全 文 ：植物研究 2012，32(6) :695 ～ 700
Bulletin of Botanical Research
基金项目:国家自然科学基金项目(30960092 和 30960044)
第一作者简介:覃建兵(1973—) ，男，教授，博士，主要从事植物分子生物学研究。
* 通信作者:E-mail:xjsfzwj@ 163． com
收稿日期:2012 － 04 － 23
新疆雪莲 DFR基因的分离及同源遗传转化
覃建兵 唐亚萍 曾卫军*
(新疆师范大学分子生物学与生物信息研究室，新疆 830053)
摘 要 二氢黄酮醇 4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)是植物重要的次生代谢产物花青素生物合成途径
中的关键酶。运用 RT-PCR 和 RACE 技术从新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar． et Kir．)中克隆得到 DFR 基因
(GenBank登录号为 JN092126)。DFR基因的 cDNA全长序列含有 1 个 1 029 bp的开放阅读框(ORF) ，编码 343 个
氨基酸，该基因推断的蛋白与水母雪莲 DFR基因推断的蛋白高度同源，相似性达到 92%;以不同物种中 DFR氨基
酸序列进行比对分析，推断的蛋白含有与 NADPH特异结合的结构域。将该基因运用农杆菌介导的叶片转化法进
行同源转化，将含有转 DFR基因的愈伤组织进行悬浮培养，紫外分光光度法测定愈伤组织的总黄酮含量，结果表
明转基因愈伤组织的总黄酮含量明显高于非转基因愈伤组织的含量。该研究为提高新疆雪莲药用化学成分黄酮
类物质及实现新疆雪莲花青素的人工生物合成的研究奠定基础，对解决天山雪莲资源匮乏提供参考。
关键词 新疆雪莲;DFR;同源转化;总黄酮
中图分类号:S572 文献标志码:A 文章编号:1673 － 5102(2012)06 － 0695 － 06
Isolation and Homologous Genetic Transformation of DFR in
Saussurea involucrata Kar． et Kir．
QIN Jian-Bing TANG Ya-Ping ZENG Wei-Jun*
(Research Room of Molecular Biology and Informatics，Xinjiang Normal University，Xinjiang 830053)
Abstract The dihydroflavonol-4-reductase (DFR)is an important enzyme in plant secondary metabolites and
catalyzes the key step in the biosynthesis of anthocyanins． DFR gene (GenBank Accession JN092126)was
cloned from Saussurea involucrata Kar． et Kir． by RT-PCR and RACE． The cDNA sequence of DFR was consis-
ted of 1 029 bp open reading frame (ORF)encoding 343 amino acid，the deduced DFR protein has high homolo-
gy with S． medusa (92% identity)． Homology analysis showed that deduced DFR protein has the special domain
regioselectivity towards NADPH． DFR gene of S． involucrata was under the control of the cauliflower mosaic virus
(CaMV)35S promoter，homologous transformation was conducted using an Agrobacter-ium rihizogenes-mediated
transformation system． The results of UV spectrophotometry showed that Sinvolucrata callus after suspension cul-
