全 文 ：现代医药卫生 2012年6月30日 第28卷第12期 J Mod Med Health，June 30，2012，Vol.28，No.12
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有低
免疫原性、大量扩增能力以及多向分化能力的多能干细胞，被广
泛用于移植治疗心肌梗死、肝衰竭的研究。近年来 MSCs 的免疫
调节作用开始受到重视， 并开始应用于免疫相关疾病的治疗。
MSCs 可以延长同种异体皮肤移植狒狒的皮肤存活时间， 而在大
鼠的心脏移植模型中，MSCs 与低剂量的麦考酚酯也能够诱导移
植物的耐受[1]。2004 年，Le-Blanc 等[2]首次应用同种异体 MSCs 成功
的治疗了 1 例严重移植物抗宿主病患者。单独使用 MSCs 的免疫
调节效果似乎不如激素，联合其他免疫调节药是提高免疫调节作
用的有效途径。传统中草药中多种药物具有免疫调节作用，与 MSCs
可能产生免疫调节的协同增强作用。
青藤碱是青风藤中的主要生物碱。早在明代，李时珍在《本草
纲目》中记载“青风藤治风湿流注，历节鹤膝，损伤肿”。《本草汇
言》云：“青风藤，散风大建奇功”。《本草便读》谓：“此物善治风疾，
故一切历节麻痹皆治之”。青风藤性味苦平，能祛风湿，利小便，善
治风湿痹痛、鹤膝风等。青藤碱具有镇痛、镇静、抗炎、消肿、利尿、
降压、释放组胺、调节免疫等作用，是治疗风湿及类风湿关节炎的
有效药物。近年来，因为免疫抑制作用，青藤碱开始被用于器官移
植的免疫抑制治疗。青藤碱不仅可以抑制小鼠心脏和肝移植后的
移植排斥反应，而且与其他免疫调节药联合使用可以减少免疫调
节药的剂量和不良反应 [3-4]。大鼠肾移植试验中，青藤碱可减少环
孢素 A 及 FK506 的用量，从而减轻其对大鼠移植肾的不良反应[5-6]。
本文通过研究青藤碱和小鼠 BMMSCs 对混合淋巴反应中 T
·论 著·
基金项目：国家自然科学基金委员会资助项目（81173437）；广东省
中医药管理局资助项目（2008143）；广州中医药大学科研
创新基金资助项目（11CX068）；国家中医药管理局脾胃
消化病重点专科资助项目。
通讯作者：佘世锋（E-mail：sheshifeng@hotmail.com）。
青藤碱促进小鼠骨髓间充质干细胞免疫调节作用的机制研究
兰绍阳，佘世锋（广州中医药大学附属第一医院脾胃病科，广东 广州 510405）
【摘 要】 目的 探讨体外青藤碱增强骨髓间充质干细胞（BMMSCs）免疫调节能力的机制。 方法 原代培养小鼠
MSCs。将青藤碱和（或）小鼠 BMMSCs 加入混合淋巴细胞反应中。第 3 天，以 MTT 比色法检测各组 T 淋巴细胞增殖情况。
酶联免疫吸附试验（ELISA 法）检测上清液中 Th1 细胞因子[白细胞介素 2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）]和 Th2 细胞因子[IL-
10、肿瘤坏死因子 β（TGF-β）]的水平。 结果 90%培养出小鼠 BMMSCs 细胞为 CD29+、CD44+、CD45-、CD34-，是典型的
MSCs。青藤碱联合 BMMSCs 组的吸光度（A）值为 0.316±0.066，低于青藤碱组、BMMSCs 组和阳性对照组的 0.499±0.089、
0.602±0.101 和 0.922±0.113，差异有统计学意义（P＜0.05）。青藤碱联合 BMMSCs 组 IL-2、IFN-γ 水平分别为 0.066±0.009 和
0.769±0.074，低于青藤碱组 （0.259±0.017、1.023±0.095）、BMMSCs 组 （0.177±0.045、1.422±0.106）和阳性对照组 （0.631±
0.021、3.158±0.315），差异有统计学意义（P＜0.05）；青藤碱联合 BMMSCs 组 IL-10 和 TGF-β 水平为 2.216±0.247 和 1.863±
0.221，高于青藤碱组 （1.437±0.072、1.112±0.095）、BMMSCs 组 （1.386±0.169、1.128±0.107）和阳性对照组 （0.236±0.027、
0.118±0.023），差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 青藤碱能够促进小鼠 BMMSCs 的免疫调节作用，其作用机制可能与促
进 Th2 细胞因子分泌以及抑制 Th1 细胞因子分泌有关。
【关键词】 骨髓细胞； 间质干细胞； 免疫活性； 青风藤属； 生物碱类； 小鼠
