全 文 ：　　　　 天然产物研究与开发　 　　　　　
2004　Vol.16　No.6 NATU RAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT　 　　　　　　　　　　
　
　
　
　
　　收稿日期:2004-04-22　　　接受日期:2004-05-18
基金项目:国家自然科学基金项目(30200226)
　＊通讯作者 E-mail:nayali@sohu.com
小球藻糖蛋白的分离 、纯化和结构分析
李亚娜1＊　林永成1 　佘志刚1 　周利平2
(1.中山大学化学博士后流动站　广州　510275;2.湖南省科技厅　长沙　410000)
摘　要　采用柱层析分离纯化小球藻糖蛋白 , 并对其进行结构分析。结果表明 , 小球藻糖蛋白为白色粉末 ,产
率为鲜藻的 0.28%, 易溶于水 ,分子量约为 65 , 000 Da , 属 O-连接方式 , 蛋白质含量为 12.01%, 糖链部分含有
岩藻糖 、阿拉伯糖 、甘露糖 、葡萄糖和半乳糖。
关键词　小球藻糖蛋白;分离;纯化;结构分析
ISOLATION ,PURIFICATION AND STRUCTURE DETERMINATION
OF CHLORELLA GLYCOPROTEIN
LI Ya-na1＊ ,LIN Yong-cheng1 ,SHE Zhi-gang1 ,ZHOU Li-ping2
(1.Chemistry Postdoctor of S un Yat-sen University , Guang zhou　510275 , China;
2.Science and Technology Of fice of Hunan Province , Chang sha　410000 , China)
Abstract　CPG was isolated and purif ied by column chromatog raphy .Then its st ructure w as stud-
ied.The results show ed that CPG is the white solid pow der and easily dissolved in w ater.Produc-
tivity is 0.28%(wet weight).The molecular weight is 65 , 000 Da.The linkage betw een glycan
and core protein backbone is O-linkage.The protein content w as up to 12.01%.The saccharide
chain w as composed of fucose , xylose ,mannose , glucose , galactose.
Key words　CPG isolation;purification;st ructure determination
　　糖蛋白(Glycopro tein)是一类由糖类同多肽或
蛋白质以共价键连接而形成的结合蛋白[ 1] 。其结
合方式主要有两种:①糖和含羟基的氨基酸以糖苷
形式结合 ,称为 O连接;②糖和天冬酰胺基连接 ,称
为N 连接 。在生物体内它以不同的形式存在而发
挥作用 ,是细胞膜 、细胞间基质 、血浆 、粘液 、激素等
的重要构成成分[ 2] 。小球藻为绿藻门(Chlorphy ta)
小球藻属(Chlorella)普生性单细胞绿藻 ,该属约 10
种 ,我国常见的种类有椭圆小球藻 、普通小球藻等 。
小球藻分布广 ,生长速度快 ,易于培养。日本 、美国
等国家将小球藻作为优良食品或饲料添加剂已有三
十多年历史[ 3] 。
目前 ,小球藻与螺旋藻 、盐藻等微藻的开发利用
构成了我国食品领域的一个重要分支 ,具有广阔的
前景[ 4] 。小球藻粉蛋白质含量颇高 ,是优良的单细
胞蛋白源 ,其中含有的小球藻糖蛋白大量存在于藻
粉蛋白生产的废水之中 ,若采用适当的手段将其分
离提取 ,将产生显著的经济效益和社会效益。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
小球藻:由广东省海南文昌养殖场提供;透析
袋:美国 Sigma 公司 ,分子截量 1000 Da;二乙基氨
基乙基(DEAE)52:Whatman 公司;葡聚糖凝胶
(Sephadex)G100:瑞典 Phamacia 公司;硼氢化钠:美
国 Sigma公司;其它试剂均为化学纯或分析纯。
1.2　主要仪器与设备
LKB自动柱层析系统;Beckman 高速冷冻离心
机;岛津 UV-120紫外可见分光光度计;日立 835-50
型氨基酸自动分析仪;岛津 IR-440 型傅立叶红外
仪;GC-9A型气相色谱仪;ZK-82A真空干燥箱 。
503
DOI :10.16333/j.1001-6880.2004.06.004
1.3　试验方法
1.3.1　小球藻糖蛋白(CPG)的分离纯化[ 5-7]
称取一定量的小球藻在 60 ℃烘干并粉碎 ,加适
量水浸提 3次 ,取其水溶液部分经无水乙醇沉淀 ,所
得沉淀物用适量蒸馏水溶解后 ,透析4 d。收集透析
内液 ,离心(4500 rpm)30 min ,取上清液 ,真空干燥
