全 文 ：化感物质对小球藻抗氧化体系酶活性的影响
李锋民1 , 2 , 胡洪营1＊ , 门玉洁1 , 洪喻1 , 郭美婷1
(1.清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室 , 北京　100084;2.中国海洋大学环境科学与工
程学院 , 青岛　266003)
摘要:利用水生植物产生的化感物质抑制有害藻类是 1种藻类控制新技术.研究了选择性抑藻化感物质 EMA 对蛋白核小球
藻和普通小球藻抗氧化酶体系活性的影响.结果显示 , 化感物质浓度为 0.25 mg/ L时 , 2 种藻类的超氧化物歧化酶(SOD)、过
氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性都高于对照组.但随着化感物质浓度的升高 , 蛋白核小球藻 3 种酶活性都逐渐下降 ,
当化感物质浓度为 4 mg/ L时 , SOD活性为 0;而普通小球藻的酶活性随着化感物质浓度升高持续升高 , 都达到对照组的 3 ～
4 倍.
关键词:化感物质;蛋白核小球藻;普通小球藻;抗氧化体系
中图分类号:X52　文献标识码:A　文章编号:0250-3301(2006)10-2091-04
收稿日期:2005-11-10;修订日期:2005-12-02
基金项目:国家“十五”科技攻关计划项目(2004BA809B0402)
作者简介:李锋民(1975～ ),男 ,博士 ,主要研究方向为环境生物学.
＊通讯联系人 , E-mail:hyhu@t singhua.edu.cn
Effects of EMA on Activities of Algal Antioxidant Enzymes
LI Feng-min1 , 2 , HU Hong-y ing1 , MEN Yu-jie1 , HONG Yu1 , GUO Mei-ting1
(1.Environmental Simulation and Pollution Contro l State Key Joint Laboratory , Depar tment of Environmental Science and
Engineering , Tsinghua University , Beijing 100084 , China;2.College of Environmental Science and Engineering , Ocean University
of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:Using allelochemicals produced by macrophy tes to control harmful algae is a novel antialgal method.The present research
investigated effects of the species-specific antialgal allelochemical EMA on activities of antioxidant enzymes of Chlorella py renoidosa
and Chlorella vulagaris.The results show ed that 0.25mg/ L o f EMA increased activities of superox ide dismutase(SOD), peroxidase
(POD)and catalase (CAT) of C.pyrenoidosa and C.vulagaris.With the increase of EMA concentrations , activities of the 3
enzymes of C.pyrenoidosa decreased sharply.The activity of SOD of C.pyrenoidosa decreased to 0 w hen the EMA were 4mg/ L.
With the increase of EMA concentrations , activities of the 3 enzymes of C.vulagaris increased to as higher as 3～ 4 folders of that of
the control set.The results gave hints to elucidate the species-specific antialg al mechanisms of EMA.
Key words:allelo chemical;Chlorella pyrenoidosa ;Chlorella vulagaris;antioxidant enzymes
　　藻类暴发性生长产生的水华会造成水体缺氧 ,
某些藻类还会产生藻毒素 , 危及水生动物和人体健
康.因此 , 藻类控制成为环境领域的重要课题之一.
现有的藻类控制技术存在费用高 、难操作 、生态危害
大等缺陷 , 而限制了其广泛利用.利用水生植物产
生的化感物质抑制藻类的生长是一种高效 、安全 、易
操作的方法[ 1 , 2] .
化感物质是植物产生的次生代谢物质 , 可以通
过不同的途径释放到环境中影响其它生物的生长.
许多水生植物产生的化感物质能够抑制藻类的生
长 , 例如芦苇 、香蒲 、水盾草 、穗花狐尾藻 、金鱼藻 、
眼子菜 、菹草等[ 3～ 6] .现有利用水生植物化感物质
抑制藻类的研究主要集中在高抑藻能力水生植物的
筛选和抑藻化感物质的分离领域[ 1 ～ 6] , 已经分离出
多种具有抑制藻类能力的化感物质.但这些化感物
质抑制藻类的机理的研究鲜见报道.