ture had an obviously higher average content of total flavonoids than non-transgenic callus． This study will im-
prove the products of medicinal compositions and realize the synthesis of anthocyanins in S． involucrata．
Key words Saussurea involucrata;dihydroflavonol-4-reductase;homoosis;flavonoids
新疆雪莲为新疆特有的珍稀名贵中药，特殊的
生长环境造就了其独特的药用价值，其主要的药用
成分为黄酮类化合物。在人类的营养和医药方面，
黄酮类化合物具有抗辐射、抗氧化、抗癌及防治心
血管疾病等方面发挥着重要的作用。同时，黄酮类
化合物也是植物次生代谢过程中主要的产物之一，
黄酮类化合物能够帮助植物抗紫外线、抵抗病原微
生物的侵害、抗虫害并在植物生殖过程中担当信
使［1］。研究表明，在水母雪莲(Saussurea medusa)、
新疆雪莲(Saussurea involucrate)和雪兔子(Saus-
surea gossypiphora)野生植株中，新疆雪莲黄酮类物
质的含量高于其他雪莲［2］。新疆雪莲花青素属黄
酮类化合物，具有抗氧化、抗辐射、抗癌等作用。由
于人类的对新疆雪莲自然资源的掠夺性开采，使得
该物种濒临灭绝。所以运用基因工程手段提高雪
莲黄酮类化合物的产量，将为保护雪莲的自然资源
提供有效的手段。
花青素的生物合成(图 1)是通过苯丙烷代谢
途径，其中许多关键酶已经克隆［3］。二氢黄酮醇
4-还原酶(DFR)是花青素生物合成途径的关键酶，
最早从玉米和金鱼草中分离克隆，Holton 等［4］1995
年研究证实了花青素的显色作用受 DFR 基因的调
控。DFR属于 NADPH依赖性短链还原酶家族，为
单基因编码。对葡萄(Vitis vinifera)DFR 的晶体结
构的研究发现，DFR 是由 3 个亚基组成的复合物，
具有 NADPH专门的结合域［5］。
图 1 花青素合成图［6］ CHS．查尔酮合酶;CHI．查尔酮异构酶;F3H．黄烷酮 3-羟化酶;F35H．黄烷酮 3，5-羟化酶;DFR．二氢黄
酮醇 4-还原酶;ANS．花色素苷合成酶;3GT．类黄酮 3-O-糖基转移酶;5GT．类黄酮 5-O-糖基转移酶;MT．丙二酰转移酶;AT．肉桂酰羟
基辅酶 A;LAR．原花青素还原酶;ANR．花青素还原酶
Fig． 1 Anthocyanidin synthesis pathway CHS． Chalocone synthase;CHI． Chlacone isomerase;F3H． Flavanone 3-hydroxylase;F3
5H． Flavanone 3，5-hydroxylase;DFR． Dihydrofl avonoid 4-reductase;ANS． Anthocyanidin synthase;3GT． UDP-glucose-flavonoid 3-O-glu-
cosyltransferase;5GT． UDP-glucose-flavonoid 5-O-glucosyltransferase;MT． Malonyltransferase;AT． Hydroxycinnamoyl CoA;LAR． Leucoantho-
cyanindin reductase;ANR． Anthocyanidin reductase
该研究从新疆雪中克隆 DFR 基因，构建其遗
传转化体系，通过根癌农杆菌介导法转入雪莲愈伤
组织中，获得转化的雪莲愈伤组织，并用紫外分光
光度法检测其总黄酮含量。该文为提高雪莲黄酮
类化合物合成的研究奠定了一定的基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料
野生新疆雪莲种子采集于一号冰川，挑选籽粒
饱满的种子 50 粒，经灭菌后接入 1 /2MS 培养基
内［7］，待种子发芽长出真叶 4 ～ 5 片后使用。
1． 1． 2 菌种及质粒
大肠杆菌感受态 DH5α;根癌农杆菌(Agrobac-
