全 文 ：新 疆 农 业 大 学 学 报　2008 ,31(1):25 ～ 29
Journal o f Xinj iang Agricultural University
文章编号:1007-8614(2008)01-0025-05
不同培养因子对新疆紫草种子根生长的影响
韩建欣 , 陈　芬 , 陈永芳 , 芦韦华 , 李翠芳 , 王　芳
(新疆农业大学 农学院 , 乌鲁木齐　830052)
摘　要:　将新疆紫草无菌苗根分别接种在含不同培养因子的培养基中进行液体培养 , 观察培养基 、pH 值 、有机
物 、L-苯丙氨酸对根的生长量 、培养液颜色及 OD 值的影响。结果表明:①在 SH 培养基中 ,且 pH 为 4.5 时根相对
生长率较 M9 大。②M9培养基附加 30 g/ L 蔗糖有利于紫草根生长 , 蔗糖浓度为 30 ～ 60 g/ L促进紫草素合成。③
在 M9培养基上添加低浓度的CuCl2 有利于根的生长。 ④在 M9 培养基上添加White 有机成份及肌醇(200 mg/ L)
均对根的生长无促进作用。 ⑤M9 添加 L-苯丙氨酸对种子根的生长无明显促进作用。 ⑥根的生长周期为9 ～ 12 d。
适宜根生长条件的摸索为新疆紫草毛状根及紫草素的生产条件的确定提供了依据。
关键词:　新疆紫草;根;液体培养
中图分类号:Q949.777.4　　　　　　　文献标识码:A　
Effect of Culture Factors on Seed
Roots Growth of Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst
HAN Jian-xin , CH EN Fen , CHEN Yong-f ang ,
LU Wei-hua , LI Cui-fang , WANG Fang
(College of Ag ronomy , Xinjiang A gricul tural Universi ty , Urumqi , 830052)
Abstract:　The root f rom Arnebiaeuchroma(Roy le)Johnst sterile seed w as inoculated on germ roo t o f liq-
uid culture medium w ith dif ferent g row th culture facto rs.Effect of medium ,pH , o rganic mat ter , L-Phenyl-
alanine on the g row th quantity o f roo t , nutrient liquid colour , OD was observed.The resul ts showed that:
①The roo t grow th in culture medium w ith SH (pH4.5)4.5 relat ive-g row th w as mo re than that of in me-
dium M 9.②M9 medium w ith 30 g/L cane sugar w as advantageous fo r the root g row th of Arnebiaeuchro-
ma(Roy le)Johnst , 30-60 g/L cane sugar in culture medium can stimulate the synthesis of shikonin in
roo t.③Adding low concentration of Cu2+ promoted g reat ly the grow th of ro ots.④Adding w hi te o rg anic
component and inosit had no ef fect on roots grow th.⑤In comparison w ith medium M9 medium , adding L-
PHeny lalanine had no obvious ef fect on roo t g row th ⑥9 to 12 day s w as a g row th cycle period.T he aquired
results in the investig ation pro vided the basis fo r further developing the ro ot g row th o f seed of Arnebiae-
uchroma (Roy le)Johnst.
Key words:　Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst;root;submerged culture
　　紫草的主要成分为紫草宁 ,是萘醌类化合物 ,具