文章编号： 1009-5519（2012）12-1761-03 中图法分类号： R96.7 文献标识码： A
Study of mechanism of sinomenine enhancing immune modulatory effects of mesenchymal stem cells in mice Lan Shao-
yang，She Shifeng（Department of Spleen and Stomach Diseases，First Affiliated Hospital，Guangzhou University of Chinese Me-
dicine，Guangzhou，Guangdong 510405，China）
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of sinomenine enhancing the immune modulatory effect of bone
marrow mesenchymal stem cells（BMMSC） in vitro. Methods Primary mouse bone marrow mesenchymal stem cells were isolat-
ed. Sinomenine and/or BMMSC s were added to the mixed lymphocyte culture.On the third day，proliferations of T lymphocytes in
each group were measured with MTT colorimetry. ELISA was used to detect the concentrations of Th1 cytokines （IL-2，IFN-γ）and
Th2 cytokines（IL-10，TGF-β） in the supernatant. Results 90% of isolated mouse BMMSCs were CD29+，CD44+，CD45-，CD34-
cells，which were typical BMMSCs. The A value of was 0.316 ±0.066 in the snomenine+BMMSCs group，which was lower than
0.499±0.089，0.602±0.101 and 0.922±0.113 in the sinomenine，BMMSCs and positive-control groups，respectively（P<0.05）. The
concentrations of IL-2 and IFN-γ in the sinomenine+BMMSCs group were 0.066±0.009 and 0.769±0.074，which were lower than
0.259±0.017 and 1.023±0.095 in the sinomenine group，0.177±0.045 and 1.422±0.106 in the BMMSCs group，and 0.631±0.021
and 3.158±0.315 in the positive-control group （P<0.05）. The soncentrations of IL-10 and TGF-β in the sinomenine+BMMSCs
group were 2.216±0.247 and 1.863±0.221， which were higher than 1.437±0.072 and 1.112±0.09 in the sinomenine group，1.386±
0.169 and 1.128±0.107 in the BMMSCs group，and 0.236±0.027 and 0.118±0.023 in the positive-control group（P<0.05）. Con-
clusion Sinomenine could enhance the immune modulatory effect of mesenchymal stem cells. The mechanism of action may be
related with promoting the secretion of Th2 cytokines and inhibiting the secretion of Th1 cytokines.
