全 文 ：高压氧对短暂前脑缺血小鼠
海马半胱天冬酶-3表达的影响
首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心　刘天会生物化学与分子生物学系　陈　瑞
提要:旨在通过测定缺血再灌注时半胱天冬酶-3(caspase-3)的表达以及高压氧对表达的影响 , 从细胞凋亡的角度探讨
高压氧治疗脑缺血的分子生物学机制。将 C57BL/ 6N 小鼠分为假手术组(正常对照组)、缺血再灌注组(I/ R组)及缺血再灌
注加高压氧治疗组(HBO 组), 后 2 组夹闭双侧颈总动脉 20 min 后再通血流 ,建立脑缺血再灌注模型 ,分别于再灌注 6 h 、12
h、24 h和 48 h 取海马。采用半定量反转录-PCR 及蛋白免疫印迹(Western Blo tting)方法分别检测 caspase-3 在转录水平
(mRNA)及翻译水平的表达变化。结果:各 I/ R组及 HBO 组海马中 caspase-3 m RNA及酶原表达水平与假手术组相比均有
明显升高 ,且差异有统计学意义(P <0.05);各 I/ R组与相应时相点 HBO 组 caspase-3 m RNA 及酶原表达水平相比差异均
无统计学意义(P>0.05)。提示:脑缺血再灌注损伤诱发 caspase-3 转录水平增加 , 而且这是引起其酶原增加的主要原因;
caspase-3 介导的细胞凋亡参与了缺血再灌注损伤;本实验中所采用的 HBO 治疗方案对 caspase-3 转录及酶原水平无明显
作用。
关键词:脑缺血再灌注;高压氧;半胱天冬酶-3;表达
中图分类号:R 459.6;R 364.1;Q 556
　　缺血性脑卒中的病理生理过程分 2 个阶段导
致神经元死亡。第 1阶段为脑缺血早期细胞急性
坏死 ,是被动性死亡的过程。第 2阶段为迟发性神
经元死亡 ,是以神经元凋亡为主要病理特点的主动
性程序化死亡过程 ,主要发生在缺血半暗区域和缺
血再灌注后 。其中半胱天冬酶-3(caspase-3)是执
行凋亡的关键酶 。大量的研究显示 ,高压氧治疗可
减少动物及人的脑梗死范围 ,但其确切的机制仍不
清楚 ,且对其治疗效果尚存在一定争议 。本实验旨
在通过测定缺血时 caspase-3的表达以及高压氧对
其表达的影响 ,从细胞凋亡的角度探讨高压氧治疗
脑缺血的分子生物学机制 。
1　材料和方法
1.1　材料
试剂与仪器:发光剂及 caspase-3 多克隆抗体
购自美国 CST 公司;Trizol试剂为 Invitrogen 公司
产品;RT 试剂盒购自 Promega公司;PCR试剂盒
为 Takara 公司产品 。实验动物氧舱为上海
DWC150-300 型透明动物实验舱;电转移装置为
LKB公司产品;紫外凝胶成像分析系统为 Bio-Rad
公司产品;PCR仪为 Biometra公司产品 。
引物合成:caspase-3 引物(上游:5 AGT CAG
TGG ACT CTG GGA TC 3 ,下游:5 GTA CAG
TTC TT T CGT GAG CA 3 );GAPDH 引物(上
游:5 CAT CAC CAT CTT CCA GGA GC 3 ,下
游:5 GAT GAC CTT GCC CAC AGC CT 3 )。以
上引物均由上海生物工程公司合成。
1.2　动物分组与模型制作
实验用动物为 3级雌性C57BL/6N 小鼠 ,体质
量 18 ～ 22 g ,动物许可证号为 scxk(京)2002 —
2003。按随机数字表将 C57BL/6N 小鼠随机分为
9个组 ,每组 6只 。其中脑缺血再灌注组(I/R组)
和缺血再灌注加高压氧治疗组(HBO 组),根据再
灌注时间不同又各分为 6 h 、12 h 、24 h和 48 h 4个
时相点组;另有 1组为假手术组 ,即对照组 。
夹闭双侧颈总动脉 20 min后再通血流 ,即为
前脑缺血再灌注模型。假手术组同样手术 ,但不夹
闭颈总动脉。高压氧治疗方案为:纯氧洗舱 5 min
※升压 5 min ※稳压 0 .2 MPa(2 个绝对大气压 ,
2ATA)45 min ※缓慢降压 15 min ※出舱 。6 h
HBO组 、12 h HBO组 、24 h HBO 组 、48 h HBO 组
在术后 2 h治疗 1次 , 24 h HBO 组 、48 h HBO组再
灌注 20 h进行第 2次治疗 , 48 h HBO组再灌注 44
h进行第 3次治疗 。 I/R组与 HBO 组分别于再灌
注 6 h 、12 h 、24 h和 48 h断头处死 ,假手术组于 24
h 后断头处死 。分离海马后 -70 ℃冰箱保存
待检 。
1.3　半定量 RT-PCR测定 caspase-3 mRNA
提取海马总 RNA后进行 RT-PCR反应;PCR
2005 年　2 月
第 26 卷　第 1 期
首 都 医 科 大 学 学 报
Journal of Capital University of Medical Sciences
