全 文 ：2014 第十六卷 第二期 ★Vol.16 No.2
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2014-02-07
修回日期：2014-02-19
＊ 国家自然科学基金委青年科学基金项目（81102778）：新型抗自身免疫性心肌炎倍半萜类成分的发现及机制研究，负责人：金慧子。
＊＊ 通讯作者：胡志刚，博士，讲师，主要研究方向：中药资源与中药分子鉴定；黄必胜，教授，博士生导师，主要研究方向：中药资源学。
基于ITS2序列鉴定中药材金沸草、旋覆花
及其近缘混伪品＊
郭力城 1，2，胡志刚 1，3＊＊，凃 媛 1，3，张卫东 4，金慧子 4，孙 伟 3，
贺海波3，马孝熙 3，黄必胜 1＊＊
（1. 湖北中医药大学药学院 武汉 430065；2. 广西民族医药研究院 南宁 530001；
3. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700；4. 上海交通大学药学院 上海 200240）
摘 要：目的：应用 ITS2 序列鉴定中药材金沸草、旋覆花及其近缘种混伪品，以确保药材质量，保障
临床安全用药。方法：通过对金沸草、旋覆花等药材的 3个基原物种条叶旋覆花、旋覆花和欧亚旋覆花及
其同属近缘物种进行 DNA 提取、PCR 扩增 ITS2 序列并双向测序，用 CodonCode Aligner 对测序峰图进行
拼接后，用 MEGA5.0软件进行相关数据分析，并构建 NJ系统聚类树以直观反映鉴定结果。结果：各基原
物种 ITS2序列变异位点稳定，其种内平均 K2P距离均远小于各自药材以及同属近缘混伪品的种间平均
K2P距离；基于 ITS2序列的 NJ树可以将金沸草和旋覆花药材与同属其它近缘混伪品明显区分开。结论：
ITS2序列可准确鉴别中药材金沸草和旋覆花及其同属近缘混伪品。
关键词：金沸草 旋覆花 ITS2序列 鉴定 近缘物种
doi: 10.11842/wst.2014.02.017 中图分类号：R284.1 文献标识码：A
金沸草为菊科植物条叶旋覆花 Inula linariifolia
Turcz. 或旋覆花 I. japonica Thunb. 的干燥地上部
分；旋覆花为菊科植物旋覆花 I. japonica Thunb. 或
欧亚旋覆花 I. britannica L.的干燥头状花序 [1]。广布
于全国各地，生于山坡、荒地、路旁、河岸等地。旋覆
花药用历史悠久，其别名繁多，使用最广泛的名称
为旋覆花与金沸草 [2]。金沸草和旋覆花为《中国药
典》（2010 年版）收录的常用中药，具有降气、消痰、
行水等功效。现代药理研究表明，金沸草具有抗肿
瘤、抗炎、抗真菌等多种生物活性 [3~5]。我国有 20 余
种旋覆花属植物，多种植物常供药用，除金沸草和
旋覆花药材共 3 种正品来源外，该属相关物种由于
植物形态及药材性状相似，许多地区也将旋覆花属
其他物种误作为金沸草或旋覆花入药，因此常见市
售品混淆现象，影响了用药安全和准确。目前国内
外关于金沸草、旋覆花的鉴别研究，仅见性状鉴别
和显微鉴别等 [6，7]。
随着分子生物学技术的飞速发展，中药 DNA 分
子鉴定经历了以 RFLP、RAPD 和 DNA 条形码（DNA
barcoding）技术为代表的 3 个阶段 [8，9]，应用 DNA 条
形码技术对物种进行鉴定和分类已逐渐成为生物
分类学的研究热点 [10，11]。中药 DNA条形码鉴定研究
是以 ITS2 为主体条形码序列鉴定中药材的方法体
系，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定 [12]。
ITS2 条形码的鉴定能力已经得到了研究者的广泛
认可 [13~18]。陈士林等 [9]研究发现 ITS2 序列在物种水
平具有较高的鉴定效率。ITS2 序列的优点不仅在于
其序列长度较短，扩增和测序比较容易，适于部分
DNA 降解的中药材样品扩增，还可以实现对中药材
基原物种、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确
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快速鉴定，可以满足不同行业、不同科研背景工作
者对中药材鉴定的要求。
本研究采用 ITS2 条形码序列对《中国药典》收
录的金沸草、旋覆花药材及其同属近缘物种进行鉴
定研究，以验证 DNA 条形码对金沸草、旋覆花药材
及其近缘物种鉴定的稳定性与准确性，为该药材的
准确鉴定提供分子证据，以确保药材质量，保障临
床安全用药。
1 材料与方法
1.1 植物材料
以旋覆花属 7 个物种共 32 个样本为研究对
象，植物材料来源及 GenBank 登录号见表 1。其中
22 份实验药材样品分别采自安徽、湖北、广西、云
南、北京等地，由中国医学科学院药用植物研究所
林余霖研究员鉴定，硅胶干燥保存。其余 10 个样本
来源于 GenBank。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取
取干燥药材 30 mg，用 DNA 提取研磨仪研磨 2
min（30 次/s），利用植物 DNA 提取试剂盒（Tiangen
Biotech Co., China）提取总 DNA。
1.2.2 PCR 扩增及测序
