全 文 ：第 2卷第 3期
2007年 9月
生 态 毒 理 学 报
Asian Journal of Ecotoxicology
Vol. 2, No. 3
Sep. 2007
收稿日期:2007-03-23 录用日期:2007-04-24
基金项目:国家自然科学基金项目 (No. 40471118) ;国家自然科学基金委与广东省联合基金项目 (No. U0633006)
作者简介:聂湘平 (1966—) ,男,博士,副教授;*通讯作者 (Corresponding author) ,E-mail: txpnie@jnu.edu.cn; Tel: 020-85225808
诺氟沙星(Norfloxacin)对蛋白核小球藻(Chlorella
pyrenoidosa)生长及抗氧化酶活性的影响
聂湘平 *,鹿金雁,李潇,杨宇峰
暨南大学水生生物研究所,广州 510632
摘要:以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为实验材料,研究了喹诺酮类药物诺氟沙星(Norfloxacin, NFLX)对小球
藻生长及抗氧化酶活性的影响.结果表明,NFLX对小球藻的 96h EC50为 30.78mg·L-1,属于低毒. NFLX暴露对小球
藻谷胱甘肽硫转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT)具有显著影响,当 NFLX浓度高于 30mg·L-1时,小球藻 GST活性受
到显著诱导,并随 NFLX浓度增加而显著升高,而小球藻 CAT活性随 NFLX暴露浓度的升高表现出先诱导后抑制现
象. NFLX对谷胱甘肽(GSH)和 7-乙氧基-异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)的影响较弱.在低浓度 NFLX暴露下,GST和
CAT可作为 NFLX暴露的生物标记物.
关键词:蛋白核小球藻;诺氟沙星;急性毒性;抗氧化酶活性
文章编号:1673-5897(2007)3-327-06 中图分类号:Q949.2,R978.1,X 71.5 文献标识码:A
Toxic Effects of Norfloxacin on the Growth and the Activity of Antioxidase
of Chlorella pyrenoidosa
NIE Xiang-ping*, LU Jin-yan,LI Xiao,YANG Yu-feng
Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632
Received 23 March 2007 accepted 24 April 2007
Abstract:Chlorella pyrenoidosa was chosen as the test material to study the toxic effects of Norfloxacin on algae by acute
toxicity test and a battery of biochemical parameters such as EROD, GST and CAT enzymes activities of algae in this research.
The results showed that the 96h EC50was 30.78mg·L-1in NFLX exposure, NFLX was low-toxic to Chlorella pyrenoidosa. The
activities of Glutathione S-transferase(GST) nd catalase(CAT)had sensitive responses to the exposure of NFLX. CAT was
induced at initial stages and inhibited gradually with the rising of NFLX concentration; while GST was induced significantly
when exposed to over 30mg·L-1NFLX and increased continuously with the rising of NFLX concentration. The activities of
Glutathione(GSH)a d 7-ethoxyresorufin-O-deethylase(EROD)had slight variances among different treatments groups. CAT and
GST may act as the potential biomarkers of NFLX exposure at low concentration to Chlorella pyrenoidosa.
Keywords:Chlorella pyrenoidosa;Norfloxacin;acute toxicity test;antioxidase activity
生 态 毒 理 学 报 第 2卷
1 引言(Introduction)
随着我国水产养殖业的迅速发展,养殖病害
日趋严重,渔用药物在降低发病率和死亡率等方
面发挥了巨大作用.但由于渔药市场管理混乱、
养殖过程中滥用或误用渔药现象普遍存在,由此
带来的水产品质量及生态安全问题越来越引起人
们的重视.长期频繁使用抗生素所产生的药物残
留、耐药性微生物的增长以及对非靶生物的损伤
等问题,严重制约着水产业的健康可持续发展(王
冉等,2006).目前,抗生素药物引起的药物残留
及微生物耐药性已有大量的文献报道(吉彩霓等,
2005;罗晓燕等,2005;李兆新等,2001),但关于抗
生素药物对非靶生物的影响还缺乏足够的重视.