抗肿瘤 、抗炎和抗菌[ 1] 活性 ,还有抗肝脏氧化损伤和
抗受孕[ 2] 等药理作用 ,同时又是日化用品原料[ 3] 。
由于紫草独特的药用价值 ,同时又是天然名贵染料
的来源 ,所以受到世界各地的高度重视 。紫草可分
为新疆紫草 、内蒙紫草及紫草 3种 。3 种紫草尤以
新疆紫草紫草素含量最高[ 4] ,因此其需求量逐年增
大 ,通过组织培养法[ 5-7]获得紫草再生植株;利用细
收稿日期:2007-08-10
基金项目:国家自然科学基金项目(30560059);新疆农业大学青年教师科研启动基金项目;新疆维吾尔自治区高校科研基
金项目(XJEDU2004G07)
通讯作者:王　芳 , E-mail:wang fang1hao@126.com
新　疆　农　业　大　学　学　报 2008年　
胞培养[ 8 , 9]生产紫草素 ,但存在再生植株率低 、遗传
稳定性差 、有效成分产量不稳定等问题 ,从而限制了
这些技术的广泛应用 。毛状根因其具有生长迅速 ,
分枝多 ,尤其在无激素培养基上能够自主 、持续生
长 ,次生代谢产物含量高且稳定的特性 ,而备受关
注 ,许多学者对银杏[ 10 -13] 等植物进行了毛状根诱导
及培养 ,结果表明有效成分含量均较原植物高 。本
试验采用新疆紫草无菌种子根为外植体进行液体培
养 ,探索不同培养基 、pH 、Cu2+及一些有机物对其
生长增殖及紫草宁合成的影响 ,为新疆紫草无菌苗
根及毛状根生长条件的确定 、有效成分的提取提供
参考依据 。
1　材料和方法
1.1　材 料
新疆紫草无菌苗根由新疆农业大学农学院组织
培养试验室提供 。
1.2　方 法
将新疆紫草 15 d龄无菌苗根接种在装有 30 ～
40 mL 培养液的 100 mL 三角瓶中 , 若不特殊说明
培养液 pH 均为 5.8 ,蔗糖 30 g/L 。在 25 ℃,摇床
速度(110±10)r/min ,暗培养条件下进行振荡培养 。
接种前称取种子根鲜重(W1 ),培养 15 d后用无菌
滤纸将根表面的水分吸干再称取培养物鲜重
(W 2 ),计算相对生长率 。每个处理 3 ～ 4 次重复
(瓶),每个重复接种的种子根重量相对一致。
相对生长率(%)=[(W 2 -W 1)/W 1 ] ×100%
增殖倍数=N +3d的根重/ N 的根重
式中:N 表示 0 ,3 ,6 ,9 ,12 ,15 d 。
1.2.1　Cu2+种类 、浓度及有机物试验
以 M9[ 14] 为基本培养基 ,分别设置两种 Cu2+及
浓度 ,附加肌醇 、White 有机 、SH 有机 、碳源 ,比较种
子根悬浮培养的生长量 、紫草素颜色及 OD 值 。组
合设置见表 1。
1.2.2　不同 pH 值试验
以 SH 培养基为基本成分 ,分别设置 pH 为
4.5 ,5.0 ,5.5 ,6.0 ,共 4个处理 。以 M9[ 14] 培养基为
基本成分 ,分别设置 pH 为 3.0 ,4.0 , 5.0 ,6.0 , 7.0 ,
8.0共 6个处理。通过对比试验筛选出适宜新疆紫
草种子根生长的培养基及 pH 值。
1.2.3　M9离子浓度试验
1/2 M9 、M9 、3/2 M9 、2 M 9。另设 L-M9(M9
+L-苯丙氨酸 100 μL/L)培养基 ,比较各处理对新
疆紫草种子根生长的影响 。
表 1　Cu2+种类 、浓度及有机物试验组合
Table 1　The experimental combination of Cu2+ type , concen-
tration and organic matter
试验种类 编号 附加物质
Cu2+种类及
浓度筛选
A CuCl2 0.26 mg/ L
B CuCl2 0.78 mg/ L
C CuSO 4 0.30 mg/ L
D CuSO 4 0.90 mg/ L
肌醇试验
E CuSO 4 0.90 mg/ L
F CuSO40.90 mg/ L+肌醇 200 mg/ L
G CuCl2 0.78 mg/ L
H CuCl2 0.78 mg/ L+肌醇 200 mg/ L
有机物试验 I M9 无机+White有机
J M9 无机+SH 有机
碳源试验
K 蔗糖 15 g/ L
L 葡萄糖 15 g/ L
M 蔗糖 30 g/ L
N 葡萄糖 30 g/ L
O 蔗糖 60 g/ L
　注:基本培养基为 M9 , M9 中的 Cu2+原来是由 CuSO 4
(0.3 mg/ L)提供。
1.2.4　新疆紫草种子根生长曲线测定
将紫草无菌苗种子根接种在 M9培养液中进行
摇培 ,每 3 d称取根鲜重 ,直至根重开始降低为止 。
1.2.5　培养液总紫草素的分光光度法检测
称取 2 mg 总紫草素标准品 ,用 95%乙醇定容
至 10 mL ,精确吸取 0.4 , 0.6 , 0.8 , 1.0 , 1.2 , 1.4 ,
1.6 ,1.8 mL 分别置于 8 个 10 mL 的容量瓶中 ,