terium tumefaciens)菌株 EHA105;植物表达载体
pMON530。
1． 1． 3 酶及主要试剂
LA Taq 酶，3-Full RACE Core Set Ver． 2． 0
(TaKaRa公司) ;TRIzol试剂，PCR 2． 1 vector(Invi-
torgen 公司) ;RevertAid First Stand cDNA Synthesis
Kit(Fermentas 公司) ;SMARTer RACE cDNA Am-
plification Kit(Clontech公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 新疆雪莲总 RNA提取及 DFR 基因保守片
段的克隆
采用液氮研磨法用 TRIzol 试剂提取新疆雪莲
叶片、茎、根及愈伤组织总 RNA。按照 RevertAid
First Stand cDNA Synthesis Kit说明书合成 cDNA第
696 植 物 研 究 32 卷
一链。按照 SMARTer RACE cDNA Amplification
Kit及 3-Full RACE Core Set Ver． 2． 0 试剂盒说明
书合成 5端及 3端完整的新疆雪莲叶片 cDNA 第
一链。以引物 FDFR 和 RDFR 为引物(表 1) ，以
cDNA第一链为模板进行 PCR 扩增，退火温度为
62℃;将目的片段连接到 T 载体上，送华大基因有
限公司测序。
表 1 文章中所用引物序列表
Table 1 Primers used in this work
引物 Primer 序列 Sequence
FDFR ACTGTCCGTGCTACTGTTCGTGA
RDFR TCAAGGAAAGTGCGGTAATGAG
DFRF1 GACCCCATGGCAACCTTCAACAGCT
DFRF2 GGTCACGAACAGTAGCACGGACAG
DFRR1 AAGCAGCATGGGAAGCAACA
DFRR2 CCTCATTACCGCACTTTCCT
FLDFRF CGGGATCCATGGTACAGGATTC
FLDFRR CGCGTGCACTCAAGCATGAATA
1． 2． 2 DFR基因的 3和 5RACE
根据测序获得的 cDNA片段，用软件 Primer 5．
0 及 Oligo 6． 0 设计基因特异引物(表 1) ，以 cDNA
第一链为模板，3RACE 以 3RACE outer Primer、3
RACE inner Primer、DFRF1 和 DFRF2 为引物，进行
Nested PCR ，退火温度为 50 ～ 65℃。5RACE 分别
以 DFRR1 为引物进行 PCR 扩增，再以 PCR 产物
为模板，以 DFRR2 为引物，进行 Nested PCR，PCR
反应条件与 3RACE 相同。PCR 产物经琼脂糖凝
胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接转化克隆，
PCR菌液检测后测序。
在 NCBI(www． ncbi． nlm． nih． gov /)和 DNA-
MAN中进行基因序列的同源比较，在 NCBI 中的
ORF Finding进行开放阅读框的预测，用软件 DNA-
MAN对基因 cDNA 序列进行核苷酸序列分析，在
网站 Clustal W2(www． ebi． ac． uk /clustalw /)进行氨
基酸序列的同源序列比对。
1． 2． 3 DFR基因的表达载体的构建及农杆菌转化
将已获得的 DFR 基因全长及表达载体
pMON530 同时用 KpnⅠ和 EcoRⅠ在恒温水浴锅中
37℃双酶切 2 h以上。酶切产物以 1． 0%的琼脂糖
凝胶电泳分离，胶回收目的片段，纯化目的片段，再
进行连接转化入大肠杆菌 E． coli DH5α，筛选阳性
克隆，用电击转化法转化进入根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105 中，用
DFR全长基因特异引物进行 PCR检测转化的农杆
菌菌株，将检测到的菌株命名为 pMONDFR。
1． 2． 4 DFR 基因叶盘转化及转基因愈伤组织的
筛选
新疆雪莲叶片切成 0． 5 cm × 0． 5 cm 大小的叶
盘，将该叶盘放置于新疆雪莲愈伤组织诱导培养基
中暗培养 2 d，叶盘浸泡在含有 pMONDFR 菌株及