喹诺酮类药物具有广谱、高效、毒副作用小以
及不易产生耐药性等特点,在水产养殖中被广泛
使用.其中,诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)是喹诺
酮类抗菌药物的代表品种.Vaccaro等(2003)研究
表明鱼类生物体在代谢喹诺酮类药物的过程中产
生一些具有亲电子活性的中间产物,可能诱导生
物体内抗氧化酶活性的变化.藻类是水生生态系
统的初级生产者,也是水生生态毒理学重要的研
究对象之一.藻类与其他水生生物的关系十分密
切,然而抗生素药物残留对藻类的影响以及藻类
在吸收代谢这类药物过程中是否会发生抗氧化酶
活性变化目前还未见报道.
本研究就 NFLX对小球藻的毒性及其对小球
藻抗氧化酶活性的影响进行了探讨,评价了谷胱
甘肽硫转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘
肽 (GSH) 和 7-乙 氧 基 -异 吩 唑 酮 -脱 乙 基 酶
(EROD)对这类药物的响应及其作为喹诺酮类药
物生态毒性评价标记物的适用性.
2 材料与方法(Materialsandmethods)
2.1 藻种
蛋白核小球藻(Chlorelapyrenoidosa)取自暨
南大学水生所藻种室,采用水生 4号培养基培养,
pH7.6,温度(24±1)℃,光强 4000Lx,光暗比 12h:
12h.实验容器为 500mL三角瓶,培养体积 200mL.
藻类接种初始密度 5×105个·mL-1,每天人工摇动
3次以上,每次 10min.隔 96h移种 1次,反复 3次
以上,使之达到同步生长阶段.每次移种前进行
显微镜观察,检查实验藻液是否被污染.
2.2 试剂
NFLX为分析纯,购自浙江华义医药有限公司.
2.3 急性毒性实验方法
NFLX用 4%NaOH助溶,再用 5%HCl调 pH
至 7.0~8.0,NFLX母液浓度为 1000mg·L-1,设 0、
7.5、15、30、60、120mg·L-16个梯度,每个处理设
3组重复,于 0、24、48、72、96h后定时取样,用血
球计数板计数细胞密度,同时采用比色法(李合
生,2000)测定叶绿素 a含量.
采用生长面积法 (国家环保局,2002) 计算
96hEC50,计算公式如下:
A=(N1-N0)/2×t1+(N1+N2-2N0)/2×(t2-t1)+⋯ +
(Nn-1+Nn-2N0)/2×(tn-tn-1) (1)
其中:A:生长曲线以下面积;tn:实验开始后
第 n次计数时间;N0:初始细胞密度;Nn:tn时刻细
胞密度.
生长抑制率(IA)通过以下公式计算:
IA=(Ac-At)/Ac (2)
IA:受试组与对照组相比细胞生长抑制率;Ac:
对照组生长曲线以下面积;At:受试组浓度生长曲
线以下面积.
以 IA为纵坐标,浓度对数为横坐标作图,IA=
50%所对应的浓度即为 EC50值.
叶绿素 a的计算公式如下:
叶绿素 a=11.64×(OD663-OD750)-2.16×
(OD645-OD750)+0.1×(OD630-OD750) (3)
OD630、OD645、OD663、OD750分 别 为 藻 液 在 630、
645、663和 750nm下的吸光值.
2.4 酶活性测定
暴露 96h后,分别取一定量藻液于 6000rpm离
心 20min,弃去上清液,藻泥冷冻在-80℃冰箱待
测.测 定 时 将 离 心 所 得 藻 泥 再 悬 浮 于 1.5mL、
0.1mol·L-1、pH7.8的磷酸缓冲液中,超声波破碎
10min,镜检至无完整细胞为止,10000rpm离心
20min,上清液为粗酶液.
