全 文 ：中国食用菌 2013，32 (2) :36 ～ 38
EDIBLE FUNGI OF CHINA
CN53－1054 /Q ISSN 1003－8310
* 项目来源:云南省应用基础研究资助项目 (2008CD193)。
作者简介:王文兵 (1980－) ，男，助理农艺师，主要从事食用菌研究工作。
＊＊通信作者:曹旸，E-mail:caoyang8352@ 163. com
收稿日期:2013－01－18
覆土中放线菌对暗褐网柄牛肝菌出菇的影响*
王文兵，曹 旸＊＊，纪开萍，刘 静，张春霞，何明霞
(云南省热带作物科学研究所，云南 景洪 666100)
摘要:本试验对暗褐网柄牛肝菌人工栽培时覆土中的放线菌进行了分离纯化。通过回接覆土试验研究了覆土中放线菌
对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的影响;通过 16S rDNA序列分析对有益放线菌菌株进行了初步鉴定。结果表明，分离
得到的 37 株放线菌菌株中有 12 个菌株分别在牛肝菌菌丝生长、原基发生及子实体生长等方面表现出促进作用。16S
rDNA序列分析结果显示，12 株放线菌中 11 株属于链霉菌属，1 株属于游动放线菌属。
关键词:暗褐网柄牛肝菌;覆土;有益放线菌
中图分类号:S646. 9 文献标志码:A 文章编号:1003－8310 (2013)02－0036－03
Effect of Actinomycetes of Casing on Fruiting of Phlebopus portentosus
WANG Wen-bing，CAO Yang，JI Kai-ping，LIU Jing，ZHANG Chun-xia，HE Ming-xia
(Yunnan Institution for Tropical Crop Research，Jinghong Yunnan 666100)
Abstract:Actinomycetes were isolated from the casing layer which were used in the cultivation of Phlebopus portentosus． The effects of
actinomycetes on fruiting of Phlebopus portentosus were studied，and beneficial strains were identified． The results indicated that 12 of
total 37 actinomycete strains could promote the development of mycelium and fruit body of Phlebopus portentosus． Based on the 16S rD-
NA sequences analysis，11 of 12 beneficial strains were proposed as known species of genus Streptomyce and one was Actinoplanes．
Key words:Phlebopus portentosus;Casing soil;Beneficial actinomycetes
暗褐网柄牛肝菌 Phlebopus portentosus (Berk ＆ Broome)
Boedijn，又名巨型牛肝菌、黑牛肝菌等，分布在中国云南、
广西和海南等地［1 － 3］，味道鲜美、营养丰富，深受产地消费
者的喜爱，实现其人工栽培具有重要的意义。Lumyong 和
Sanmee［4，5］报道，在培养皿中以腐生菌的培养基培养暗褐网
柄牛肝菌，可产生子实体和担孢子，担孢子能够萌发，只是
子实体的形态不好，且产量很低。
笔者曾设计不同覆土方法研究覆土对暗褐网柄牛肝菌子
实体形成的影响，探讨其出菇与覆土的密切相关性，并通过
覆土中混入细菌、放线菌的对比试验，发现覆土中的微生物
对其子实体形成有一定的促进作用［6］。本文中，笔者通过覆
土中放线菌的分离纯化，回接无菌覆土进行对比栽培试验，
进一步研究了覆土中放线菌对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的
影响，并通过 16S rDNA序列分析对有益放线菌菌株进行了初