100 μmol·L －1乙酰丁香酮，OD600 = 0． 5 的MS液体
培养基中 10 min［8 ～ 9］。然后将共培养 2 d的叶盘转
入含有 40 mg·L －1卡那霉素(kanmycin，kan)的诱导
培养基内进行转基因愈伤组织的筛选，45 d后，提取
在抗性培养基上生长的愈伤组织的 DNA，用卡那霉
素基因的特异引物进行转基因愈伤组织的筛选。
1． 2． 5 转基因愈伤组织的悬浮培养及紫外分光光
度法测量总黄酮
将筛选到的转 DFR基因的愈伤组织及非转基
因愈伤组织各 0． 2 g分别接入 10 mL 的 N6 液体培
养基内进行悬浮培养［10］，光周期为 12 h，转速 110
r·min －1，培养温度为 25℃。分别培养 4、8、12、16
d，试验重复 3 次。将培养的愈伤组织在 60℃烘箱
内烘干，测量干重，并用 80 %乙醇，60℃浸泡过夜
提取总黄酮，用紫外分光光度法［10］，测定波长 510
nm，其芦丁标准品与其吸光度的直线方程:C =
0. 09 344A － 0． 00 230 797，r = 0． 999 2(C 为总黄酮
含量单位是 mg·mL －1，A 为光的吸收变量) ，并测
量雪莲愈伤组织的总黄酮量。
2 结果
2． 1 新疆雪莲二氢黄酮醇 4-还原酶基因 cDNA全
长克隆与序列分析
用根据菊科植物 DFR基因同源序列设计的引
物进行扩增，纯化此扩增产物并进行测序，结果获
得一个 557 bp的 cDNA片段(图 2)。经 Blast分析
发现该片段与水母雪莲 DFR 基因(GenBank 登录
号:EF600682)高度同源，相似性达到 98%，表明实
验获得的 cDNA片段为目的基因二氢黄酮醇 4-还
原酶基因片段。依据新疆雪莲中该基因 cDNA 片
段的核苷酸序列设计基因特异引物，用 RACE技术
对目的基因的 3和 5 cDNA末端序列进行克隆，测
序结果表明，其大小分别为 487 和 246 bp(图 2)。
对已获得的 3 个 cDNA片段进行序列拼接，结果获
得了一个全长为 1 129 bp的 cDNA序列。在该 cD-
NA序列两端设计基因特异引物，进行 PCR 扩增、
测序，得到一个大小为 1 129 bp 的 cDNA 片段，将
此 1 129 bp片段与目的基因的 cDNA 拼接序列进
7966 期 覃建兵等:新疆雪莲 DFR基因的分离及同源遗传转化
行比对分析，分析结果显示两序列一致，这表明新
疆雪莲 DFR基因 cDNA拼接序列正确。新疆雪莲
DFR基因全长含有 1 029 bp的开放阅读框，其 5含
有起始密码子 ATG，3端含有 99 bp 的非编码区，
这表明新疆雪莲 DFR 基因的 cDNA 序列完整，获
得 GenBank登录号:JN092126。
2． 2 新疆雪莲 DFR氨基酸序列分析
根据新疆雪莲 DFR基因 cDNA 全长序列推测
其编码蛋白含有 343 个氨基酸残基。以来自不同
物种的 4 种二氢黄酮醇 4-还原酶氨基酸序列进行
序列比对分析，推测新疆雪莲二氢黄酮醇 4-还原
酶的 N 端含有保守的 NADP 结合位点“VTGAAG-
FIGSWL VMRLLQRGY”，还存在一个底物结合特
异决定的氨基酸基序“TVNV QEHQLPVYNESDWS-
DLDFIYSKKMT”(图 3)。这表明，从新疆雪莲中克
隆得到的 DFR基因具有二氢黄酮醇 4-还原酶基因
家族所具有的序列特征［11］，进一步证明其为二氢
黄酮醇 4-还原酶基因。
图 2 DFR基因特异引物 RT-PCR、3RACE及 5RACE扩
增
Fig． 2 Agarose gel(1． 0%)showing the PCR product of
special primers PT-PCR，3RACE and 5RACE M． DNA
marker;1． Product of primers FDFR and RDFR;2． Product of DFR 3
RACE;3． Product of DFR 5RACE
图 3 新疆雪莲与其他物种的 DFR氨基酸序列比对分析
Fig． 3 Muti-sequence alignment of dihydroflavonol-4-reductase proteinases from S． involucrata and other organisms