蛋白及 CAT的测定均参考 《植物生理实验》
(郝再彬等,2004).蛋白测定采用考马斯亮兰法;
CAT测定采用紫外吸收法,其中以 1min内 A240减
少 0.1的酶量为一个酶活单位 (U);GSH采用
DTNB显色法测定;GST采用南京建成生物公司的
328
聂湘平等:诺氟沙星 (Norfloxacin) 对蛋白核小球藻 (Chlorelapyrenoidosa) 生长及抗氧化酶活性的影响第 3期
GST试剂盒进行测定,在 37℃反应 1min扣除非酶
促反应,使反应体系中 GSH浓度降低 1μmol·L-1
为一个酶活力单位 (U);EROD测定参考 Pohl等
(1980)的快速终止荧光光度法并略有改进.
2.5 数据分析
处理组与对照组数据采用单尾 T-检验法进行
比较,p<0.05、p<0.01分别表示与对照组差异显
著、差异极显著.
3 结果与分析(Resultsandanalysis)
3.1 NFLX对小球藻的急性毒性
NFLX暴露下,显微镜观察到部分小球藻细胞
形态发生变化,部分藻体出现细胞肿胀现象;在最
高浓度组(120mg·L-1)个别藻体细胞壁受到破坏,
藻体开始分解,培养液颜色变白.
NFLX对小球藻生长抑制率(IA)随浓度的增
加而增加(表 1),当 NFLX浓度为 7.5mg·L-1时对
小球藻生长影响不大,抑制程度很弱,24、96h的
生长抑制率分别为 0.019、0.087;当 NFLX浓度为
15及 30mg·L-1时对小球藻的抑制程度也较弱;当
浓度达到 60mg·L-1时,NFLX对小球藻生长抑制
显著,24、96h的生长抑制率分别为 0.859、0.889,
接 近 于 100%抑 制.当 浓 度 达 到 120mg·L-1时
NFLX对小球藻生长影响极显著,24h生长抑制率
达到 1.173.随暴露时间的延长,小球藻表现出对
NFLX的逐渐适应性或耐受性,在 NFLX暴露 24h
之后生长抑制率增加幅度很小.
由公式(1)计算得 NFLX对小球藻 96hEC50
为 30.78mg·L-1,按照水生生物毒性分级(国家环
保局,1993),属于低毒.
NFLX对小球藻叶绿素 a含量的影响见图 1.
随 NFLX浓度的增大,小球藻叶绿素 a含量逐渐
下降.随时间的延长,高浓度处理组叶绿素含量
增长减慢.7.5mg·L-1处理组 96h暴露后叶绿素 a
含量为对照组的 85.6%,60mg·L-1处理组只有
19.5%,120mg·L-1处理组小球藻叶绿素 a已基本
分解,只有对照组的 2.3%左右.叶绿素 a变化趋
势与细胞密度的变化趋势基本吻合,但比细胞生
长变化表现出更好的剂量-效应关系.
3.2 NFLX对小球藻抗氧化酶活性的影响
NFLX对小球藻 GSH含量的影响如图 2所
示,从图 2可以看出,NFLX各处理组相对对照组
其 GSH含 量 均 受 到 诱 导 , 高 浓 度 组(30、60、
120mg·L-1) 与对照组间存在显著性差异 (p<
0.05).当 NFLX浓度达到 60mg·L-1时诱导最显
著,GSH含量为对照组的 1.26倍.随着 NFLX浓
度继续升高,诱导有下降趋势.
GST活性在低浓度暴露组(7.5、15mg·L-1)诱
导不显著.随着 NFLX浓度的升高,GST活性逐渐
升高,当 NFLX浓度大于 15mg·L-1时,处理组与对
照 组 间 存 在 显 著 性 差 异 (p<0.05).NFLX为
120mg·L-1时,GST酶活性为对照组的 2.34倍,受
到极显著诱导(p<0.01)(图 3).
