取没
食子酸粉末 0.1 g 完全溶解到 1 L蒸馏水中 ,备用 。
福林试剂与 10%Na2 CO 3 比例的确定:取
0.5 mL没食子酸标准溶液中加入 1 mL 福林试剂 ,7
～ 8 min后加入不同体积 10%Na2CO 3 溶液 ,25 ℃
条件下显色反应 1 h后定容至 10 mL ,以 Na2HPO 4
为校零对照 ,置于 765 nm 波长下测定吸光值。3次
重复 。
反应温度的确定:取 0.5 mL 没食子酸标准溶
液 ,加入 1 mL 福林试剂 , 7 ～ 8 min 后加入0.5 mL
10%Na2CO3 溶液 ,分别置于 5 , 20 , 25 , 35 , 45 ℃温
度 ,显色反应 1 h 后 ,定容至 8 mL ,置于 765 nm 波
长下测定吸光度值 。
稳定性检测:取 0.5 mL 没食子酸标准溶液 ,加
入 1 mL 福林试剂和0.5 mL 10%Na2CO 3 ,于25 ℃
条件下 , 经反应后定容 8 mL , 每隔 15 min 置于
765 nm波长下测定其吸光值 。
标准曲线的制作:按上述最佳条件组合 ,测定不
同体积(0.5 ～ 3.0 mL)的没食子酸的吸光度值。以
没食子酸的体积为横坐标 ,以平均吸光度值为纵坐
标 ,绘制标准曲线 。
样品总酚的提取及含量测定:在种子置床第 6
天 、第 9天 、第 12天 、第 15天 、第 18天 、第 20天时 ,
分别称取幼苗 1 g ,加入20 mL乙醇 、2 mL 10%三氯
乙酸 ,于研钵中匀浆 ,将匀浆液全部转入 50 mL 容
量瓶中 ,用 10%三氯乙酸洗涤研钵并定容至刻度。
静置 0.5 h ,用垫有滤纸的玻璃漏斗过滤 ,收集滤液
于试管中 ,3次重复。
吸取 0.5 mL 滤液 ,加入 1 mL 福林试剂 , 7 ～
8 min后加入 0.5 mL 10%Na2CO3 ,于 25 ℃条件
下 , 经显色反应 45 m in 后定容至 10 mL , 以
Na2HPO 4 为对照 ,置于 765 nm 波长下测定吸光度
值。3次重复 ,取平均吸光度值 。依据所测的平均
吸光度值 ,从标准曲线上查出总酚的体积(V)。
总酚含量(μg/g)=V ×P/W
式中:V 为标准曲线查得样品体积(mL);P 为没食
子酸标准品浓度(100 μg/mL);W 为样品鲜重(g)。
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新　疆　农　业　大　学　学　报 2009年　
2　结果与分析
2.1　新疆紫草种子发芽率的变化
置床后3 d种子处于吸水膨胀及萌动阶段 ,第 4
天后种子开始萌发 ,随时间的延长发芽率呈上升趋
势 ,至第 12天后发芽速率增速开始减缓 ,第 15天发
芽率达到峰值为 54%(图 1)。
图 1　新疆紫草种子发芽率的变化
Fig.1　The change of seed germination of Arnebia euchroma
(Royle)Johnst
2.2　种子萌发过程中种皮和种胚或幼苗POD活性
的变化
种子在置床后 3 d 内 ,种皮中的 POD 活性很
低 ,而且随着时间推移迅速降低。种胚的POD活性
则缓慢增加 ,此时种子处于吸水膨胀阶段 ,少部分种
子开始发芽;种子置床第 5 天开始 ,幼苗的 POD 活
性迅速增强 ,此时种子萌发也迅速增加;种子发芽至
第 15天时 POD活性达峰值 ,此时的发芽率也达峰
值;15 d 后 POD活性迅速下降 ,此时无新种子发芽
(图 2)。表明新疆紫草种子的发芽率是随着 POD
活性的变化而变化的 ,POD活性的提高有利于种子
的萌发。
图 2　新疆紫草种子萌发过程中种皮 、种胚或幼苗 POD 活
性的变化
Fig.2　The change of the seed coat and embryo and seed per-
oxidase(POD)activity of Arnebia euchroma (Royle)
Johnst during seed germination
2.3　福林试剂与 10%Na2 CO 3 比例的确定
体积比为 2∶1 时 ,吸光度值最大(图 3),说明
福林试剂与 10%Na2CO3 的比例为 2∶1 时显色反
应完全。
图 3　福林试剂与 10%Na2CO 3 比例的确定
Fig.3　The determination of ratio of Folin reagent and 10%