【Key words】 Bone marrow cells； Mesenchymal stem cells； Immunocompetence； Sinomenium； Alkaloids； Mice
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现代医药卫生 2012年6月30日 第28卷第12期 J Mod Med Health，June 30，2012，Vol.28，No.12
淋巴细胞增殖的抑制作用，并检测反应体系中 Th1/Th2 细胞因子
的变化，以明确青藤碱是否增强 MSCs 的免疫调节能力及其可能
的调节机制，为拓展青藤碱在干细胞移植中的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 健康 BALB/c 小鼠（4～6 周龄，体质量 15～25 g）购自
广州中医药大学实验动物中心。青藤碱纯品购自湖南正清集团制
药股份有限公司 。白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干扰素 -γ
（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和肿瘤
坏死因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）酶联免疫吸附试
验（ELISA）检测试剂盒购自武汉博士德生物制品有限公司。异硫
氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠 CD29、CD34、CD44 和 CD45 抗
体购自 BD 公司。流式细胞仪( FAC-Scabilur 型）为 BD 公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠骨髓 MSCs 的分离和培养 颈部脱臼处死 BALB/c 小
鼠，75％乙醇消毒全身，无菌操作取出四肢胫骨和股骨，去除所有
骨表面附着的肌肉和结缔组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗
3 次。剪断两端骨骺，用装有含 10%胎牛血清 DMEM 培养基的注
射器从一端冲洗骨髓腔和干骺端，收集另一端冲出的骨髓悬液，均
匀混合后反复轻轻吹打，制备成单细胞悬液。接种于含 8 mL DMEM
培养基的 100 mm2培养皿中，放在 37℃、5% CO2饱和湿度的细
胞培养箱中培养。以后每隔 2～3 d 传代换液 1 次。
1.2.2 脾淋巴细胞悬液的制备 常规无菌取出 BALB/c 小鼠脾
脏，先将脾脏放入含少量 DMEM 培养基的小皿中，用剪刀剪碎成
约 1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块， 然后倒在 200 目的不锈钢
筛网上研磨。用 PBS（pH 7.0）反复冲洗，取网下液体置离心管中
离心（1 000 r/min）5 min，去上清液后加 PBS 制成脾细胞悬液，超
净台内静置 30 min。将 Ficoll 液缓慢加入脾细胞悬液中，2 000 r/min
离心 20 min，分离淋巴细胞层，用 PBS 冲洗 3 次后，加入 4 mL
DMEM 培养基，调整细胞浓度至 1×109 L-1。
1.2.3 小鼠 BMMSCs 和脾淋巴细胞的混合培养 BMMSCs 消化、
洗涤并计数后，调整细胞浓度为 2×104 mL-1，接种于 96 孔板，每孔
100 μL。72 h 待其贴壁后， 以每孔 5 μL的丝裂霉素 （浓度为 1
μg/μL）处理（37℃）30 min。吸去丝裂霉素，并清洗干净。在相应组
加入备用的淋巴细胞悬液 90 μL及刀豆蛋白 A（ConA，浓度为 0.1
μg/μL）10 μL 以刺激淋巴细胞增殖转化。置于 37℃、饱和湿度、
体积分数为 5%CO2孵箱中培养。
1.2.4 实验分组 实验分为青藤碱联合 BMMSCs 组 、BMMSCs
组、青藤碱组，阴、阳性对照组，每组设复孔 3 个，实验重复 5 次。
青藤碱处理终浓度为 1 mmol/L。各组处理方案见表 1。
注：菁表示在对应组中添加相应药物；菖表示在对应组中不添加相
应药物。
1.2.5 标本收集和检测 （1）小鼠 BMMSCs 的鉴定：分别将原代
BMMSCs 以及传 3 代 （P3） 的 BMMSCs 收集制成单细胞悬液，用
PBS 洗涤 2 次，调整细胞浓度为 106 mL-1。取 100 μL样品与 20 μL
单抗（CD29、CD34、CD44 和 CD45）充分混匀，室温避光孵育 20 min，