生物在进化过程中形成了一套完整的抵抗外界
不良因素的抗氧化酶系统 , 主要的抗氧化体系酶有
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD)、过氧
化物酶(peroxidase , POD)、过氧化氢酶(catalase ,
CAT)等[ 7～ 10] .正常情况下抗氧化体系酶会消除过
量的氧自由基 ,使体内的氧代谢处于一个动态的平
衡中.但在外界胁迫下 , 植物体内会增加活性氧的
产量 ,使抗氧化体系不能及时清除这些活性氧.活性
氧可导致植物细胞内发生过氧化反应 ,尤其是脂质
过氧化反应 , 破坏细胞内膜系统 , 导致细胞被破
坏.植物细胞内的抗氧化体系酶可以受诱导产生.当
植物受到环境胁迫 , 细胞内氧自由基浓度上升时 ,
抗氧化体系酶活性也会上升;当细胞内氧自由基浓
度超过一定范围 , 抗氧化体系酶不能及时清除 , 过
量的氧自由基会导致抗氧化体系酶活性降低[ 11] .因
此 , 抗氧化体系酶活性可以间接反映植物细胞内活
第 27卷第 10 期
2006 年 10月 环　　境　　科　　学ENVIRONMENTA L SCIENCE
Vol.27 , No.10
Oct., 2006
DOI :10.13227/j.hjkx.2006.10.031
性氧的浓度.
前期研究从芦苇中提取出 1种具有选择性抑藻
能力的化感物质 EMA[ 12 , 13] , 该化感物质能强烈抑
制蛋白核小球藻的生长 , 但不能抑制普通小球藻的
生长.本实验研究了化感物质对藻类抗氧化体系酶
活性的影响 , 为揭示化感物质的抑藻机理提供
依据.
1　材料与方法
1.1　材料
藻类及培养条件:蛋白核小球藻(Chlorella
pyrenoidosa)和普通小球藻(Chlorella vulgaris)由中
国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供.试
验前预培养 4d , 使之处于对数生长期.藻类培养基
组分(mg/L):NaNO3 25.5 , NaHCO3 15 , K2HPO4
1.04 , MgSO4·7H2O 14.7 , MgCl2 5.7 , CaCl2·2H2O
4.41 , Na2EDTA·2H2O 0.3 , H3BO4 0.185 , MnCl2
0.264 , ZnCl2 3.27 × 10-3 , CoCl2·2H2O
0.78×10-3 , CuCl2 ·2H2O 0.009 ×10-3 , FeCl3
0.096 , Na2MoO4·2H2O 7.26×10-3.培养条件为:
光暗比 14∶10 , 温度 25℃.所有培养每天用血球计
数板在 16×40倍显微镜下计数.
化感物质:本课题组从芦苇中提取获得 , EMA
浓度为 10 g/ L[ 13] .
1.2　实验方法
500mL 的锥形瓶中加入 195mL 培养基 、5mL
预培养 4d 的藻种和化感物质溶液 0 , 0.5 , 1 , 2 , 4 ,
8mL ,即藻类培养液中化感物质的浓度为 0 , 0.25 ,
0.5 ,1 ,2 ,4 mg/L , 设置 3组平行样 , 继续培养 5d.
3 000r/min离心 5min , 藻细胞用于测定酶活性.藻
细胞分别加预冷至 4℃的 0.05 mol/L的磷酸缓冲液
(提取 SOD , CAT , POD的磷酸缓冲液 pH 分别为
7.0 , 7.0 , 5.5)和少量石英砂在 0 ～ 4℃冰浴中研
磨 , 匀浆液7 000r/min离心 10min , 取上清液即粗酶
液测定酶活性.