步鉴定。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 暗褐网柄牛肝菌菌株
菌株编号 B-01-3-11，2003年由采自云南景洪凤凰木 (de-
lomix regia)树下的野生子实体分离获得，保存于云南省热带
作物科学研究所，其人工培养的子实体凭证标本存放于中国科
学院昆明植物研究所真菌标本室，标本编号:HKAS49706号。
1. 1. 2 覆土
由果园土壤、草炭等体积混合，加水至含水量 60%。
1. 1. 3 培养基质
液体培养基 (每升) :去皮马铃薯 200. 0 g (煮沸 30
min)、葡萄糖 20. 0 g、酵母膏 1. 0 g、MgSO4 1. 0 g、KH2PO4
1. 0 g。
子实体培养料:干橡胶木锯末 10 kg、谷粒 5 kg、MgSO4
15 g、KH2PO4 5 g，加水拌匀至含水量 60%，pH 在 6 左右。
分装入 500 mL 玻璃广口瓶，每瓶鲜料 400 g，121℃ 灭菌
60 min。
1. 2 方法
1. 2. 1 覆土中放线菌的分离
采用琼脂平板稀释分离法:覆土在室温下风干 10 d 后取
1 g加入 10 mL 无菌水，制成 10%的土壤悬液。然后梯度稀
释使其终浓度达到 10 －6。取上述土壤悬液滴于加 50 mg·L －1
重铬酸钾抑制剂的改良高氏 1 号琼脂培养基平板，均匀涂布，
每个浓度 3 次重复。28℃培养 7 d ～ 15 d后挑取单菌落，转接
于改良高氏 1 号琼脂斜面。28℃培养，待菌落长满斜面后移
至 4℃冰箱保存。
1. 2. 2 放线菌回接覆土栽培试验
暗褐网柄牛肝菌液体菌种、固体菌种及放线菌菌悬液的
制备方法参照曹旸等［6］的方法。
待牛肝菌菌丝长满广口瓶中的固体培养基质后，进行覆土
出菇试验。覆灭菌土 (121℃，60 min) ，并在无菌条件下分别
添加各放线菌菌悬液，混匀，使覆土中放线菌浓度约为 100
cfu·g －1，之后封口培养至覆土层长满菌丝，再敞口培养［6］，
以覆灭菌土为对照，覆土厚度 4. 0 cm，每处理 7个重复。
将上述覆土后的栽培瓶移至砖混泡沫板菇房中，保持温度
28℃～30℃、光照 100 lx ～ 300 lx、湿度 90%～ 95%培养。记录
牛肝菌菌丝在覆土层的生长情况、原基发生及子实体生长情
况，并以 Duncar新复极差法 (DPS7. 0)对数据进行分析。
1. 2. 3 有益放线菌菌株 16S rDNA序列分析
以 SK1201-UNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒，
生工生物工程 (上海)公司，提取有益放线菌基因组 DNA。
以 PCR引物 Primer 27F (5 － AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －
3)和 Primer 1492R (5 － GGTTACCTTGTTACGACTT － 3)进
行 PCR扩增，PCR反应体系:模板 10 pmol;Primer 27F (10
μmol·L －1)1 μL;Primer 1492R (10 μmol·L －1)1 μL;dNTP
mixture (10 Mm each)1 μL;10 × Taq Reaction Buffer 5 μL;
Taq (5 U·μL －1)0. 25 μL;加水至 50 μL。PCR 反应条件:
预变性 98℃、5 min;循环 95℃、35 s，55℃、35 s，72℃、1
min、30 s，35 个循环;延伸 8 min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，并进行测序。
根据测序结果，在 GenBank 中进行同源序列搜索，并调出相
关的 16S rDNA序列用 Clustal X［7，8］软件进行多序列比对，通
过 MEGA3. 1 软件［9，10］选用 Kimura 2-parameter 距离模型计算
进化距离，用 Neighbor-Joining法构建系统发育树，1 000次随
机抽样计算 Bootstrap值以评估系统发育树的置信度。
2 结果与分析
2. 1 放线菌菌株对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响
覆土中共分离纯化得到 37 株放线菌菌株。通过回接覆土