95%乙醇定容至刻度 ,摇匀 。用 95%乙醇作对照 ,
用酶标仪从 400 ～ 600 nm 间隔扫描(步长为 2 nm)
做吸收光谱图 ,均在 516 nm 处有最大吸收峰 。
将生长 15 d的根的培养液过滤 ,10 000 r/min ,
离心 15 min ,弃去上清 ,用 95%乙醇提取至无色 ,合
并提取液。将样品溶液放入 1 cm 石英比色皿中 ,以
95%乙醇作对照 ,利用酶标仪从 400 ～ 600 nm 间隔
扫描(步长为 2 nm)做吸收光谱图 。分别测定样品
在 516 nm 处的 OD 值 。
2　结果分析
2.1　pH 值对种子根生长的影响
将种子根分别接种在 SH 、M9 不同 pH 培养液
中(图 1 ,2),根的相对生长率以 SH 培养基为最高 ,
达 8.3%,而 M9最高为 1.4%,表明 SH 培养基有
利于根的生长 。SH 培养基为基本成分时 , 当 pH
为 4.5时 ,种子根的相对生长率最高 ,培养液最早变
为红色 ,并随培养时间延长颜色逐渐加深。随 pH
26
　第 1 期 韩建欣 , 等:不同培养因子对新疆紫草种子根生长的影响
值升高根的相对生长率呈下降趋势 。表明根的生长
及色素的合成适宜偏酸环境 ,并能很快向培养液释
放色素。
以M9培养基为基本成分 ,pH 值 4.0时的培养
液最早变红 ,且颜色最深 , OD 516为 1.559 ,其余依次
为pH 值 6.0的 OD 516为0.708 ,pH 值 5.0的OD 516
为 0.69 ,pH 值 8.0的OD 516 为0.664 ,pH 值 7.0的
OD 516 为 0.574。表明在 M9 培养条件下根的色素
合成适宜偏酸环境 。pH 值 3.0时连续摇培数日后
培养略有黄色出现 , OD 516 为 0.032 ,其种子根无明
显形态变化 ,第 15天称量时根重还有下降 ,表明种
子根在过于偏酸的 M9培养液中不利于生长。
图 1　pH 值与种子根的生长
Fig.1　pH and growth of seed roots
2.2　Cu2+种类及浓度对种子根生长的影响
将种子根分别接种在 M9 附加 CuCl2 、CuSO 4
及不同浓度的培养液中(图 2),当培养液中均为
CuCl2 时 ,根的相对生长率以处理 A 最高 ,达 7%,
Cu2+增加 3倍(B)其相对生长率为为 3.8%;培养液
中均为 CuSO 4(C , D)时 , 根的相对生长率介于
CuCl2 0.26 mg/ L 与 CuCl2 0.78 mg/ L之间 。表明
M9附加低浓度的 CuCl2 有利于根的生长。Cu2+增
加 3倍(B)的培养液中紫草素颜色最深 ,其 OD 516 最
高 ,为 1.358 ,其余依次是 C , A , D。表明较高浓度
的 CuCl2 有利于根中色素的合成及向胞外释放 。根
的生长与色素的合成所需求的 CuCl2 含量应有不
同 ,彼此呈负相关 , 根生长与色素合成呈不同步
现象 。
图 2　Cu2+种类及浓度与根的生长 图 3　肌醇与根的生长
Fig.2　Cu2+ type and concentration and the roots growth Fig.3　Inosit and roots growth
2.3　有机物对种子根生长的影响
2.3.1　肌醇对种子根生长的影响
添加肌醇的相对生长率均低于未添加肌醇的处
理(图 3)。但添加肌醇的培养液中紫草素合成速度
(颜色深浅)明显较未添加肌醇的快 ,培养液中紫草
素颜色依次为 H >F >G >E , 表明 M9 附加
CuCl20.78 mg/ L 并添加肌醇 200 mg/L 有利于提
高紫草素的合成速度 。
2.3.2　有机物质对种子根生长的影响
种子根在 M9无机附加 SH 、White有机物质的
培养液中悬浮培养结果显示 ,种子根的相对生长率
及OD 值均较未添加的处理(M9)低 ,表明 White 有
机和 SH 有机对根的生长及合成没有促进作用。但
M9无机+White 有机(I)的培养液紫红色增色速度
较 M9快 ,表明White有机物质对紫草素后期的合
成速度很可能有一定促进作用(图 4)。
2.3.3　M9 离子浓度及 M9 附加 L-苯丙氨酸对种
子根生长的影响
根的相对生长率与培养液中紫草素OD 值的变
化趋势一样(图 5);M9及添加 L-苯丙氨酸的相对
生长率及OD 值明显较3/2M 9 、2M 9高 ,表明 M9离
子浓度偏低有利于根的生长 。添加 L-苯丙氨酸后
相对生长率及 OD 值与 M9差异不大 ,但试验发现 ,
添加 L-苯丙氨酸的培养液第 9 天颜色明显较第 15
27
新　疆　农　业　大　学　学　报 2008年　
天颜色深 ,说明此处理的紫草素合成可能随时间延 长有下降趋势 。
图 4　有机物质与根的生长 图 5　M9 不同比例及 L-苯丙氨酸与根的生长