后即得小球藻糖蛋白粗品(淡黄色粉末)。粗品依次
经DEAE-52柱层析(1.6 cm×20 cm), 0.05 mol/ L 、
0.1 mol/L 、0.5 mol/L 碳酸氢钠溶液阶段洗脱;
SephadexG-100 柱层析 , 0.02 mol/ LTris-HCl(pH
7.2)(1.6 cm×80 cm)洗脱 ,洗脱后经检测得到一陡
峭的大峰 ,收集此峰即得小球藻糖蛋白纯品(白色粉
末)。
1.3.2　小球藻糖蛋白(CPG)的鉴定
1.3.2.1　CPG 的纯度鉴定及分子量的测定[ 2 , 6-8]
小球藻糖蛋白的粗品和纯品同时进行 SDS-聚
丙烯酰胺凝胶电泳 ,分离胶浓度为 15%,电极缓冲
液为 pH=8.3的 1.5 mol/L Tris-Gly-SDS 溶液 ,采
用考马斯亮蓝 R-250 染色 ,脱色液为 7%冰乙酸 。
同时 ,采用小牛白蛋白 、卵蛋白酶 、胃蛋白酶 、胰蛋白
酶原 、β-乳球蛋白和溶菌酶作分子量标准 。溴酚蓝
为指示剂 ,其迁移率为 1.0 ,以各蛋白质相对迁移率
对分子量对数作出标准曲线 ,根据小球藻糖蛋白纯
品的相对迁移率可求得其分子量。
1.3.2.2　糖含量的测定:苯酚-硫酸法 ,以葡萄糖为
标准品[ 9]
1.3.2.3　蛋白质含量的测定:Folin-酚法 ,以牛血清
白蛋白为标准品[ 10]
1.3.2.4　水分和灰分含量的测定:水分用烘干法测
定 ,灰分用灼烧法测定[ 10]
1.3.2.5　小球藻糖蛋白的氨基酸组成:日立 835-
50型氨基酸自动分析仪
1.3.2.6　小球藻糖蛋白的单糖组成分析[ 11]
取CPG 10 mg置于安瓿管中 ,分别加入 2 mL 2
mol/L 三氟醋酸(CF 3COOH),封管 ,置于烘箱 120
℃水解2 h ,冷至室温 ,用玻璃棉滤去残渣 ,用少量水
洗残渣 2次 ,合并滤液 ,减压蒸干 ,再加少量水 3次 ,
减压蒸干以除去残存的 CF3COOH 。取水解物少许
在真空干燥箱中 70 ℃减压干燥过夜。分别加入约
10 mg 盐酸羟胺及 1 mL 无水吡啶 ,温热溶解后在
90 ℃反应 30 min ,冷至室温 ,加入1 mL无水醋酸
酐 ,在 90 ℃下继续反应 30 min ,冷至室温 ,加入 1
mL H 2O搅拌 ,再用氯仿萃取 3次 ,每次 1 mL ,合并
氯仿层 ,减压抽干。置真空干燥箱减压干燥 24 h。
同法制备各种标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物 ,分别
进行气相色谱分析 。
2　结果与讨论
2.1　小球藻糖蛋白的一般性质
提纯后的小球藻糖蛋白为白色粉末 ,产率为鲜
藻的 0.28%。易溶于水 ,不溶于乙醇 、丙酮 、正丁醇
等有机溶剂。当溶液浓度为 1.02 g/mL 时 , pH ≈
5.8 ,特征性粘度为 2.96 MPa.s ,比旋度[ α] 25D =+
45°(C=0.29 ,H2O),紫外吸收峰为 280 nm 。
2.2　小球藻糖蛋白样品的主要成分
表 1　小球藻糖蛋白粗品 、纯品的主要成分含量(%)
Table 1 　Content of components of crude CPG and purified
CPG(%)
主要成分
Main composit ions
粗　　品
Crude CPG
纯　　品
Purified CPG
糖 Sugar 54.6 72.9
蛋白质 Protein 10.3 14.8
水分 Water 10.5 6.1
灰分 Ash 5.4 3.2
其它 Others 19.2 3.0
由表 1可知 ,小球藻糖蛋白的糖含量和蛋白质
含量均高于粗品 ,分别增加了 18.3%, 4.5%,而其
它几种成分都有所下降 ,经过 DEAE-52纤维素柱层
析和 Sephadex G100 柱层析后 ,色素等其它成分的
下降幅度最大。
图 1　小球藻糖蛋白在 DEAE 层析柱上的洗脱图
Fig.1　Elution pattern of CPG on DEAE 52 column
2.3　DEAE 52柱层析纯化小球藻糖蛋白
从图 1可知 ,在 DEAE 52纤维素层析柱上 ,小
球藻糖蛋白粗品经 0.05 mol/L 、0.1 mol/L 、0.5
mol/L 碳酸氢钠溶液阶段洗脱后 ,可得到 1个主峰。
收集此主峰部分进行透析干燥 ,得到白色粉末状的
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小球藻糖蛋白。
2.4　Sephadex G100纯化小球藻糖蛋白
将 DEAE 52柱层析纯化后的小球藻糖蛋白 ,进
一步经 Sephadex G100柱层析。从图 2洗脱曲线可
知 ,得到的两个分离主峰中 ,峰 II 峰值高 ,峰宽小 ,
分离度好。因此 ,将所得的峰 II 组分合并 ,透析后
干燥即得到小球藻糖蛋白纯品(白色粉末)。
图 2　小球藻糖蛋白在 Sephadex G100 层析柱上的洗脱图
Fig.2　Elution pattern of CPG on Sephadex G100 co lumn
2.5　小球藻糖蛋白分子量的凝胶电泳测定
由图 3可见 ,小球藻糖蛋白纯品经 SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳后 ,只有唯一的一条染色带 ,表明小球