Na2CO3
2.4　反应温度的确定
在 25 ℃时吸光度值最大(图 4)。25 ℃应是测
定酚类物质含量的最佳温度 。
图 4　温度对吸光度值的影响
Fig.4　Ef fects of temperature on absorbance value
2.5　稳定性测验
取 0.5 mL 没食子酸标准溶液 ,加入 1 mL 福林
试剂和 0.5 mL 10%Na2CO 3 ,于 25 ℃条件下 ,经反
应后定容 ,每隔一定时间测定其吸光度值。图 5结
果表明 , 15 ～ 45 min 内吸光度值变化不明显 ,故可
认为在 15 ～ 45 min 内其吸光度值是稳定的。本试
验选取 45 min为显色反应时间 。
图 5　时间对吸光度值的影响
Fig.5　Ef fects of time on absorbance value
2.6　标准曲线
根据上述试验结果 , 即福林试剂与 10%
Na2CO3 比例为 2∶1 、显色反应时间为 45 min 、
25 ℃条件下 ,分别测定不同体积的没食子酸吸光度
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　第 6 期 龚德洲 , 等:新疆紫草种子萌发过程中生理生化变化
值 ,得到体积与吸光度值 A 的曲线。结果表明 ,没
食子酸在 0.5 ～ 3.0 mL 内与其吸光度值呈线性关
系 ,且在此范围内的线性回归方程为 y =0.0284x
+0.0998 ,相关系数为 0.9970。
2.7　总酚的含量变化
新疆紫草种子在萌发过程中总酚的含量呈降
低-升高-降低-升高 、一大一小双“V”形变化趋势(图
6)。种 子萌 发第 6 天 时 , 总 酚含 量较 高 为
322.1μg/g ,这与 POD活性较低相符合。萌发第 6
天至第 12天 ,总酚含量迅速下降 ,此阶段种子萌发
迅速 ,与POD活性迅速提高 ,酚类物质被氧化吻合 。
萌发第 15天至第 20天 ,总酚含量上升 ,此阶段种子
发芽率增速趋缓直至停止萌发 。表明发芽率与总酚
含量呈负相关 ,发芽后期 ,由于酚类物质再一次合成
和积累使得种子萌发受抑制 ,最终发芽率达 54%。
图 6　新疆紫草种子萌发过程中总酚的变化
Fig.6　Changes of total polyphenol of Arnebia euchroma seed
during germination process
3　结论与讨论
过氧化物酶(POD)是一类以过氧化氢为底物 ,
氧化其他化合物的氧化还原酶 ,它存在于植物从萌
发到衰老的整个生长发育过程 ,参与植物的生长素
代谢 ,细胞壁的生物合成 ,从而对植物的生长起到促
进作用[ 9] 。在种子萌发前期 ,酶活性普遍较小 ,表明
种子体内各种酶包括 POD都在积蓄着为种子的萌
发作准备 ,随着种子继续萌发 ,过氧化物酶活性逐渐
提高 ,从而促进种子萌发[ 2-5] 。因此在种子萌发过
程中普遍以过氧化物酶活性变化与发芽率关系作为
研究指标 。本研究表明 ,新疆紫草种子萌发初期 ,由
于 POD 活性较弱 , 因而种子发芽率较低 。随着
POD活性的增强 ,种子发芽率迅速提高 ,说明 POD
增强有利于种子的萌发 ,此研究结果与前人一致 。
一些酚类物质对植物生长发育有明显的调节作
用[ 10] 。多数研究表明 ,酚类物质能抑制植物种子的
萌发 ,主要原因是抑制了种子萌发所需的关键酶
类[ 6 , 11] 。本研究表明 ,新疆紫草种子萌发过程中 ,总
酚含量变化与发芽率呈负相关 ,表明新疆紫草中含
有抑制萌发的酚类物质 ,但酚类物质的组分及哪种
成分抑制萌发 ,酚类物质的代谢机制等有待进一步
研究 。
本研究结果表明 ,新疆紫草种子的萌发是 POD
与酚类物质相互作用的结果 ,种子萌发初期 ,由于
POD活性较弱 ,致使总酚的含量升高 ,因而种子发
芽率低。随着 POD活性的增强 ,总酚的含量迅速下
降 ,因此种子发芽率迅速提高。种子萌发后期 ,随着
POD活性的迅速下降 ,总酚的含量迅速上升 ,种子
发芽率趋缓或停止 ,笔者认为此时总酚的含量迅速
上升可能与幼苗的生长及其生态防御性能有关 。此
外 ,根据本研究结果 ,也可确定新疆紫草种子发芽的
时间以 12 ～ 15 d为宜 ,即初次计算发芽粒数为 6 d ,
末次计算发芽粒数为 12 d。
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