NFLX对小球藻 CAT活性的影响如图 4所示,
由图 4可以看出,低浓度 NFLX即对小球藻 CAT
表现出显著的诱导作用.当 NFLX浓度为 30mg·L-1
时,CAT活性为对照组的 1.92倍,达到最大,差异
极显著(p<0.01).但随 NFLX浓度继续增加,小球
藻 CAT活性出现下降趋势.当 NFLX浓度达到
120mg·L-1时,CAT被显著抑制(p<0.05),CAT活
性只有对照组的 84%.NFLX对小球藻 EROD活
NFLX浓度/(mg·L-1)
生长抑制率IA
24h 48h 72h 96h
0 0 0 0 0
7.5 0.019 0.076 0.087 0.087
15 0.157 0.146 0.135 0.152
30 0.192 0.206 0.212 0.244
60 0.859 0.868 0.884 0.889
120 1.173 1.105 1.067 1.044
表 1 NFLX对蛋白核小球藻的生长抑制率随时间和
浓度的变化
Table1 ComparisonofgrowthinhibitionrateofChlorela
pyrenoidosaexposedtodiferentconcentrationofNFLX
anddiferenttime
329
生 态 毒 理 学 报 第 2卷
性的影响如图 5所示,由图 5可以看出,随 NFLX
浓度的增加,小球藻 EROD活性没有显著变化(p>
0.05).
4 讨论(Discussion)
抗生素药物 NFLX对蛋白核小球藻的毒性属
于低毒,低浓度处理组 NFLX对小球藻的生长抑
制作用很小,但也未表现出许多文献报道的有机
物低浓度暴露时对藻类生长的刺激作用(沈国兴
等,1999;杨志强等,2004).当 NFLX浓度大于
30mg·L-1时小球藻的生长受抑制程度才比较明
显,高浓度 NFLX暴露超过了藻细胞耐受极限,细
胞结构开始破裂、解体,藻细胞生长处于零增长或
负增长,以至生长无法完全恢复.随着培养时间
的增加,NFLX对小球藻生长的抑制程度有所增
加,但增加幅度很小,说明小球藻对 NFLX有逐渐
适应的趋势.
GST是一种重要的解毒酶,能催化 GSH与许
多亲电子物质结合,从而解除内源性或外源性毒
物的影响.实验表明,当 NFLX浓度达到 30mg·L-1
后小球藻体内 GST诱导明显,随着 NFLX浓度的
升高,藻体内可能积累一些活性氧自由基或一些
亲电子次级产物,这可能导致 GST被诱导,促使
GSH与其结合从而解除或降低毒性.有文献报道
生物体内细胞色素 P450酶在参与喹诺酮类药物代
谢过程中会产生具有亲电子活性的中间产物,从
而诱导某些抗氧化酶活性的响应(Vaccaroetal.,
2003;Ariagaetal.,2000).GST活性的升高是藻
类抵御外源污染物的一种应激性反应(陈加平等,
1999),这在各种水生生物对污染物的暴露中均有
报道 (周启星等,2004).作为生物体内重要的非
酶系抗氧化系统的成分之一,GSH既可由于污染
的暴露而产生适应性诱导反应,也可由于污染物
330
聂湘平等:诺氟沙星 (Norfloxacin) 对蛋白核小球藻 (Chlorelapyrenoidosa) 生长及抗氧化酶活性的影响第 3期
的毒性作用而产生中毒反应,导致生物体内 GSH
含量降低.小球藻经过 96h的短期暴露,GSH含量
总体处于诱导状态,但当 NFLX浓度达到 60mg·L-1
时其含量并没有显著增加,说明藻体内 GSH在低浓
度NFLX暴露下产生了适应性诱导.
CAT也是植物体内一种重要的抗氧化酶,它
能催化 H2O2生成 H2O与 O2,以减轻 H2O2对细胞
的氧化损伤.在低浓度 NFLX作用下,CAT活性受
到明显诱导,并随着 NFLX浓度的增大而逐渐升
高.但当 NFLX浓度超过 30mg·L-1时小球藻 CAT
活性又逐渐受到抑制.本实验中 CAT呈现出低浓
度诱导,高浓度抑制现象,在 α-萘酚对普通小球
藻的实验中也有类似的现象 (彭金良等,2001).
当 NFLX浓度超过了藻细胞的耐受极限,CAT不
足以消除小球藻体内产生的 H2O2,从而引起自由
基的积累,导致各种酶活性下降甚至失活,藻细胞
生长受到明显抑制.