用流式细胞仪检测 BMMSCs 表面标志物 CD29、CD34、CD44 和
CD45 的表达。（2）脾淋巴细胞的增殖能力检测：各组 BMMSCs 和
脾淋巴细胞混合培养 72 h 后，加入 MTT（5 mg/mL），每孔 20 μL。
37 ℃、继续孵育 4 h，500 r/min 离心 10 min，弃去孔内培养液。每
孔加入 150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡 10 min，酶标仪 490 nm
处读取吸光度（A）值。（3）培养上清液中细胞因子的检测 ：各组
BMMSCs 和脾淋巴细胞混合培养 72 h 后，收集上层培养基，4℃、
1 000×g 离心 10 min，取上清液中，分装后标记，立即冻存于-80 ℃
冰箱。采用 ELISA 法，按照试剂盒说明书操作，分别检测各组上
清液中 IL-2、IFN-γ、IL-10 及 TGF-β 水平。 酶标仪 450 nm 处读取
A 值，根据标准曲线计算各因子水平。
1.2.6 统计学方法 应用 SPSS17.0 软件分析结果。结果用x±s表
示，组间比较采用 t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠BMMSCs 培养及鉴定 原代培养 72 h 的小鼠 BMM-
SCs，显微镜下可见少量短梭形细胞。去除悬浮细胞后继续培养。
14 d 左右细胞呈长梭形，并达 90%左右融合。以 0.05%胰蛋白酶
消化，按 5×103/cm2 密度接种于 25 cm2 培养瓶，至培养第 7 天细
胞 90%融合，以 0.05%胰蛋白酶消化。用 PBS 制成单细胞悬液后，
以流式细胞仪检测细胞表面抗体表达。 结果显示，90%细胞为
CD29+，CD44+，CD45-，CD34-，是典型的骨髓 MSCS（见图 1、2）。
注：传代培养第 3 代小鼠 BMMSCs，细胞呈长梭形，具有 MSCs 的典
型形态（Bar=50 μm）。
图 1 培养的小鼠骨髓 MSCs 显微镜下观察结果
注：小鼠 BMMSCs（P3）流式细胞仪测定结果 ：CD29（99.310±1.024）％，
CD44（98.220±1.032）％，CD34（2.810±0.347）％，CD45 （1.690±0.302）%。符
合典型的 MSCs 表达特征。
图 2 培养第 3 代的小鼠 BMMSCs 的流式细胞仪检测结果
2.2 青藤碱联合小鼠 BMMSCs 对混合淋巴细胞反应的影响 混
表 1 实验各组的处理方案
组别
青藤碱联合BMMSCs
青藤碱组
BMMSCs组
阴性对照组
阳性对照组
菁
菁
菖
菖
菖
青藤碱
菁
菖
菁
菖
菖
BMMSCs
菁
菁
菁
菁
菁
脾淋巴细胞
菁
菁
菁
菖
菁
ConA
100 101 102 103 104
M1
CD29
0
12
8
Ev
en
ls
100 101 102 103 104
M1
0
12
8
Ev
en
ls
CD34
100 101 102 103 104
CD44
0
12
8
Ev
en
ls
M1
100 101 102 103 104
CD45
0
12
8
Ev
en
ls
M1
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现代医药卫生 2012年6月30日 第28卷第12期 J Mod Med Health，June 30，2012，Vol.28，No.12
合淋巴细胞反应体系共孵育 3 d 后，MTT 检测结果显示，阳性对
照组 A 值比阴性对照组明显升高，表明 ConA 能明显刺激混合
淋巴细胞反应的淋巴细胞增殖。青藤碱组和 BMMSCs 组 A 值也
较阴性对照组升高，但是低于阳性对照组，差异有统计学意义
（P=0.007、0.022），青藤碱联合 BMMSCs 组的 A 值明显低于青藤碱
组、BMMSCs 组和阳性对照组（P<0.05），见表 2。
注： P1 为各组与阳性对照组比较；P2 为各组与青藤碱+BMMSCs 组
比较。-表示无此项。
2.3 青藤碱和小鼠 BMMSCs 对混合淋巴细胞反应体系中细胞因
子分泌的影响 青藤碱组和 BMMSCs 组 IL-2、IFN-γ、IL-10 及
TGF-β 与阳性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。而青藤
碱+BMMSCs 组 IL-2、IFN-γ、IL-10 及 TGF-β 与青藤碱组、BMMSCs
组和阳性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。
