全 文 ：· 论 著 ·
新疆紫草愈伤组织高效诱导及快速增殖研究
葛锋 ,王晓东 , 王玉春 ` (中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 ,北京 1翎80)
摘要 : 目的 高效诱导新疆紫草愈伤组织 ,并实现愈伤组织的快速增长 。 方法 用不 同的培养基及不 同的激素组合诱导外植
体形成愈伤组织 ;用不同的蔗糖浓度和激素浓度研究愈伤组织 的生长 。 结果 快速诱导愈伤组织的条件为 : 直接将种子 (去
皮 )消毒后接种于改良N6 培养基 , 添加激素 NAA o . 4 mg · L一 ` + 2 , 4一 D 0 . 2 mg · L 一 ` 十 KT 1 . o mg · L 一 ’ ,声值 5 . 6 , 温度 25 ( C , 暗培
养。 愈伤组织的快速增长培养基为 : 改良 N6 培养基 , 添加 盯 l . o mg · L一 ’ , 蔗糖浓度 3% ,声值 5 . 6 , 25 ℃ , 暗培养。 结论 以
去皮种子为外植体是新疆 紫草愈伤组织高效诱导的关键 ,盯 的浓度对愈伤组织快速增长起决定性作用 。
关键词 : 新疆紫草 ;种子 ;诱导 ;愈伤组织
中图分类号 二R284 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1 一 2 494 (入兀瞬 ) 10 一 07 35 一 03
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1、 . 州便江H O D S hT e c翻 枷m ex p lan t of A刀 l e 6效 e “ 理少ior m 口 we er ind uc ed iw ht id fe 二 nt me id a s u lP e n l e n t曰 l 〔 life er nt ly l犯 5 of p lw t o ll o r -
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紫草是传统中药材 ,其根药用 , 含多种蔡醒类化合物 , 具
有显著的抗生育 、抗炎 、 抗肿瘤 、 杀菌抗病毒 、保肝和免疫调
节等作用〔’ 一 2〕。 中国药典中收录的中药紫草中 , 以新疆紫草
( A阴 e石么 。 故为八刀m Z )品质最佳川 , 为主要的商品紫草 。 新疆紫
草由于自然资源破坏严重 ,人工种植尚未成功 ,使其在市场
上供不应求。 为解决供需矛盾 , 通过组织和细胞培养技术 ,
在培养过程中大量积累有效药用成分或通过体胚快繁种植
都是行之有效的途径 。 国内的李国凤等闭 、 计巧灵等「, 一 6 j先
后以子叶 、 叶 、 根茎和根为外植体诱导出愈伤组织 ,但诱导周
期较长 ,一般需 45 d 。 我们以种子为材料 , 详细研究 了种子
的萌发条件 ,从去皮种子直接出发诱导愈伤组织 ,诱导周期
缩短为 25 d ,诱导率达 81 % , 而且继代稳定 ,增殖迅速 。 高质
量 、快速的愈伤组织诱导和增殖为通过新疆紫草大规模细胞
培养生产有效次生代谢物奠定良好的基础 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
新疆紫草〔A n le石她 。 “ d 诬几〕naI ( R O y ! e ) 1 0 ll n s t」种子采 自新疆
和静县巴音布鲁克 。 经中国科学院植物研究所郭仲深研究
员鉴定为新疆紫草种子 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 新疆紫草种子的萌发 在体视显微镜下 , 去除种皮 ,
用去离子水漂洗 3 次 ,充分润湿种子表面 , 去除浮起的种子 ,
用 75 % 的乙醇和 2% 的次氯酸钠溶液先后对剥去种皮的新
疆紫草种子进行表面消毒 , 把经消毒处理的种子接种到无激
素的 MS 固体培养基上 , 找出萌发率最高 、 染菌率最低的组
合 , 确定最佳的消毒处理步骤 。 每次乙醇处理后 , 种子用无
菌水清洗 3次 , 次氯酸钠处理后用无菌水清洗种子 5 次 。
1
.
2
.
2 外植体愈伤组织的诱导 将种子萌发的无菌苗各部
(子叶 、 叶 、根 )切成 5 ~ 左右的小块 , 连同去种皮的种子分
别接种于装有 50 ntL 固体培养基 (添加各种激素 )的 l o mL
基金项 目 : 国家 “ 十五 ” 科技攻关 ( 2以 ) I B7A 0l 1A 0)
作者简介 :葛锋 ,男 ,博士生 ` 通讯作者 : 王玉春 ,男 ,研究员 ,博士生导师
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中国药学杂志 2X( 又 年 10 月第 39 卷第 10 期
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: ( 0 10 ) 82 62 70 59 Fax : ( 0 10 ) 6 25 6 182 2 -E I I画 1: 罗企 n g @
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三角瓶中。 培养温度 25 ℃ ,暗培养。
1
.