Fig.4　Organic matter and roots growth Fig.5　M9 different proportions and L-pHenylalanine and
root growth
2.3.4　碳源对种子根生长的影响
试验结果表明 ,根的相对生长率以 30 g/L 的碳
源(达 5%～ 6%)较 15 g/ L 的高;蔗糖(K , M)的相
对生长率高于葡萄糖的(L , N);而采用 60 g/ L 的蔗
糖(O)为碳源相对生长率则最低(图 6)。培养液中
紫草素 OD 516 以 M(蔗糖 30 g/ L)为最高 ,其次为 O
(蔗糖 60 g/L)。此外培养液中紫草素颜色变红的
速度均为含蔗糖的处理较快 。
图 6　不同碳源与根的生长 图 7　根培养时间与根重
Fig.6　Different carbon sources and root growth Fig.7　Culture time and weight of roots
2.4　种子根生长曲线
将种子根接种在 M9培养液中悬浮培养结果见
图 7 ,根的生物产量随培养时间逐渐增加 ,第 12 天
根的生长量达峰值 ,之后根重开始下降 。因此 ,可以
确定种子根的培养周期是 9 ～ 12 d ,及时将种子根进
行继代以维持不断生长的根的营养需求 。
3　讨论
利用毛状根生产有效成分是开发利用以根入药
的许多药用植物的一条新的有效途径 。郭肖红
等[ 15]对丹参(Salvia m i lt iorrhiza)不定根生长条件
进行了研究 ,结果认为不同培养基对丹参不定根培
养的影响不同 。本试验对新疆紫草(Arnebiae-
uchroma (Roy le)Johnst)种子根生长研究表明 ,在
SH 培养基中根的相对生长量最大 ,而 M9培养基
有利于紫草素合成 ,因此建议采用两步法以达到促
使紫草种子根生长及紫草素合成的目的 。此结果与
叶和春等[ 16] 对新疆紫草细胞培养建立的二步培养
系统类似 。
新疆紫草种子根在 pH 值 4.0 ～ 8.0范围内均
能进行不同程度的生长 ,但在 pH 值 3.0时根不能
生长 ,这一结果与宁文等[ 17] 的硬紫草愈伤组织在
pH 值 3.0时能继续生长相反 ,这可能是所用试验
材料不同所致。 Rousel[ 17 , 18] 研究认为提高培养基
中 CuC l2 ·2H2O 浓度可促进硬紫草细胞中的紫草
素含 量[ 14] , 宁文 等[ 19] 在 M9 培 养基 中添 加
30 μmo l/L的 CuCl2 ·2H 2O 悬浮培养滇紫草细胞 ,
色素产量比对照提高了 58.7%。严海燕等[ 20] 对紫
草愈伤组织培养中紫草素形成研究表明 , CuSO 4 为
M9浓度的 3倍时 ,紫草素产量较高 。本试验对种
子根研究结果表明 ,低浓度的CuCl2(0.26 mg/L)有
利于根的生长 ,较高浓度的 CuCl2(0.78 mg/L)有利
于根中色素的合成 。因此可以认为根的生长与色素
的合成所要求的 CuCl2 含量不同 ,在紫草素的合成
阶段 Cu2+浓度过高可能是导致根的生长产生负效
应的原因 。
L-苯丙氨酸可明显提高新疆紫草悬浮培养细胞
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　第 1 期 韩建欣 , 等:不同培养因子对新疆紫草种子根生长的影响
中紫草素的含量[ 21] 。本试验中 ,M9附加 L-苯丙氨
酸对根的生长及紫草素的合成均无明显促进作用 ,
可能因培养对象及培养基成分不同所致 。
方德秋等[ 21] 研究结果认为蔗糖是最适于新疆
紫草细胞生长和紫草素合成的碳源。何含杰等[ 22]
研究显示 3%蔗糖能促进三裂叶野葛毛状根的生长
及其异黄酮类化合物和葛根素的积累。本实验研究
结果表明 ,蔗糖有利于紫草根生长 ,蔗糖浓度为 30
～ 60 g/L 促进紫草素合成 ,可见蔗糖作为能源和碳
源参与细胞 、毛状根生长代谢是相对一致的。
新疆紫草细胞在培养过程中具有外泌紫草色素
的特性[ 23] ,本研究对新疆紫草种子根进行悬浮培养
其紫草素同样具有外泌特性 ,这为直接从培养液中
吸附 、提取 、分离紫草素 ,提高紫草素含量及进行连
续性培养提供了便利条件。
本研究新疆紫草种子根的生长速率较低 ,相对
生长率最高达 8%左右 ,培养12 d的根增殖近 1倍 ,
这与种子根的生长特性 、培养基营养成分及是否添
加植物生长调节剂[ 24] 有关 。新疆紫草种子根的生
长随培养时间延长呈 S 形曲线。新疆紫草种子根
的培养策略应是当种子根生长至 9 ～ 12 d 时 ,转入
继代培养基中 ,待达到一定生物量后转入紫草素生
产培养基 ,实现根的生长和紫草素合成二步法。
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