目前有关污染物对藻细胞中 EROD影响的研
究还很少.但污染物对动物细胞 EROD的影响研
究 表 明 ,一 些 污 染 物 如 PCBs、PAHs等 会 诱 导
EROD的活性(王咏等,2000;徐镜波等,2003;王
菊英等,2003);也有研究表明喹诺酮类抗生素恩
诺沙星通过产生一些具有亲电子活性的中间产物
会诱导鱼类生物体内 EROD的活性 (Vaccaroet
al.,2003).但在哺乳动物研究中,多数研究结果
表明喹诺酮类抗生素可对细胞色素 CYP1A1依赖
的 EROD酶活性产生明显的抑制作用.本实验中,
NFLX对 EROD活性没有表现出明显的抑制作用,
甚至还在低浓度(15mg·L-1和 30mg·L-1)时呈现出
微弱的诱导作用,说明小球藻体内 EROD对喹诺
酮类药物 NFLX的反应不敏感.另外,有研究指
出,实验温度、测试的生物种类属性以及暴露时间
的长短等均会对 EROD的活性产生影响 (陈加平
等,1999).因此,关于藻细胞 EROD对抗生素药物
暴露响应的具体机理还需进一步探究.
通讯作者简介:聂湘平(1966—),新疆阿尔泰人,博士,
副教授,主要从事生态毒理学研究,发表论文 30余篇.
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55-110 ◆
生物体内积累:与环境中化学品的浓度相比,
生物体内的化学品浓度随时间推移不断增加.化
合物被吸收后,当其存储速度快于分解(新陈代
谢)或者排泄速度时就会在生物体内积累.生物体
内积累是一个正常过程.只有当涉及化学品的危
害性的接触量和生物体内积累之间的平衡被打破
时才会产生不良影响.(生物浓度和生物放大是相
关术语.)
生物杀灭剂:对其他有机体有毒的天然或合
成物质(例如除草剂、杀虫剂).欧共体立法对“保
护植物产品”和“生物杀灭剂”进行了区分.
氯代烃类(CHCs):含有氯、碳和氢的化合物.
该术语用于指有机氯杀虫剂(如林丹和DDT)、工
业化学品(如多氯联苯)和含氯废物(如戴奥辛和
呋喃).CHCs可长期存留于环境中.大多数会在食
物链中的生物体内积累.健康和环境影响取决于
个别化合物.
戴奥辛:有毒、很可能致癌的化学品族类.存
留时间长,在生物体内积累,广泛分布在环境中.
许多人的体内组织里都可检测到此类物质.
破坏内分泌物:破坏内分泌系统的化学品,会
导致发育和生殖问题.环境中的破坏内分泌物对
人类和野生生物健康的威胁令人担忧.
重金属:密度较高的金属成分,即使浓度低也
有毒甚至剧毒.如汞、镉、砷和铅.除了具有毒性之
外(如铅是神经毒素),重金属的危险性还在于它
们容易在生物体内积累.
氢氟碳(HFCs):含有氟、碳和氢的化合物.由
于不含氯,不直接影响同温臭氧层,所以企业和一
些科学家认为这类化合物中的一些化学品可以作
为 CFCs和 HCFCs的替代物.但是,HFCs对环境有
其他不良影响.
持久性:化学品以一种无变化形式在环境中
存留的时间越长,人类或者环境接触它们的可能
性就越大.持久性一般用来测量或者评估空气、
水、土壤和沉淀物.
多氯联苯(PCBs):用作冷气剂和润滑剂的有
毒、可能致癌化合物.PCBs在环境中不容易分解.
在已经被禁用的国家,仍然继续向大气、水和土壤
中释放.PCBs只有在特制焚烧炉中在极高温下才
能被销毁.
持久性有机污染物(POPs):在环境中长期存
留、通过食物链在生物体内积累的物质,对人类健
康和环境有不良影响.有证据表明这些物质正通
过长途运输进入从未使用或者生产它们的地区.
稳定:不容易被分解或者发生化学变化.
引自《产业与环境》27卷2-3期
定 义
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