试验检测它们对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响，见表 1。
表 1 放线菌菌株对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响
菌株 菌丝长满覆土层时间d 菌株 原基发生时间d 菌株 原基数目个 菌株 子实体成熟数个 菌株 平均单菇重量g
C17 16. 00 ± 0Aa 11 39. 00 ± 4. 14Aa 9 3. 85 ± 0. 14Aa T21 0. 86 ± 0. 38Aa 17 38. 57 ± 3. 54Aa
C19 16. 00 ± 0Aa 13 38. 57 ± 4. 39Aa 21 3. 43 ± 1. 51ABab 17 0. 86 ± 0. 38Aa T21 35. 71 ± 8. 02ABa
16 14. 00 ± 0Bb 8 38. 43 ± 2. 64Aa 43 3. 00 ± 1. 15ABCabc 8 0. 86 ± 0. 38Aa 8 33. 14 ± 7. 72ABCabc
T21 13. 43 ± 0. 53BCbc CK 36. 00 ± 6. 25ABab 7 2. 86 ± 1. 19ABCDabcd 37 0. 71 ± 0. 49ABab 37 26. 57 ± 2. 09ABCabcd
13 13. 14 ± 0. 38BCbcd C19 35. 43 ± 7. 96ABCab 16 2. 57 ± 1. 13ABCDEabcde 14 0. 71 ± 0. 49ABab 36 26. 29 ± 2. 94ABCabcde
8 13. 00 ± 0BCDbcd 22 34. 20 ± 3. 11ABCDabc 26 2. 57 ± 1. 07ABCDEabcde 34 0. 71 ± 0. 49ABab C17 24. 43 ± 3. 68ABCabcde
T38 13. 00 ± 0BCDbcd 28 33. 75 ± 4. 50ABCDEabcd 37 2. 43 ± 0. 97ABCDEabcdef 36 0. 71 ± 0. 49ABab 14 23. 43 ± 7. 25ABCabcde
35 13. 00 ± 0BCDbcd C20 33. 57 ± 4. 54ABCDEabcd 3 2. 43 ± 1. 61ABCDEabcdef 11 0. 57 ± 0. 53ABabc T31 23. 29 ± 9. 06ABCabcde
T31 13. 00 ± 0BCDbcd T30 33. 29 ± 7. 97ABCDEabcd 8 2. 14 ± 1. 35ABCDEbcdefg 43 0. 57 ± 0. 53ABabc T20 22. 14 ± 1. 77ABCabcde
11 13. 00 ± 0BCDbcd T36 33. 20 ± 4. 15ABCDEabcd 24 2. 14 ± 1. 68ABCDEbcdefg T30 0. 57 ± 0. 38ABabc 34 22. 14 ± 6. 81ABCabcde
CK 12. 62 ± 1. 56BCDEcd C17 32. 86 ± 6. 64ABCDEabcd 19 2. 14 ± 1. 22ABCDEbcdefg 13 0. 57 ± 0. 53ABabc 9 21. 43 ± 9. 54ABCabcde
17 12. 14 ± 1. 95CDEcde T38 32. 86 ± 4. 85ABCDEabcd T36 2. 00 ± 1. 45ABCDEbcdefg T38 0. 57 ± 0. 53ABabc T30 21. 29 ± 1. 12ABCabcde
T5 12. 00 ± 3. 74CDEde 17 32. 71 ± 6. 02ABCDEabcde 22 2. 00 ± 1. 83ABCDEbcdefg C17 0. 57 ± 0. 53ABabc 11 21. 00 ± 2. 18ABCabcde
32 11. 86 ± 1. 95CDEFde 34 32. 71 ± 5. 70ABCDEabcde 31 1. 86 ± 1. 67ABCDEbcdefg C20 0. 57 ± 0. 53ABabc 26 20. 14 ± 5. 45ABCabcde
T36 11. 29 ± 2. 14DEFef 35 31. 50 ± 6. 41ABCDEbcdef C6 1. 57 ± 1. 13BCDEcdefg T31 0. 43 ± . 0. 38ABabc T36 18. 29 ± 3. 36ABCabcde