1.3　分析测定方法
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD;
EC1.15.1.1):采用 Giannopolitis 和 Ries 的 方
法[ 14 , 15] .2mL 反应介质包括:50 mmol/L(pH =
7.0)磷酸缓冲液 , 77.12 μmol/L氮蓝四唑(NBT),
0.1 mmol/L EDTA , 13.37 mmol/L 蛋氨酸 , 加
0.1mL 80.2 μmol/L 的核黄素溶液(用含 0.1
mmol/L EDTA 的 50 mmol/L pH=7.8的磷酸缓冲
液配制).于 560nm 测定吸光度值.
过氧化物酶(EC1.11.1.7):采用 Evans 的方
法[ 14 , 16] .反应体系为:1mL 2%H2O2 , 1mL 0.05
μmol/L愈创木酚 , 1mL 粗酶液 , 反应由加入启动 ,
25℃下测定 A470变化.
过氧化氢酶(catalase , CAT ;EC1.11.1.6):碘
量法测定[ 14] .
2　结果与讨论
2.1　化感物质对藻类 SOD活性的影响
在藻类培养开始时投加 EMA , 每 200mL 蛋白
核小球藻和普通小球藻培养液内所有藻细胞内
SOD活性(以吸光度表示)随培养时间的变化如图 1
和图 2所示.蛋白核小球藻对照组吸光度在第 0d时
为 0.008 , 至第 5d时达到 0.013 , 说明蛋白核小球
藻的总SOD随培养时间延长逐渐增加 , 这是因为
随着培养时间的延长 , 藻类生长 , 藻细胞不断增加
导致的.化感物质浓度为 0.25mg/L 时 , 培养至第
5d , 吸光度值达到 0.016 , 高于对照组.而其它更高
浓度下 , 吸光度都低于对照组.上述结果说明在不
考虑藻细胞数量因素的前提下 , 每 200mL 培养液
内 SOD总活性随着化感物质浓度的升高先上升后
降低 , 化感物质浓度为 0.25 mg/ L时达最高值.而
普通小球藻总 SOD的活性随培养时间的变化与蛋
白核小球藻不同 , 所有加入化感物质组的吸光度值
都高于对照组(图 2).
图 1　EMA对蛋白核小球藻 SOD活性的影响
Fig.1　Ef fect of the allelochemical on SOD activity of C.pyrenoidosa
考虑到藻类生长受 EMA抑制 , 单位体积培养
液中的藻细胞数不同 , 因此将培养至第 5d的藻类
计数 , 计算出单位藻细胞的 SOD活性 , 以 ΔA470/
(min·107cells)表示.图 3示出化感物质对蛋白核小
球藻和普通小球藻超氧化物歧化酶活性的影响.低
浓度的化感物质(0.25 mg/ L)对 2种藻的超氧化物
歧化酶活性都有促进作用 , 但随着化感物质浓度的
2092 环　　境　　科　　学 27 卷
图 2　EMA对普通小球藻 SOD 活性的影响
Fig.2　Ef fect of the allelochemical on SOD activity of C.v ulagaris
增加 ,蛋白核小球藻的SOD 活性逐渐降低.当化感
物质高于0.5 mg/L时 , 蛋白核小球藻的 SOD活性
已经低于对照组.化感物质浓度为 4 mg/L时 , 蛋白
核小球藻 SOD活性已经为 0.高浓度的化感物质使
蛋白核小球藻 SOD活性降低 , 已经不能除去多余
的活性氧.但所有加入化感物质的普通小球藻的
SOD活性大约为对照组 SOD活性的 3倍 , 说明化
感物质提高了普通小球藻的 SOD活性.这保证了普
通小球藻能及时清除细胞内多余的活性氧 , 因此 ,
EMA 不能抑制普通小球藻.