ITS2 序列通用扩增引物 ITS2F 为 5 -ATGC－
GATACTTGGTGTGAAT-3，ITS3R 为 5-GACGCTTCT
CCAGACTACAAT-3。PCR 反应体积为 25 μL，体系
内含 MgCl2 2 μL（25 mM）、dNTP 2 μL（2.5 mM）、
PCR buffer 2.5μL（10 ×）、引物各 1.0 μL（2.5μM）、
聚合酶 1.0 U、模板 DNA 约 20~100 ng，ddH2O 补足
至 25 μL。反应条件为 94℃，5 min；94℃ 30 s，56℃
30 s，72℃ 45 s，40 cycles；72℃ 10 min。电泳检测
PCR 扩增情况，PCR 扩增产物经纯化后用 ABI
3730XL 测序仪（Applied Biosystems Co., USA）进行
双向测序。
1.2.3 数据处理。
使用 CodonCode Aligner 对测序峰图进行校对
拼接，去除引物区，获得 ITS2 序列；来源于 GenBank
的 ITS2 序列处理流程参考姚辉等 [8]的研究。将所有
序列用软件 MEGA 5.0 分析比对，寻找序列变异位
点，基于 Kimura two-parameter（K2P）模型进行遗传
距离分析，针对比对后的序列用邻接（Neighbor
Joining，NJ） 法构建系统聚类树，利用 Bootstrap（1
000 次重复）检验各分支的支持率。
2 结果与分析
2.1 金沸草、旋覆花药材序列变异分析
2.1.1 金沸草药材种内及种间变异分析
金沸草药材的 2 个基原物种条叶旋覆花和旋
覆花所有 ITS2 序列长度均为 227 bp。其中条叶旋
覆花 6 个样本分为 2 个单倍型，单倍型 A1 序列全
部与 KJ405438 相同，单倍型 A2 序列仅 KJ405437 一
条；旋覆花种内 10个样本的 ITS2 序列相同，为单倍
型 B1（见表 1）。从表 2 可以看出，金沸草药材 2 个
基原物种间主要在 206 bp处存在 C-T碱基变异。
对 ITS2 序列进行种内种间 K2P 距离分析结果
见表 3。条叶旋覆花种内最大 K2P 距离为 0.004 4，
平均 K2P 距离为 0.001 5；旋覆花种内 K2P 距离为
0。金沸草药材种间最小 K2P 距离为 0.004 4，平均
K2P 距离为 0.005 2。
2.1.2 旋覆花药材种内及种间变异分析
旋覆花药材的 2 个基原物种旋覆花和欧亚旋
覆花所有 ITS2 序列长度均为 227 bp。旋覆花 10 个
样本和欧亚旋覆花 6 个样本均只有 1 个单倍型，分
别为 B1 和 C1。由表 2 得知，旋覆花药材 2 个基原
物种间分别在 36 bp、172 bp 和 210 bp 出现 G-T、
T-C 和 G-C 碱基替换。
由表 3 可知，旋覆花和欧亚旋覆花种内 K2P 距
离均为 0，而旋覆花药材种间 K2P 距离为 0.013 3。
2.2 金沸草、旋覆花药材基原物种与近缘混伪品种
间变异分析
金沸草和旋覆花药材的 3 个基原物种条叶旋
覆花、旋覆花和欧亚旋覆花及其近缘混伪品 32 条
ITS2 序列中，共产生 53 个变异位点，远远多于以上
3 个基原物种间的变异位点数（5 个）。
条叶旋覆花、旋覆花和欧亚旋覆花及各自近缘
混伪品 K2P 距离结果显示：条叶旋覆花与混伪品种
间最小 K2P 距离为 0.004 4，平均 K2P 距离为 0.044
7；旋覆花与混伪品种间最小 K2P 距离为 0.004 4，
平均 K2P 距离为 0.047 7；欧亚旋覆花与混伪品种
间最小 K2P距离为 0.013 3，平均 K2P距离为 0.047 6
（见表 3）。
2.3 金沸草、旋覆花药材及近缘混伪品 NJ 树鉴定
基于 ITS2 序列构建 NJ 系统聚类树见图 1。由
图 1 可知，条叶旋覆花 6 个样本单独聚为一小支，
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表 1 材料来源及 GenBank 登录号
基原物种 拉丁名 单倍型 凭证标本号 来源 GenBank登录号
条叶旋覆花 Inula linariifolia A1 YC0397MT02 安徽 KJ405438
条叶旋覆花 I. linariifolia A1 YC0397MT03 云南 KJ405439
条叶旋覆花 I. linariifolia A1 YC0397MT04 中国医学科学院药植所 KJ405440
条叶旋覆花 I. linariifolia A1 YC0397MT05 湖北神农架 KJ405441
条叶旋覆花 I. linariifolia A1 YC0397MT06 湖北神农架 KJ405442
条叶旋覆花 I. linariifolia A2 YC0397MT01 安徽 KJ405437
旋覆花 I. japonica B1 YC0370MT06 中国医学科学院药植所 KJ405423
旋覆花 I. japonica B1 YC0370MT07 中国医学科学院药植所 KJ405424
旋覆花 I. japonica B1 YC0370MT08 广西药用植物园 KJ405425
旋覆花 I. japonica B1 YC0370MT15 广西玉林 KJ405432
旋覆花 I. japonica B1 YC0370MT16 广西岑溪 KJ405433