38 11. 00 ± 0EFef 36 31. 43 ± 8. 10ABCDEbcdefC 19 1. 57 ± 0. 98BCDEcdefg 39 0. 43 ± 0. 38ABabc T38 18. 14 ± 8. 00ABCabcde
39 11. 00 ± 0EFef C6 31. 43 ± 8. 02ABCDEbcdef 38 1. 43 ± 0. 98BCDEcdefg 26 0. 43 ± 0. 38ABabc 39 17. 71 ± 3. 73ABCabcde
22 11. 00 ± 0EFef 31 31. 33 ± 1. 97ABCDEbcdef 39 1. 43 ± 0. 98BCDEcdefg 33 0. 43 ± 0. 38ABabc 43 17. 14 ± 7. 76ABCabcde
T12 11. 00 ± 0EFef 16 31. 29 ± 2. 29ABCDEbcdef T21 1. 43 ± 0. 54BCDEcdefg T12 0. 43 ± 0. 53ABabc 33 15. 71 ± 9. 87ABCabcde
21 11. 00 ± 0EFef 14 31. 20 ± 8. 64ABCDEbcdef 14 1. 29 ± 0. 83BCDEcdefg T36 0. 43 ± 0. 53ABabc C20 15. 71 ± 5. 54ABCabcde
19 11. 00 ± 0EFef T20 31. 20 ± 2. 49ABCDEbcdef 33 1. 29 ± 0. 48BCDEcdefg C6 0. 43 ± 0. 38ABabc T12 14. 86 ± 8. 59ABCabcde
28 11. 00 ± 0EFef 32 31. 14 ± 2. 67ABCDEbcdef 32 1. 29 ± 0. 76BCDEcdefg 9 0. 43 ± 0. 38ABabc C6 13. 57 ± 7. 49ABCabcde
24 11. 00 ± 0EFef 21 31. 00 ± 1. 73ABCDEbcdef 28 1. 29 ± 0. 49BCDEcdefg T20 0. 43 ± 0. 53ABabc 32 13. 57 ± 4. 28ABCabcde
3 11. 00 ± 0EFef 24 30. 57 ± 3. 41ABCDEbcdef 17 1. 29 ± 0. 76BCDEcdefg 19 0. 29 ± 0. 49ABabc 13 13. 00 ± 3. 60ABCabcde
37 11. 00 ± 0EFef 3 30. 57 ± 2. 07ABCDEbcdef T38 1. 29 ± 0. 48BCDEcdefg 24 0. 29 ± 0. 49 ± ABabcC 19 12. 57 ± 1. 75ABCbcde
26 11. 00 ± 0EFef 7 30. 50 ± 1. 38ABCDEbcdef 13 1. 14 ± 0. 38CDEdefg 3 0. 29 ± 0. 49ABabc 19 12. 00 ± 1. 63ABCbcde
33 11. 00 ± 0EFef 19 30. 43 ± 2. 99ABCDEbcdef T30 1. 14 ± 0. 38CDEdefg 32 0. 29 ± 0. 49ABabc CK 11. 29 ± 1. 19ABCbcde
9 11. 00 ± 0EFef T12 30. 25 ± 4. 72ABCDEbcdefC 17 1. 14 ± 0. 38CDEdefg 31 0. 29 ± 0. 49ABabc 31 10. 29 ± 3. 85ABCbcde
43 11. 00 ± 0EFef 26 30. 14 ± 2. 27ABCDEbcdef 36 1. 14 ± 0. 38CDEdefg 38 0. 29 ± 0. 49ABabc 38 9. 86 ± 6. 84ABCbcde
73第 32 卷 第 2 期 王文兵等:覆土中放线菌对暗褐网柄牛肝菌出菇的影响
续表
菌株 菌丝长满覆土层时间d 菌株 原基发生时间d 菌株 原基数目个 菌株 子实体成熟数个 菌株 平均单菇重量g
7 11. 00 ± 0EFef 38 29. 17 ± 2. 04BCDEbcdef C20 1. 14 ± 0. 38CDEdefg CK 0. 29 ± 0. 49ABabc 3 8. 86 ± 6. 41ABCcde