Feb.2005
Vol.26　No.1
收稿日期:2004-07-05
北京市教委科技发展计划基金(00KJ108)资助项目
产物电泳后经扫描并分析结果 ,以 caspase-3与同
一样品内对照管家基因 GAPDH 产物量的比值表
示此样品 caspase-3 mRNA近似含量 。
1.4　蛋白免疫印迹检测 caspase-3酶原
分别提取各组海马总蛋白后用 12 %SDS-聚
丙烯酰胺凝胶电泳※转膜※caspase-3多抗杂交※
化学发光※X 线胶片感光 ,扫描并以 BandScan软
件进行分析 ,以光密度(IOD)值表示各组的蛋白相
对表达量 。
1.5　统计学方法
采用 SPSS 11.5统计软件 ,数据以均数±标准
差( x ± s)表示 , 组间均数比较采用 One way
ANOVA检验。
2　结果
与假手术组相比 ,各 I/R组和 HBO 组 mRNA
水平均有明显升高 , 且差异有统计学意义(P <
0.01);各 HBO组与相应时相点的 I/R组比较 ,12
h HBO 组比 12 h I/ R组 caspase-3 mRNA 水平略
有降低 ,但差异均无统计学意义(P >0 .05)。结果
见图 1 、表 1。与假手术组相比 ,各 I/ R组与 HBO
组 caspase-3酶原均有明显升高 ,且差异具有统计
学意义(P <0 .05 , P <0 .01);各 HBO与相应时相
点的 I/R组比较 , 6 h 和 12 h HBO 组比相应时相
点 I/R组 caspase-3酶原水平略有降低 ,但各时相
点的差异均无统计学意义(P >0 .05)。结果详见
图 2 、表 2 。
图 1　各组小鼠海马 caspase-3 RT-PCR结果
Fig 1　RT-PCR analysis of caspase-3 mRNA in each group
0 Marker;1 sham-operated;2 6 h I/R;3 12 h I/R;4 24 h I/R;5
48 h I/R;6 6 h HBO;7 12 h HBO;8 24 h HBO;9 48 h HBO.
3　讨论
caspase-3是神经元凋亡下游的一种重要蛋白
酶 ,它水解一系列关键底物 ,使神经元凋亡解体 。
图 2　各组小鼠海马 caspase-3 Western blotting结果
Fig 2　Western blot analysis of caspase-3
protein in each group
1 sham-operated;2 6 h I/R;3 12 h I/R;4 24 h I/R;5 48 h
I/R;6 6 h HBO;7 12 h H BO;8 24 h HBO;9 48 h HBO.
表 1　各组各时相点 caspase-3 mRNA含量■
Tab 1　Expression of caspase-3 mRNA in each group■
x±s
Reperfusion
t ime points
I/R group
(n=6)
HBO group
(n =6)
Sham-operated
group(n =6)
6 h 3.22±1.00＊＊ 2.53±0.58＊＊
12 h 4.72±1.65＊＊ 3.06±0.84＊＊ 0.96±0.05
24 h 4.73±1.74＊＊ 5.13±1.27＊＊
48 h 3.46±1.03＊＊ 3.41±1.04＊＊
■T he ratio of caspase-3 mRNA to GAPDH mRNA
represent the relative expression of caspase-3 mRNA ,
＊＊ P<0.01 com pared w ith the sham-operated group.
表 2　各组各时相点 caspase-3 酶原含量■
Tab 2　Expression of procaspase-3 protein in each group■
x±s
Reperfusion
t ime points
I/R group
(n =6)
HBO group
(n =6)
Sham-operated
group(n =6)
6 h 8 701.7±2 781.4＊ 6 310.0±1 505.5＊
12 h 7 560.4±2 036.8＊ 6 279.1±1 472.8＊ 3 825.8±155.6
24 h 7 812.0±1 625.1＊＊ 7 849.2±2 378.9＊
48 h 7 401.0±2 091.8＊ 9 142.9±2 378.7＊＊
　　■T he IOD value represent the relat ive expression of
procaspase-3 protein , ＊ P <0.05 , ＊＊ P <0.01 compared
with the sham-operated group.