旋覆花 I. japonica B1 YC0370MT04 中国医学科学院药植所 KJ405421
旋覆花 I. japonica B1 YC0370MT03 中国医学科学院药植所 KJ405420
旋覆花 I. japonica B1 PS0698MT01 JF421506
旋覆花 I. japonica B1 PS0698MT04 GU724329
旋覆花 I. japonica B1 PS0698MT05 GU724330
欧亚旋覆花 I. britanica C1 YC0590MT01 中国医学科学院药植所 KJ405407
欧亚旋覆花 I. britanica C1 YC0590MT02 中国医学科学院药植所 KJ405408
欧亚旋覆花 I. britanica C1 YC0590MT03 中国医学科学院药植所 KJ405409
欧亚旋覆花 I. britanica C1 PS0670MT01 GU724292
欧亚旋覆花 I. britanica C1 PS0670MT02 GU724327
欧亚旋覆花 I. britanica C1 PS0670MT03 GU724328
土木香 I. helenium GenBank EU239682
土木香 I. helenium GenBank EU239683
土木香 I. helenium GenBank FM995377
I. conyza GenBank AF228395
I. conyza GenBank EF210952
I. montana GenBank AF228396
I. montana GenBank HE602397
羊耳菊 I. cappa GenBank GQ434532
羊耳菊 I. cappa GenBank EF210951
羊耳菊 I. cappa GenBank EF210973
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与旋覆花 10 个样本共同聚在一支上；欧亚旋覆花
6 个样本单独聚为一小支，支持率为 86%；作为金
沸草和旋覆花药材来源的以上 3 个基原物种的所
有样本合并为一大支，支持率为 97%，表现出良好
的单系性，能与同属其它近缘混伪品明显区分开。
旋覆花属其它物种的不同样本也各自单独聚为一
小支。
3 讨论
金沸草和旋覆花均为来源于同属的多基原药
材，其混伪品主要来自同属近缘植物，采用传统的
药材鉴定方法比较困难。DNA 条形码技术凭借其在
物种鉴定上的快速、准确和通用性等特点，正越来
越受到中药鉴定工作者的青睐。以上两个药材的药
用部位分别为地上部分和花序，该研究分别采集不
同产地以上药材的药用部位，提取其 DNA 后均能
实现成功扩增和正常测序，说明 ITS2 序列对于以上
药材的分子鉴定具备通用性。
对序列分析比较可以看出，以上药材的 3 个基
原物种条叶旋覆花、旋覆花和欧亚旋覆花的 ITS2 序
列变异位点均在种内比较保守，而在种间变异比较
稳定。金沸草药材基原物种条叶旋覆花和旋覆花种
内平均 K2P 距离（0.001 5 和 0）均远小于金沸草药
材种间平均 K2P 距离（0.005 2）；旋覆花药材基原
物种旋覆花和欧亚旋覆花种内平均 K2P 距离均为
0，而旋覆花药材种间平均 K2P 距离为 0.013 3。以
上变异位点和 K2P 距离分析结果均表明，ITS2 序列
可准确鉴定金沸草和旋覆花药材各自 2 个同属基
原物种。
通过对条叶旋覆花、旋覆花和欧亚旋覆花分别
与同属混伪品 ITS2 序列种间变异分析，其种内平均
K2P 距离（0.001 5、0 和 0）均远小于其与混伪品种
间平均 K2P 距离（0.044 7、0.047 7 和 0.047 6）。基
于 ITS2 序列构建的 NJ 树图结果表明，3 个基原物
种各自相对独立，明显与同属其它近缘混伪品鉴别
开，并且对于同属其它混伪品也具有良好的识别效
果。综上，ITS2 序列可将金沸草、旋覆花药材的 3 个
基原物种条叶旋覆花、旋覆花和欧亚旋覆花与同属
近缘混伪品很好地鉴别开。
由此可见，基于 ITS2 序列的 DNA 条形码鉴定
方法，不仅可以有效鉴别多基原药材金沸草和旋覆
花及其同属近缘混伪品，而且可以将这两个药材各
表 2 金沸草、旋覆花药材 ITS2 序列种间变异位点信息
拉丁名 单倍型 30 bp 36 bp 172 bp 206 bp 210 bp
I. linariifolia A1 T G T C G
I. linariifolia A2 A * * * *
I. japonica B1 * * * T *
I. britanica C1 * T C T C
注：“*”表示与第一行碱基相同。
表 3 金沸草、旋覆花药材种内、种间及其与
近缘混伪品种间 K2P 距离
K2P距离比较 K2P距离（平均）
条叶旋覆花种内 0~0.004 4（0.001 5）
旋覆花种内 0
欧亚旋覆花种内 0
金沸草药材种间 0.004 4~0.008 9（0.005 2）
旋覆花药材种间 0.013 3
条叶旋覆花与混伪品种间 0.004 4~0.192 8（0.044 7）
旋覆花与混伪品种间 0.004 4~0.180 9（0.047 7）
欧亚旋覆花与混伪品种间 0.013 3~0.187 0（0.047 6）