.2 3 愈伤组织快速增长培养基的研究 有研究表明 ,在
众多的植物激素中 ,酬噪乙酸 ( L七气)和激动素 (KT )对愈伤组
织的生长影响相对较大 , 因此本实验以蔗糖为碳源 , 认 A 和
盯为生长调节因子 ,做三因素三水平的正交实验 ,确定最佳
蔗糖浓度 ,最佳激素浓度组合。 使用 10 毗 三角瓶 ,每瓶装
固体培养基 50 mL , 愈伤组织接种量为每瓶 0 . 7 9 ,培养温度
25 ℃ , 暗培养。 正交表中每个实验重复 3 次 ,所得结果为 3次
实验的平均值 。
2 结果和讨论
.2 1 新疆紫草种子的萌发
种子接种 % h 后 ,观察染菌情况和萌发情况 ,实验中用
乙醇处理 20 5 的种子部分染菌 ,而用乙醇处理 30 ; 的没有染
菌现象 ,但乙醇处理时间过长 ,会损伤种子 ,使萌发率下降 ,
所以 20 5 的处理时间是比较合适的 。 随着次氯酸钠处理时
间的的延长 ,染菌率下降 , 萌发率提高 ,当次氯酸钠处理时间
为劝 而 n 时 , 有 86 . 7% 的种子无菌萌发 。 如次氯酸钠处理时
间超过 20 而 n ,会对种子产生损害 ,萌发率下降 , 见表 l 。
表 1 乙醇和次氯酸钠对去种皮种子的消毒处理
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乙醇处理
时间s/
次抓酸钠处理
时间 / ~
接种种
子数 染菌数
无菌萌
发数
无菌萌发率
/ %
进行暗培养 ,见表 3 。 子叶在 6 号培养基上形成黄白色 、半透
明 、质地紧密的愈伤组织 。 其过程为 :伤口处脱分化 ,产生愈
伤团 , 随后叶变厚 , 表面凸 凹不平 , 表皮撑破 ,组织愈伤化 。
上述变化大约需要 4 周 ,找出不同外植体诱导率最高的培养
基 ,见表 4 。 在 6 号培养基上 ,子叶切段愈伤组织诱导率为
62 % ;种子在 5 号培养基上愈伤组织诱导率达 81 % , 25 d后
可形成白色愈伤团 ,并且继代稳定 , 增殖快 , 25 d鲜重可 以增
加 14 倍左右。 这可能是由于种子细胞分化程度相对较低 ,
脱分化容易 ,细胞分裂旺盛。 叶在伤口处首先形成小的愈伤
团 ,但增殖速度相当缓慢 。 根部较难脱分化形成愈伤组织 ,
诱导率很低。
表 3 不 同种类和浓度的激素对愈伤组织诱导
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表 4 各部分愈伤组织的诱导率
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接种部位 培养基编号 接种块数 愈伤组织发生数 诱导率 / %
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吸.且月.生且,几ù、é`U沪O弓ó种子
于叶 :;
叶根
.2 4 碳源和不同激素浓度对愈伤组织增长的影响
2
.
4
.
1 正交实验将由新疆紫草种子诱导出的愈伤组织接种
到含不同激素浓度和碳源浓度的培养基上 ,选取蔗糖为碳源
以及 认 A ,盯两种激素 ,共 3 个因素 , 每个因素取 3 个水平。
选用 场 (34 )正交表 ,考察各因子对愈伤组织生长的影响 , 见
表 5 。 正交表中的每个实验重复 3 次。
表 5 蔗糖和不同激素正交实验结果
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实验号 蔗搪 / % 刀以以 n哪 . L 一 ’ 姗叱一 ’ 空白 鲜重增长倍数
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.2 2 不同基本培养基诱导种子愈伤组织
将新疆紫草的种子剥去种皮 , 进行消毒处理 , 然后接种
到 4 种不同的基本培养基上 ,均添加 2 ,今二氯苯氧乙酸 (2 ,今
)D 0
.
2 gm
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一 ` ,盯 1 . o gm · L 一 ` , 比较愈伤组织的形成情况 ,见
表 2 。 从表 2 可以看出 , 只有在 MS ,玲 和改良 N6 培养基上能
够产生愈伤组织 ,但诱导效率相差很大 。 而 5B 培养基上未
见愈伤组织 。 改良 N6 培养基诱导效率最高 ,达 50 % ,表明改
良 N6 是较适合的基本诱导培养基 。
表 2 不同培养基上种子愈伤组织的发生率
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培养基 接种种子数 愈伤组织数 愈伤组织发生率 / %
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.2 3 不 同培养基上愈伤组织的诱导
将新疆紫草的消毒种子 (去种皮 ) , 以及由种子萌发的无
菌苗的各部 (包括根 、子叶 、 叶 ) ,接种于含不同种类及不同浓
度激素 [蔡乙酸 ( N AA ) , 2 ,今D , KT 」的改良 N6 固体培养基上 ,
·
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2
.
