全 文 ：芦苇抑藻化感物质的分离及其抑制蛋白核小球藻效果
研究
李锋民 , 胡洪营＊
(清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室 , 北京　100084)
摘要:采用乙醇提取 、溶剂萃取法从芦苇中分离出 2 组能抑制蛋白核小球藻生长的化感物质.该 2 组化感物质对蛋白核小球
藻的半效应浓度(EC50)分别为 0.68mg/ L 和 2.65mg/ L.将前者用碱性氧化铝层析柱分离得到一组抑藻活性更强的化感物质
和一组能够促进蛋白核小球藻生长的化感物质:前者对蛋白核小球藻的 EC50为 0.50mg/ L , 是目前报道的抑藻能力最强的化
感物质;后者在浓度为 0.63mg/ L 时能显著促进蛋白核小球藻的生长.芦苇化感物质可以用来控制淡水中有害藻类.
关键词:芦苇;蛋白核小球藻;抑制;化感作用
中图分类号:X175　文献标识码:A　文章编号:0250-3301(2004)05-0089-04
收稿日期:2003-12-01;修订日期:2004-03-24
基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)项目(G199045711)
作者简介:李锋民(1975～ ), 男 , 博士研究生 , 主要研究方向为环
境生物学.
＊通讯联系人
Isolation and Effects on Green Alga Chlorella pyrenoidosa of Algal-Inhibiting
Allelochemicals in the Macrophyte , Phragmites communis Tris.
LI Feng-min , HU Hong-ying
(ESPC Key Joint Labo rato ry , Depar tment o f Environment Science and Engineering , Tsinghua University , Beijing 100084 , China)
Abstract:Two fractions of secondary metabolites which inhibited the grow th of g reen alga Chlorella pyrenoidosa , was isolated by sev-
eral separation techniques from the ethanol ex tract of the macrophy te, Phragmites communis T ris.The EC50 of the two fractions on
C.py renoidosa were 0.68mg/ L(the fraction of acidic solvent)and 2.65mg/ L(the fraction of alkaline solvent), respectively.Fur-
ther purification of the allelochemicals in the acidic solvent by alkaline aluminum oxide column chromatog raphy revealed tha t this frac-
tio n containing inhibiting allelochemicals and stimulating allelochemicals.The inhibiting allelochemicals showed more inhibitory effect
and the EC50 w as 0.50mg/ L.The result suggests that allelochemicals in P.comm unis can be used as an algae-inhibitor.
Key words:Chlorella pyrenoidosa;Phragmites communis T ris.;inhibition;allelopathy
　　随着水体富营养化程度的加剧 , 水华已经成为
农业 、渔业和休闲娱乐用水的一大危害.现有抑藻
方法中效果最好 、最常用的是化学法 , 即直接向水
体中施入化学物质(如硫酸铜),达到抑制藻类生长
的目的[ 1] .然而 , 一般的化学抑藻剂在杀灭藻类的
同时会杀死其它水生生物 , 破坏整个水生生态系
统;同时铜等重金属会在食物链中传递 、富集 , 最终
威胁人类身体健康.因此 , 寻找一种安全高效的抑
藻方法成为环境保护领域的一个重要课题.
化感物质是植物产生的次生代谢物质 , 可以通
过不同的途径释放到环境中影响其它生物的生长.
许多水生植物产生的化感物质能够抑制藻类的生
长[ 2 , 3] .化感作用和化感物质发现后 , 为寻找新型
高效安全的抑藻方法提供了一种思路.目前利用化
感作用抑制藻类的方式主要有 3种:将水生植物栽
培至待处理水体 , 利用活体植物释放的化感物质抑
制藻类[ 2～ 4] ;将死亡干燥的植物体放入待处理水
体 , 利用其腐败释放的化感物质抑制藻类[ 5 , 6] ;将
从植物中提取的化感物质施入水体抑制藻类[ 7～ 9] .
这 3种方式中前 2种需要较长时间 , 并且实施较困
难.将化感物质从植物中提取出来直接施入水体可
以快速抑制藻类的生长 , 并且易于操作 , 是一种有
前景的应用方式[ 10] .