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自的两个基原物种进行准确鉴定。这为以上药材以
及旋覆花属物种的准确鉴定提供了分子证据，使其
鉴定不受药材性状相似的限制，可在一定程度上监
控市场混用现象，有效保障临床用药安全和准确。
图 1 基于 ITS2 序列构建的金沸草、旋覆花药材及其近缘种 NJ 树
注：Bootstrap 1 000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%。
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〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
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Identification of Inulae Herba, Inulae Flos and Their Closely Related Species Based on ITS2 Sequence
Guo Licheng1,2, Hu Zhigang1,3, Tu Yuan1,3, Zhang Weidong4, Jin Huizi4, Sun Wei3, He Haibo3,
Ma Xiaoxi3, Huang Bisheng1
(1. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China;
2. Guangxi Institute of Minority Medicine, Nanning 530001, China;
3. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China;
4. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)
Abstract: This study aimed to identify Inulae Herba, Inulae Flos and their closely related species using the ITS2 bar -
code, and secure the quality and clinical curative effect of these medicinal materials. DNA was extracted from Inula
linariifolia, I. japonica, I. britanica, which are the original species of Inulae Herba and Inulae Flos, together with their
closely related species. The ITS2 sequence was amplified by PCR and sequenced bidirectionally. Sequence assembly
and generation of consensus sequence were conducted by the CodonCode Aligner. The genetic distances were comput -
ed using MEGA 5.0 in accordance with the Kimura-2-parameter (K2P) model, and the phylogenetic tree constructed
by the neighbor-joining (NJ) method. The results showed that the ITS2 sequences of the various species have stable
variable sites. The intraspecific genetic distances among Inulae Herba and Inulae Flos were obviously lower than the
interspecific genetic distance among the above two medicinal materials and its adulterants. The NJ tree based on ITS2
sequences can clearly differ from Inulae Herba, Inulae Flos and their closely related species. It is concluded that ITS2
sequence can be used as DNA barcode to identify Inulae Herba, Inulae Flos and their closely related species.
Keywords: Inulae Herba, Inulae Flos, ITS2 sequence, identification, closely related species
（责任编辑：李沙沙 张志华，责任译审：王 瑀）
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