.4 2 极差分析 由表 5 的极差可知 ,新疆紫草愈伤组织继
代培养的最佳培养基为 : 改良 N6 培养基 , 添加 3% 的蔗糖 ,
Kr 浓度为 1 . o gm · L 一 ` ,不需要添加 u 的 ,这与叶和春等 [,l 的
研究结果不一致 ,与方德秋等 s3[ 的报道也不同。对实验所得
中国药学杂志 2X( 拜 年 10 月第 39 卷第 10 期
规范化种植穿心莲药材 H P L C指纹图谱研究
祝晨碟 , 莫建霞 (广州中医药大学新药开发研究中心 , 广东 广州 51哪 )
摘要 : 目的 为规范化种植穿心莲药材质量研究提供新的基础研究资料 。 方法 川兀田〕 !兀 建立 穿心莲指纹图谱 , 并进行不同种
植基地 (产地 )与商品药材 、 不 同生长期 、 不同药用部位指纹图谱的比较 , 采 用计算机辅助 的相似度评价软件进行相似度评价 。 结
果 在选定的 色谱条件下 , 2 26 nl 检测波长下的 巧 个峰构成穿心莲药材的指纹特征 , 各批次样品指纹 图谱均具有上述特征 ,但
特征峰的相对含量分布差异导致色谱概貌存在一定差异 。 计算机辅助相似度评价 , 5 个规范化种植基地产穿心莲药材指纹特征
相互 间较为吻合 , 具有较好的一致性 , 商品药材则差异较大 。 不同生长期药材指纹图谱也具有较好的一致性 , 多数特征峰含量呈
现随生长期而增加的动态累积过程 , 不 同部位则特征峰的含量分布叶中大大高于茎 。 结论 实行规范化种植对于保证药材质量
的稳定性具有重要的意义 ,所建立的方法可较全面地反映穿心莲药材多成分特征 ,并进行药材质量评价 。
关键词 : 穿心莲 ;指纹图谱 ;质量研究
中图分类号 : R284 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1 一 24 94 (2X( 只 ) 10 一 田 37 一 03
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.
的最佳条件进行验证实验表明 , 以上结论可信。
.2 .4 3 方差分析 对表 5 进行方差分析 , 见表 6 。 由表 6 可
知 , L今A 和 KT 浓度对愈伤组织的增长影响是显著的 , 实验发
现 M A的存在对愈伤组织增长不利 , 而 KT 则起着决定性作
用 。 蔗糖的影响不显著 , 我们取 3 % 的蔗糖浓度较经济。
表 6 方差分析
T a b ` A ll a ly is s of v丽an ce
方差来源 平方和 S 自由度 均方 S F 值 显著性
蔗糖 伙铭4 8 2 0 . 24 2 4
认 A 17 . 286 8 2 8 . 翻 3 4 7 . 7 显 著
KT 25
.呜角 3 2 12 .勺25 2 1 4 显著
误 3 . 98 4 2 1 .望洲 2
误 4 47 3 2 4 1 . 1 18 3
注 : 0F 95 (2 , 4 ) 二 6 . 94 , 凡 卯 (2 , 4) 二 18 . 0
Noet
: 凡 仍 (2 , 4 ) 二 6 . 94 , F住男 ( 2 , 4 ) 二 1 8 . 0
3 结 论
新疆紫草愈伤组织快速诱导条件为 : 直接以种子 (去种
皮 )为外植体 ,经表面消毒后接种于改良 N6 培养基 , 添加激
素 N从 0 . 4 哪 · L 一 ’ + 2 , 4 一 D 0 . 2 畔 · L一 ’ + 盯 2 . 0 毗 · L 一 ` , p H
值 5 . 6 ,温度 25 ℃ ,暗培养 。 愈伤组织的快速增长培养基为 :
改良N6 培养基 , 添加 盯 1 . o mg · L一 ’ , 蔗糖浓度 3% , 州值
5
.
6
,
25 ℃ ,暗培养 。 KT 的浓度对愈伤组织增长起关键作用 ,
实验发现 ,在光照下 , 愈伤组织的生长仅比暗培养条件下稍
慢一些 , 这与叶和春等叫认为的光照减慢愈伤组织增殖至少
印 % 的研究结果不同 ,可能是由于诱导愈伤组织的外植.体以
及诱导培养基的不同所致 , 其机制有待进一步研究 。 使用比
色法圈对愈伤组织有效成分进行定量测定 , 其紫草素及其衍
生物的含量已经超过天然药材的 2倍 。
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92 7
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.
(收稿日期 : 2X() 3一 1-0 1一)
基金项目 :广东省科技计划项目 ( 3A 0l OZO101 )
作者简介 :祝晨藻 ,女 , 博士 ,研究员 eT l : (。2。 ) 3 33 52 例巧
中国药学杂志 2以M 年 or 月第 39 卷第 or 期
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