前期研究表明 , 芦苇产生的化感物质具有较好
的抑藻效果.本文报道了从芦苇中提取分离化感物
质的方法及化感物质的抑藻效果 , 为将芦苇化感物
质应用于有害藻类控制提供理论和方法基础.淡水
水华的优势种随季节的改变而发生变化:春季和秋
季为绿藻(如小球藻),夏季为蓝藻(主要是微囊藻
属)[ 11] .小球藻具有易培养 、检测方法成熟等优点而
常被应用于科学研究[ 12] .因此 ,本研究选用蛋白核
小球藻为抑制对象.
1　材料与方法
1.1　材料
第 25卷第 5期
2004 年 9 月 环　　境　　科　　学ENVIRONMENTA L SCIENCE
Vol.25 , No.5
Sep., 2004
DOI :10.13227/j.hjkx.2004.05.019
芦苇(Phragmites communis Tris.)采自清华
大学荷塘.
蛋白核小球藻(Chlorel la pyrenoidosa)由中国
科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供.试验
前预培养 4d , 使之处于对数增长期.培养液组成同
文献[ 11] .
1.2　化感物质提取与分离方法
化感物质的粗提:2.8kg 烘干(80℃, 48h)芦苇
粉碎 , 乙醇浸泡提取 48h , 抽滤 , 滤液即为化感物
质粗提物.化感物质的分离方法见图 1.
乙醇滤液
A(白色沉淀) B
CHCl3/ 2%盐酸
C(水相)
浓缩 , 20mL 乙醇/ 20mL 石油醚
下层
浓缩 , 400mL 乙醇
H 沉淀 I水相
上层
D(有机相)
石油醚
下层
KOH 溶液
E水相 G沉淀 F 有机相
上层
　浓缩
图 1　化感物质的分离方法
Fig.1　Isolat ion process of allelochemicals in P.comm unis T ris
　　化感物质的柱层析法分离:采用 Υ=26mm , h
=300mm 层析柱 , 以 30g 碱性氧化铝(100 ～ 200
目)湿法装柱.注入待分离液 10mL , 用 H2O/2%
NaOH-H 2O 阶段洗脱.洗脱液等体积收集 , 每管
5mL .得到的流分挥发掉乙醇后用 TOC 测定仪测
定总碳含量.
1.3　化感物质的生物检测
采用培养液法对分离组分进行抑藻活性生物检
测 ,培养混合液共 200mL , 其中包括 5mL 处于对数
生长期的藻种液 、一定量的待测液和培养液 ,培养液
组成见文献 11.各沉淀组分用乙醇溶解后再测定.
生物检测体系中待测液浓度梯度设为:0 , 5 , 25 ,
50mL/L.于光暗比 16∶8 , 温度 25℃, 相对湿度
75%培养.第 5天在显微镜下用血球计数板计数.
1.4　数据处理
化感物质对藻类的抑制率公式为:
RI(%)= 1 -NN 0 ×100
其中 , RI:抑制率 , N :加入浸出液组藻密度(个/
mL), N 0:对照组藻密度(个/mL).EC50的计算采
用概率单位法[ 13] .
2　结果与讨论
2.1　芦苇化感物质的分离
采用乙醇提取方法得到化感物质粗提物 B 共
48g .利用图 1 所示分离方法 , 进一步将组分 B 分
为 E 、F 、G 、H 、I 等 5 个组分 , 其质量分别为 4.3 ,
16.5 , 1.4 , 3.7 , 4.8g , 其中 F 和 I 分别溶于乙醇 ,
浓度为 33g/L 和 9.6g/L.分离过程中加入石油醚
的作用是去除叶绿素和油脂.
2.2　分离组分的抑藻活性生物检测
利用培养液法对上述 5个组分进行生物检测 ,
各组分对蛋白核小球藻的抑制率如图 2所示.由图
2可见 , 在 5个组分中 , F 和 I对蛋白核小球藻有明
显的抑制作用 , 在 5ml/ L时对蛋白核小球藻的抑制
率接近 1 , 说明蛋白核小球藻被完全抑制.其它 3
个组分即使在 50ml/ L 时抑制率仍很低.可见 , 芦
苇中抑藻化感物质主要存在于 F 和 I 组分中.