在脑缺血损伤后 , caspase-3蛋白表达量及蛋白酶活
性明显增加 ,这一点在不同的脑缺血及脑缺血再灌
注模型中已经得到印证[ 1 ～ 4] 。也有大量文献报道
不仅在蛋白水平 , caspase-3 mRNA 的水平也明显
上调 ,说明缺血及再灌注刺激可以诱发 caspase-3
转录水平增加[ 5 ,6] 。
在本实验中 ,各 I/R组 caspase-3 mRNA 与假
手术组相比 ,再灌注 6 h时已经明显升高 , 12 h 时
继续升高 ,24 h达到高峰 ,48 h略有下降 , caspase-3
mRNA水平与再灌注时间有一定相关性 ,这一点
与文献报道一致[ 5 ,6] 。Caspase-3 mRNA水平的显
著升高说明在本缺血模型中缺血再灌注刺激诱发
caspase-3 转录水平上调 , 从而诱发神经元凋亡 。
Caspase-3酶原变化趋势与 mRNA 水平的变化基
本一致 ,提示转录水平的增加是导致酶原增加的主
要原因;但蛋白变化程度较 mRNA变化小 ,说明在
转录后可能还存在一些其他的调控过程。
虽然有大量的实验及临床数据表明HBO治疗
60 首 都 医 科 大 学 学 报 第 26 卷
缺血性脑血管疾病有明显的效果[ 7 ～ 10] ,但对于
HBO 对缺血再灌注性损伤的治疗效果仍存在很大
争议 。本实验中 HBO治疗后虽然在6 h和 12 h组
caspase-3 mRNA及 6 h 组的酶原水平比相应时相
点 I/R组低 ,但差异均无统计学意义(P >0.05)。
结果表明本 HBO 治疗方案对 caspase-3 参与的神
经元凋亡没有明显治疗作用;而有不少文献表明
HBO 治疗可以抑制神经元凋亡[ 11～ 13] ,另外也有文
献显示HBO治疗并未产生明显效果或可出现双向
治疗效果[ 14 ,15] 。治疗效果的巨大差异可能与治疗
方案及缺血再灌注模型的不同有关 。
高压氧治疗是一个多因素 、多阶段的复杂过
程 ,高压氧可能不仅仅通过 caspase-3这一机制发
挥治疗作用 。另外脑缺血持续的时间对于再灌注
损伤的程度及预后是至关重要的 ,当缺血引起神经
元胞膜去极化且不能复极时 ,即触发损伤机制 。如
果缺血去极化的时间很短暂 ,接下来的再灌注不仅
可以使神经元存活 ,还可以对继之更为严重的缺血
产生耐受 ,即缺血预适应 。中等长度的缺血去极化
之后的再灌注 ,可使神经元部分恢复功能 ,但数小
时后会发生再灌注损伤 。
本模型中缺血时间为 20 min ,属于中等长度
的缺血去极化 ,再灌注效应主要以损伤为主 。缺血
再灌注损伤导致线粒体功能障碍 ,不能正常消耗所
施加的高压纯氧用于供能 ,反而产生大量自由基 ,
并对细胞生物膜 、蛋白及核酸产生损害作用 ,这可
能是本治疗方案没有明显效果的原因。治疗次数
过少也可能是无效的原因之一。
今后可以通过增加观察时间与高压氧治疗次
数或减少缺血时间 ,进一步验证高压氧的治疗作
用。还可以增加样本量 ,消除因个体差异可能引起
的误差 ,以便使研究结果更加科学可靠 。
参　考　文　献
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61　第 1 期 刘天会等:高压氧对短暂前脑缺血小鼠海马半胱天冬酶-3 表达的影响
Hyperbaric Oxygen on Expression
of Caspase-3 in Mouse Hippocampus
after Transient Forebrain Ischemia
Liu Tianhui
Department of L iver Center , Beijing Friendship Hospital ,
Af f il iate of Capi tal Universi ty of Medical Sciences
Chen Rui
Department of Biochemistry and Molecular Biology , Capital University of Medical Sciences
Abstract:This study w as to observe the effect of hyperbaric oxygen (HBO)on the expressions of
caspase-3 in hippocampus follow ing transient forebrain ischemia , and to find out the possible mechanism of
HBO treatment.C57BL/6N mice were divided into three g roups:sham -operated g roup (control), ischemia/
reperfusion(I/R)g roup and HBO treatment af ter I/R group.Transient forebrain ischemia was induced by
bilateral common carotid artery occlusion for 20 min .Hippocampus w as obtained at reperfusion t ime points of
6 h , 12 h , 24 h and 48 h respectively af ter 20 min of ischemia.RT-PCR was used to detect the expression of
caspase-3 mRNA , and Western Blot ting was used to detect the level of caspase-3 protein .Experimental data
showed that caspase-3 mRNA and procaspase-3 level increased in hippocampus in I/R groups and HBO
groups.The difference w as significant(P <0.05)when compared w ith expression levels in sham-operated
mice.There w as no significant alteration in expression levels betw een every I/ R group and HBO treatment
g roup of co rresponding time point(P>0 .05).These data indicate that ischemia/ reperfusion w hich induces
caspase-3 mRNA expression and increases t ranscription of caspase-3 is the mean reason for procaspase-3
increase.Caspase-3-dependent apoptosis is involved in ischemia/ reperfusion injury .The HBO treatment
project has no significant effect on caspase-3 mRNA and procaspase-3.
Key words:cerebral ischemia/ reperfusion;hyperbaric oxygen;caspase-3;expression
62 首 都 医 科 大 学 学 报 第 26 卷