藻糖蛋白纯品已经得到纯化 ,其纯度可供生物和理
化性质研究。此外 ,根据小球藻糖蛋白纯品的相对
迁移率(MR),可求得其分子量 ,约为 65 ,000 Da 。
图 3　小球藻糖蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
F ig.3　The SDS-PAGE photog raph of CPG
2.6　小球藻糖蛋白的氨基酸组成分析
将小球藻糖蛋白在 0.1 mol/L 氢氧化钠-1.0
mol/L 硼氢化钠 β-消除反应前后分别经盐酸充分水
解后 ,由氨基酸自动分析仪测定其组分 ,比较各氨基
酸相对含量及其变化 ,以判断糖蛋白中糖肽键的连
接方式 ,结果如表 2所示:
表 2　小球藻糖蛋白经 β-消除反应前后的氨基酸组成比较(mg/ g)
Table 2　CPG amino acid composition of post and before β-eliminate reaction
氨基酸
Amino acid
消除反应前
Before
消除反应后
Post
氨基酸
Amino acid
消除反应前
Before
消除反应后
Post
天冬氨酸(Aspartic acid) 13.64 13.28 蛋氨酸(Methionine) 1.23 1.38
苏氨酸(Threomine) 8.15 7.93 亮氨酸(Leucine) 7.80 7.38
丝氨酸(Serine) 8.60 5.92 酪氨酸(Tyrosine) 3.61 3.35
谷氨酸(Glutamic acid) 13.59 13.33 苯丙氨酸(Phenylalanine) 3.21 3.38
脯氨酸(Proline) 7.49 6.87 组氨酸(Hist idine) 2.36 2.97
甘氨酸(Glycine) 6.96 6.65 赖氨酸(Lysine) 6.39 6.82
丙氨酸(Alanine) 5.44 6.84 精氨酸(Arginine) 5.64 5.83
缬氨酸(Valine) 6.03 6.19 羟脯氨酸(Hydroxylysine) 12.13 12.30
胱氨酸(Cys teine) 0.49 0.58 总氨基酸量(Whole amino acid) 116.73 111.32
异亮氨酸(Isoleucine) 3.97 4.06 蛋白质含量(Content of protein) 120.01
　　从表 2 可知 , 小球藻糖蛋白中蛋白质含量为
12.01%,经 β-消除反应前后氨基酸含量发生了变
化 ,每克小球藻糖蛋白中 ,丝氨酸含量由 8.60 mg 下
降为 5.92 mg , 而丙氨酸含量由 5.44 mg 上升为
6.84 mg 。这种变化表明 ,糖蛋白中存在糖-O-丝氨
酸的连接方式。因为与羟基氨基酸连接的 O-糖苷
键 ,在温和的碱性条件下 , 很容易被 β-消除反应解
离 ,丝氨酸转化为 2-氨基丙烯酸 ,同时糖链被释放 。
当有硼氢化钠存在时进行碱处理 , 2-氨基丙烯酸转
化为 DL-丙氨酸的消旋混合物。
2.7　小球藻糖蛋白的单糖组成分析
气相色谱条件:OV-225 玻璃毛细管柱(0.29
mm×25 m);柱温 235 ℃;N2 为载气 ,流速 46 mL/
min。
通过与标准谱图比较可知 ,小球藻糖蛋白中的
单糖成分包括:1岩藻糖 、2阿拉伯糖 、3甘露糖 、4葡
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萄糖 、5半乳糖。此外 ,还可检测到痕量的鼠李糖和
木糖 。
图 4　糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图
Fig.4　GLC of alditol acetate derivatives of carbohydrates
A:Hydrolyzate of CPG　　B:Standard sample
图 5　小球藻糖蛋白的红外光谱
F ig.5　The infrared spectra of CPG
2.8　小球藻糖蛋白的红外(IR)光谱
从图 5可知 ,小球藻糖蛋白的特征吸收峰(IR
υKBrmax cm-1)分别为:3367(-OH), 2927 、2958(-N-H),
1654 ,1544 , 1459(-C-C-), 1083(-C-O-), 845 , 692(-C
=C-H)。其中 , 1654 , 1544为肽链上酰胺羰基的吸
收峰 ,3367(-OH)和 1083(-C-O-)是多糖分子的特征
吸收峰 ,845 cm-1附近的振动吸收表明小球藻糖蛋
白中含有 β-糖苷键 ,由 1083 cm-1附近的吸收峰可
推知小球藻糖蛋白的糖苷类型主要为吡喃型 。
3　结论
本文研究结果表明 ,小球藻糖蛋白分子量约为
65 ,000 Da ,属 O-连接方式 。此外 ,经红外光谱分
析 ,发现含有 β-糖苷键和典型酰胺羰基结构 。成分
分析发现小球藻糖蛋白含蛋白质 12.01%,糖链部
分主要单糖有岩藻糖 、阿拉伯糖 、甘露糖 、葡萄糖和
半乳糖 。
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