图 2　萃取组分对蛋白核小球藻的抑制率比较
Fig.2　The inhibition ration on C.pyrenoidosa of
graded dosages of isolates
2.3　F 和 I 组分对蛋白核小球藻的 EC50
在所有组分中 F 和 I 具有明显的抑藻效果 , 其
不同浓度对蛋白核小球藻的抑制率如图 3所示.可
见 , 在较低浓度(1mg/L)时 , I 组分对蛋白核小球
藻的抑制率达到 0.72 , 表现出较好的抑藻活性.并
且 I 组分在各个浓度下的抑制率都高于同浓度的 F
组分的抑制率.利用概率单位法求出 I和 F 的半效
应浓度 EC50分别为 0.68mg/ L 和 2.65mg/ L.这说
明 I 组分对蛋白核小球藻的抑制效果好于 F.在现
有文献中 , 从水生植物提取的化感物质对藻类的
90 环　　境　　科　　学 25 卷
EC50都约为 2 ～ 4 mg/ L。因此 , I 组分的抑藻效果明
显好于已经报道的化感物质[ 14 , 15] , 有良好的应用
前景.
图 3　2组化感物质对蛋白核小球藻的抑制效果
Fig.3　Inhibitory effect s of 2 allelopathic f ract ions on C.pyrenoidosa
2.4　I 组分碱性氧化铝层析柱分离流分的抑藻效
果
由于 I 组分是从碱性溶剂中分离得到(见图
1), 因此可以用碱性氧化铝对其进行进一步分离 ,
以明确具有抑藻活性的物质.对每个收集到的流分
进行生物监测 , 在 200mL 培养混合液中含有 5mL
藻种 、1mL 待测流分 、194mL 培养液.图 4示出了
培养 6d后不同流分对蛋白核小球藻抑制效果.可
见 , 1 ～ 4号藻密度接近对照组 , 加入 5 ～ 13号流分
的培养系统中藻密度显著下降 ,抑制率接近 1;13 ～
　　　　　　
图 4　I组分层析流分对蛋白核小球藻的化感作用效果
Fig.4　Grow th curve and inhibition rate of C.pyrenoidosa
w ith the allelopathic ef fects of chromatography f ract ions of ext ract I
27号藻密度与对照相差不大;而在 28号之后藻密
度突然高于对照组 , 该流分显示明显的促进作用.
将具有强抑藻效果的流分 5 ～ 13合并 , 称为 I2 , 28
号之后的流分合并称为 I1.图 5 示出不同浓度的
I1 、I2 对蛋白核小球藻的抑制率.I1 表现出强的抑
制作用 , 用概率单位法求出 I1 的 EC50为 0.50mg/
L .可见 I1 是 I 中抑制藻类生长的主要物质.I1 对
蛋白核小球藻的化感作用表现为促进作用.在较低
浓度(0.05mL/ L , 约 0.63mg/L)时 , I2对蛋白核小
球藻的促进率为 0.73 , 表现为较强的促进作用.但
是随着浓度升高 , I2 的促进作用逐渐表现为抑制作
用.化感物质的这种“低促高抑”现象已有过报
道[ 16] .
图 5　不同浓度 I1 和 I2 对蛋白核小球藻的抑制率
Fig.5　Inhibitory effects of f ract ion I1 and I2 on C.pyrenoidosa
3　结论
(1)利用乙醇提取溶剂萃取法从芦苇中得到 2
个具有抑藻活性的组分 ,对蛋白核小球藻具有强抑
制作用 , EC50分别为 0.68mg/L 和 2.65mg/ L.
(2)碱性氧化铝层析法得到抑制和促进蛋白核
小球藻生长的流分各 1个.前者对蛋白核小球藻的
EC50为 0.50mg/L;后者在 0.65mL/L 时能强烈促
进蛋白核小球藻的生长.
参考文献:
[ 1 ] 　彭海清 , 谭章荣 , 高乃云 ,等.给水处理中藻类的去除[ J] .中
国给水排水 , 2002 , 18(2):29～ 31.
[ 2 ] 　俞子文 , 孙文浩 , 郭克勤 ,等.几种高等水生植物的克藻效应
[ J] .水生生物学报 , 1992 , 16(1):1～ 7.
[ 3 ] 　Nakai S , Inoue Y , Hosomi M , et al.Grow th Inhibi tion of
Blue-green Algae by Allelopothic Effect s of Macrophytes[ J] .
Water Science and Tech nology , 1999 , 39(8):47～ 53.
[ 4 ] 　Aliotta G , Greca N D , Monaco P , et al.In vito algal grow th
inhibition by phy totoxins of Typha lati fol ia L.[ J] .J.Chem .
Ecol., 1990 , 16:2637～ 2646.
[ 5 ] 　Everall N C , Lees D R.The use of barley-st raw to cont rol gen-
eral and blue-green algal grow th in a Derbyshi re reservoir[ J] .