The identical and positive amino acid residues are denmed with“* ”and“∶ ”
896 植 物 研 究 32 卷
2． 3 新疆雪莲 DFR 基因的表达载体构建及农杆
菌转化
重组质粒构建(图 4) ，挑取大肠杆菌中的单菌
落，用 KpnⅠ和 EcoRⅠ双酶切重组质粒，得到预期
大小 1 000 bp的片段(图 5) ，并用 DFR基因特异引
物进行 PCR检测(图 5)得到预期 1 000 bp的片段。
经电击转化的农杆菌转化子的筛选与大肠杆菌重
组子的筛选相同，均得到预期大小的片段。
2． 4 新疆雪莲转 DFR基因愈伤组织的筛选
经农杆菌侵染的雪莲叶片共 150 片，转入含有
卡那霉素的转基因愈伤组织筛选培养基内培养 20
d后开始出愈，经 45 d 培养后，运用 CTAB 法提取
雪莲愈伤组织的总 DNA。由于该遗传转化为同源
转化，所以对转化子的筛选采用抗性标记基因的
PCR检测，用卡那霉素基因的特异引物进行转化
子的筛选(图 6) ，共检测到 19 个转化子，该基因的
转化率为 12． 67%。
2． 5 转新疆雪莲 DFR基因愈伤组织总黄酮
取其中 3 个转化子进行雪莲愈伤组织的悬浮
培养，分别测量其在 4、8、12、16 d 的平均干重及总
黄酮含量的变化如图 7，随着悬浮培养的时间的增
加，雪莲愈伤组织的干重和总黄酮含量不断增加，
在第 12 d左右干重及总黄酮含量的增加幅度开始
变小;其中转基因愈伤组织的总黄酮含量是非转基
因愈伤组织总黄酮含量平均值的 1． 86 倍。
图 7 悬浮培养雪莲愈伤组织干重及总黄酮含量
Fig． 7 Dry weight and flavonoids in S． involucrata callus
after suspension culture A． Positive control:an average of dry
weight and total flavonoids in fluid medium of N6;B． An average of
dry weight and total flavonoids on transgenic callus
3 讨论
尽管花青素代谢途径中的多个结构基因已经
从水母雪莲中分离出来［12 ～ 13］，但是在新疆雪莲中
9966 期 覃建兵等:新疆雪莲 DFR基因的分离及同源遗传转化
花青素代谢途径的关键酶基因 DFR 国内外未见报
道。本研究通过同源克隆的方法从新疆雪莲叶片
中分离得到 DFR 基因全长序列，根据推测的蛋白
质序列初步验证了基因的功能。
DFR是生物合成原花青素(Proanthoyanidin，
PA)途径中第一个关键酶，DFR 的 N 端具有高度
的保守性，从 8 － 212 氨基酸残基区域是一段类似
依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine
dinucleotide，NAD)异构酶或脱水酶家族的结构域。
这个家族的蛋白以 NAD为辅酶利用核苷酸糖基参
与各种化学反应，推测的新疆雪莲 DFR 与该研究
结果一致。DFR的第 134 为氨基酸残基直接决定
于 DFR结合的底物的特异性，并根据第 134 为氨
基酸的不同分为天冬酰胺(Asn)型、天冬氨酸
(Asp)型和非 Asn /Asp型，新疆雪莲 DFR属于 Asn
型，能够有效的把二氢堪非醇(dihydrokaempferol，
DHK)还原为无色花葵素。DFR 基因的表达受光
照、UV-A、钙离子和蔗糖等外部因子及 G-box、bZ-
IP、Myb 等顺式作用元件诱导。新疆雪莲 DFR 基
因在叶及愈伤组织中表达量最高，在根中表达量较
少，在茎中几乎不表达。
DFR基因是调控花色苷和原华色素生物合成
途径的关键酶基因，其分子特征和调控已在很多植
物中得到深入研究。王惠聪等［14］在荔枝中的研究
认为 DFR 与荔枝果皮中花色苷的合成无密切关
系。但是在杨俊等［15］对红肉猕猴桃 DFR 基因的
研究中和张剑亮等［16］在向日葵花青素的研究中均
认为 DFR基因与花色苷的合成呈正相关。在雪莲
DFR基因的功能研究方面，该研究表明 DFR 参与
黄酮类物质的积累。该研究将为运用基因工程手段
提高雪莲的黄酮类物质的含量的研究奠定基础。
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