注：与阳性对照组比较，aP<0.05、bP<0.05、cP<0.05；与青藤碱组比较，
dP<0.05；与 BMMSCs 组比较，eP<0.05。
3 讨 论
青藤碱是一种有效的免疫调节中药，能明显降低小鼠胸腺和
脾脏的重量，青藤碱对静息及活化增殖的 T、B 细胞的 DNA 代谢
均有抑制作用 [7]。既往研究提示，青藤碱对非特异性免疫、体液免
疫和细胞免疫均有抑制作用，能够用于移植治疗中减轻免疫排斥
作用。青藤碱可以抑制炎症免疫相关细胞的增殖和激活，主要通
过抑制炎症细胞因子分泌等途径抑制淋巴细胞增殖，促进淋巴细
胞凋亡，抑制淋巴细胞的活化 [8]。联合其他免疫调节药物，可能有
更强的免疫调节效果。MSCs 的免疫调节作用已经得到公认，其在
体外可抑制丝裂原诱导的脾细胞增殖反应，在体内可抑制淋巴细
胞的增殖和诱导免疫耐受，同时预先移植供者来源的 MSCs 还可
使急性移植物抗宿主病的发病时间推迟或降低免疫排斥反应，延
长受者的存活时间 [9]。联合应用青藤碱和 MSCs，可以发挥两种不
同药物和治疗途径的优势，产生更强的免疫调节效果。
本研究成功培养和鉴定了小鼠的 BMMSCs 细胞。结果表明，
单独用青藤碱或者 BMMSCs 已经有免疫调节作用，能够抑制混
合淋巴细胞反应中的淋巴细胞增殖，与多数研究结果类似 [10]。相
比单独使用青藤碱或者 BMMSCs，联合使用青藤碱和 BMMSCs 有
更强的免疫调节作用，更明显的抑制淋巴细胞的增殖，体现了青
藤碱和 BMMSCs 具有免疫调节协同作用。青藤碱和 BMMSCs 的
免疫调节作用是多种因素作用的结果，考虑到细胞因子是影响淋
巴细胞分化的关键因素，本研究对培养上清液中的 Th1 和 Th2 细
胞因子进行了检测。
Th1 细胞主要分泌 IL-2 和 IFN-γ 等，在机体抗胞内病原体感
染中发挥重要作用。Th2 细胞主要分泌 IL-10 和 TGF-β 等，有免
疫抑制作用。本研究结果显示，青藤碱和 BMMSCs 的免疫调节作
用与对细胞的 Th1 和 Th2 细胞因子分泌影响有关 。 青藤碱和
BMMSCs 均能促进 Th2 细胞因子的分泌，抑制 Th1 细胞因子的分
泌，通过影响 Th1/Th2 细胞因子的平衡，抑制淋巴细胞增殖，产生
免疫抑制作用。 而联合应用青藤碱和 BMMSCs 则有更强的抑制
Th1 细胞因子分泌和促进 Th2 细胞因子分泌的作用，因而显示出
更强的淋巴细胞增殖抑制作用，有较强的免疫抑制作用。研究发
现，青藤碱和 BMMSCs 对不同细胞因子的抑制水平并不一样，显
示不同抑制途径产生不同的抑制效果，联合使用青藤碱和 BMM-
SCs 可能从不同途径影响细胞因子分泌，从而产生免疫调节的协
同能力。
总而言之，青藤碱和 BMMSCs 有抑制淋巴细胞增殖的作用，
二者联合有更强的淋巴细胞增殖抑制效果，这种作用可能与影响
Th1/Th2 细胞因子分泌有关。目前，影响细胞因子分泌的机制尚不
清楚，并且因为本研究检测的是上清液中的细胞因子水平，尚不
能明确这些细胞因子的来源，需要在下一步的实验中进一步明确。
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（收稿日期：2012-03-16）
表 3 青藤碱联合 BMMSCs 对混合淋巴细胞
各组反应中细胞因子分泌的影响（x±s，ng/mL）
组别
阴性对照组
阳性对照组
青藤碱组
BMMSCs组
青藤碱+BMMSCs组
0.035±0.006
0.631±0.021
0.259±0.017a
0.177±0.045b
0.066±0.009cde
IL-2
0.471±0.021
3.158±0.315
1.023±0.095a
1.422±0.106b
0.769±0.074cde
IFN-γ
0.216±0.021
0.236±0.027
1.437±0.072a
1.386±0.169b
2.216±0.247cde
IL-10
0.136±0.023
0.118±0.023
1.112±0.095a
1.128±0.107b
1.863±0.221cde
TGF-β
表 2 各组青藤碱联合 BMMSCs 抑制混合淋巴细胞
反应体系 T 细胞增殖实验结果
组别
青藤碱组
BMMSCs组
青藤碱联合BMMSCs组
阳性对照组
阴性对照组
0.499±0.089
0.602±0.101
0.316±0.066
0.922±0.113
0.213±0.038
A490值
0.007
0.022
0.002
-
0.001
P1
0.046
0.022
-
-
0.080
P2
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