31 11. 00 ± 0EFef T21 28. 00 ± 6. 11BCDEcdef CK 1. 00 ± 0. 58CDEefg C19 0. 29 ± 0. 49ABabc T5 7. 57 ± 1. 03ABCcde
14 10. 14 ± 1. 95FGfg T31 28. 00 ± 7. 97BCDEcdef 35 1. 00 ± 0. 58CDEefg 16 0. 29 ± 0. 49ABabc 16 6. 43 ± 1. 07ABCde
T30 10. 14 ± 1. 95FGfg 33 27. 57 ± 6. 55BCDEcdef T20 1. 00 ± 0. 82CDEefg T5 0. 14 ± 0. 38ABbc 24 6. 43 ± 1. 03ABCde
34 10. 14 ± 1. 95FGfg 43 27. 43 ± . 079BCDEcdef 34 1. 00 ± 0CDEefg 21 0. 14 ± 0. 38ABbc 21 5. 14 ± 3. 61ABCde
36 9. 00 ± 0Gg 39 27. 33 ± 3. 83BCDEcdef 11 0. 8571 ± 0. 38CDEefg 35 0. 14 ± 0. 38ABbc 35 2. 86 ± 1. 56BCde
C6 9. 00 ± 0Gg 37 27. 00 ± 4. 08BCDEdef T5 0. 8571 ± 0. 38CDEefg 7 0. 14 ± 0. 38ABbc 7 1. 43 ± 1. 77Cde
T20 9. 00 ± 0Gg T5 26. 83 ± 3. 76CDEdef T31 0. 71 ± 0. 49DEfg 22 0. 00Bc 22 0. 00Ce
C20 9. 00 ± 0Gg 9 24. 85 ± 1. 07Ef T12 0. 57 ± 0. 53Eg 28 0. 00Bc 28 0. 00Ce
从表 1 中可以看出，覆土中加入放线菌菌株 C20、T20、
C6、36、34、T30、14 的处理，牛肝菌菌丝长满覆土层的时
间比对照 (CK)提前 3 d以上，达极显著水平，说明这 7 个
菌株能够促进牛肝菌菌丝生长。
覆土中加入放线菌菌株 T5、菌株 9 的处理，原基发生时
间比 CK提前 10 d 以上，达极显著水平。在原基数目上，添
加放线菌菌株 9、菌株 21 的处理与对照相比达到极显著差异
水平。说明这四株放线菌能促进原基发生。
在子实体成熟数上，14 个添加放线菌的处理在数值
上高于 CK，但所有处理与两对照相比都没有达到显著差
异水平。
在平均单菇重量上，添加放线菌菌株 17、菌株 T21 的处
理与对照相比达到显著差异水平，是对照的 3 倍以上，说明
菌株这两株放线菌能够促进子实体生长。
2. 2 有益放线菌菌株 16S rDNA序列分析
上述试验中，对暗褐网柄牛肝菌出菇有促进作用的共有
12 株放线菌菌株，它们的 16S rDNA 测序结果经修正后已向
GeneBank提交序列 (登录号:JN248568 ～ JN248579)。根据
16S rDNA序列同源性，构建了包括这 12 株放线菌在内的系
统发育树，结果见图 1。
从 16S rDNA序列聚类分析结果可以看出，12 株放线菌
中 11 株属于链霉菌属，1 株属于游动放线菌属。
图 1 基于 16S rDNA序列构建的系统发育树
3 讨论
由覆土中共分离纯化得到 37 株放线菌菌株，通过回接覆
土试验检测它们对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响。其中有
12 个菌株分别在牛肝菌菌丝生长、原基发生及子实体生长等
方面表现出促进作用。
16S rDNA序列分析结果显示，12 株放线菌中 11 株可归
为链霉菌属 (Streptomyces) ，1 株归为游动放线菌属 (Actino-
planes) ，将它们鉴定到种还需要进行进一步的生理生化试验。
笔者曾报道在暗褐网柄牛肝菌人工栽培中，覆土及覆土
中微生物的重要性［6］。本文结果表明，在覆土所包含的众多
微生物中，放线菌的几个类群可能对暗褐网柄牛肝菌子实体
的形成和生长有促进作用，但它们的作用机理还有待进一步
的研究。
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