Water Research , 1996 , 30(2):269～ 276.
915 期 环　　境　　科　　学
[ 6 ] 　Barret t P R F , Curnow J C , Li tt lejohn J W.The cont rol of di-
atom and cyanobacterial blooms in reservoi rs using barley straw
[ J] .Hydrobiologia , 1996 , 340:307～ 311.
[ 7 ] 　Ball A S , Williams M , Vincent D , et a l.Algal grow th cont rol
by a barley st raw ext ract [ J] .Bioresource Technology , 2001 ,
77:177～ 181.
[ 8 ] 　Nakai S , Inoue Y , Hosomi M.Algal grow th inhibit ion effects
and inducemen t modes by plant-producing phenols[ J] .Water
Research , 2001 , 35(7):1855～ 1859.
[ 9] 　Suzuki Y , Takabayashi T , Kaw aguchi T , et al.Isolation of Al-
lelopathic Sustance from the Crustose Coralline Algae , Litho-
phyllum spp., and It s Ef fect on the Brow n Algae , Laminaria
rel igieda Miyabe(Phaeophyta)[ J] .Journal of Experimental
Marine Biology and Ecology , 1998 , 225:69～ 77.
[ 10] 　Vyvyan J R.Allelochemicals as leads for new herbicides and
agrochemicals[ J] .Tet radron , 2002 , 58:1631～ 1646.
[ 11] 　Canovas S , Picot B, Casellas C , et al.Seasonal development of
phytoplankton and zooplankton in a high-rate algal pond[ J] .
Water Science and Tech nology , 1996 , 33(7):199～ 206.
[ 12] 　Ramos E U , Vaes W H J , Mayer P , et al.Algal grow th inhibi-
tion of Chlorel la pyrenoidosa by polar narcotic pollutants:t oxic
cell concent rations and QSAR modeling[ J] .Aquatic Toxicology ,
1999 , 46:1～ 10.
[ 13] 　Hayes A W.Principles &M ethods of Toxicology.2nd Ed[M ] .
New York:Raven Press , 1989.
[ 14] 　Nakai S , Inoue Y , Hosomi M , et al.Myrophyl lum spicatum-
Released Allelopathic Polyphenoles Inhibit ing Growth of Blue-
green Algae Chlorel la pyrenoidosa[ J] .Water Research , 2000 ,
34(11):3026～ 3032.
[ 15] 　杨善元 , 俞子文 , 孙文浩 ,等.凤眼莲根系中抑藻物质分离与
鉴定[ J] .植物生理学报 , 1992 , 18(4):399～ 402.
[ 16] 　叶居新 , 何池全 , 陈少风.石菖蒲的克藻效应[ J] .植物生态
学报 , 1999 , 23(4):379～ 384.
欢迎订阅　欢迎投稿　欢迎刊登广告
《分析试验室》技术期刊
国内统一刊号:CN11-2017/ TF 　国际标准刊号:ISSN 1000-0720
国际 CODEN码:FENSE4　 邮发代号:82-431
国外代号:BM848　 广告经营许可证:京西工商广字第 0038号
《分析试验室》是中文核心期刊 ,月刊 ,国内外公开发行。1982年创刊 ,目前已成为我国著名的分析化学
专业刊物 。影响遍及冶金 、地质 、石油化工 、环保 、药物 、食品 、农业 、商品检验和海关等社会各行业及各学科
领域。《分析试验室》以突出创新性和实用性为办刊宗旨 ,作者来自全国各行业的生产 、科研第一线;在国际
上常年被“CA”等国内外多家检索数据库 、文摘收录 ,影响因子连续多年列化学类前列 。本刊常设“研究报
告” 、“研究简报” 、“仪器装置与设备”等栏目。“定期评述”栏目系统发布特邀知名专家学者撰写的国内外分
析化学各领域的综合评述 ,连续跟踪学术发展前沿 。“国际会议”栏目每期介绍影响广泛的分析化学领域国
际学术交流会议 。2004年新设“特邀专家评论” ,聚焦当前科研重点 、难点 、热点。
《分析试验室》每期定价 10元 ,全年 12期 ,120元。
全国各地邮局征订 ,邮发代号 82-431。漏订的读者可直接与编辑部联系。
编辑部地址:北京新街口外大街 2号
邮编:100088。电话:010-82013328
E-mail:analysislab@263.net
92 环　　境　　科　　学 25 卷