图 3　EMA 对蛋白核小球藻和普通小球藻 SOD活性的影响比较
Fig.3　Effect of the allelochemical on SOD activity of C.pyrenoidosa
and C.vulagaris
2.2　化感物质对藻类 POD活性的影响
化感物质对蛋白核小球藻和普通小球藻过氧化
物酶(POD)活性的影响如图 4所示.低浓度的化感
物质(0.25 mg/L)对 2种藻的 POD活性都有促进 ,
此时蛋白核小球藻的 POD活性约为对照组的 2倍 ,
但随着浓度逐渐增加 , 蛋白核小球藻 POD 活性逐
渐下降.而普通小球藻的 POD活性随着化感物质浓
度的增加则继续升高 , 当化感物质浓度为 4 mg/L
时 , 其 POD活性达到对照组的 4.2倍.
图 4　化感物质对蛋白核小球藻、普通小球藻 POD 活性的影响
Fig.4　Ef fect of the allelochemical on POD activity of
C.pyrenoidosa and C.vu lagar is
2.3　化感物质对藻类 CA T 活性的影响
化感物质对 2种藻过氧化氢酶(CAT)的影响规
律与其对 SOD 、POD 的影响规律相类似(图 5).低
浓度的化感物质对藻类的 CAT 活性有促进 , 高浓
度的化感物质显著降低了蛋白核小球藻的 CAT 活
性 , 但化感物质浓度较高时普通小球藻的 CAT 活
性仍能保持在对照组的 4倍左右.
图 5　化感物质对蛋白核小球藻 、普通小球藻CAT活性的影响
Fig.5　Effect of the allelochemical on CAT activity of
C.pyrenoidosa and C.vu lagar is
在外界胁迫下 , 植物体内会增加活性氧如超氧
物阴离子自由基(O·-2 )、过氧化氢(H2O2)、氢氧自
由基(·OH)、单线态氧(1O2)的产量.这些自由基能
参与叶绿体的降解 , 降低抗坏血酸含量及抗坏血酸
过氧化物酶活性 , 导致膜脂过氧化.某些自由基与
光合色素的漂白及膜脂过氧化作用密切相关 , 在细
胞内1O2能与许多大分子物质发生反应 , 从而破坏
细胞的正常生长与繁殖.生物在进化过程中形成了
一套完整的抵抗外界不良因素的抗氧化系统 , 在一
定范围内能消除细胞内因环境压力存在而产生的自
由基 , 从而起到保护细胞的作用.
209310 期 环　　境　　科　　学
本实验的结果显示 , 低浓度化感物质使藻类
SOD 活性升高 , 而高浓度化感物质使蛋白核小球
SOD活性下降.这是因为低浓度的化感物质改变了
藻细胞内的活性氧代谢平衡 , 增加了活性氧的积
累 , 致使体内抗氧化系统机能应激加强 , 以清除体
内过多的活性氧.这一结果与其它金属 、有机物及干
旱等使植物体内 SOD活性增加的结果相似[ 11] .而
高浓度的化感物质使蛋白核小球藻 SOD活性下降 ,
说明当 O·-2 的产生速率大于 SOD 活性增加速率
时 ,O·-2 及其产物的毒性超过了 SOD 的清除能力 ,
并使 SOD酶系遭到破坏从而降低了活性.而普通小
球藻体内 SOD活性则不能被化感物质抑制.
低浓度的化感物质使 3种藻的 POD活性升高.
高浓度的化感物质抑制了蛋白核小球藻的 POD 活
性 , 却使普通小球藻 POD活性保持在较高值.
高浓度化感物质能使蛋白核小球藻的 SOD 、
POD 、CAT 活性降低 , 使细胞内活性氧得不到及时
清除.活性氧的积累可能会导致细胞内发生脂质过
氧化作用 , 并最终细胞结构被破坏 , 生长受到
抑制.
3　结论
抑藻化感物质 EMA对蛋白核小球藻和普通小
球藻抗氧化体系酶活性的影响表明 , 低浓度(0.25
mg/ L)的 EMA提高了 2种藻类的超氧化物歧化酶 、
过氧化物酶和过氧化氢酶活性;高浓度的 EMA显著
降低了蛋白核小球藻的抗氧化体系酶活性 , 而使普
通小球藻的抗氧化体系酶活性提高了 3倍以上.
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