全 文 ：第 4卷　第 5期 环境 工 程学 报 Vol.4 , No.5
2 0 1 0 年 5 月 ChineseJournalofEnvironmentalEngineering May2 0 1 0
城市污水厂污泥替代营养盐培养
海水小球藻的研究
张　聪　谢　爽　孟范平＊
(中国海洋大学环境科学与工程学院 ,青岛 266100)
摘　要　为了城市污水厂污泥的资源化利用 ,对污泥替代 F/2培养基培养海水小球藻(Chlorellapacifica)进行了研究。
首先采用研磨-离心法制备污泥抽提液 ,将其与 F/2培养基按体积比 7∶3混合 ,接种微藻并在优化的条件下培养 6 d, 逐日测
定混合液中无机氮 、磷的浓度 ,培养结束后测定微藻生物量以及干藻中蛋白质 、氨基酸和重金属含量。结果表明 ,将微藻在
最佳条件下培养 6 d后 , 混合液中 PO3-4 -P、NO-2 -N、NH+4 -N和 NO-3 -N的吸收率分别达到 97.32%、 96.72%、 97.55%和
78.13%;与 F/2培养基对照组相比 , 混合液中微藻的生物量增加 11.5%;蛋白质 、必需氨基酸和非必需氨基酸的含量变化
不大。另外 , 干藻中的重金属含量符合饲料行业标准的要求。
关键词　污泥　培养　海水小球藻
中图分类号　X705　　文献标识码　A　　文章编号　1673-9108(2010)05-1186-05
StudyonChlorelapacificacultivationbasedonmunicipal
sewagesludge
ZhangCong　XieShuang　MengFanping
(ColegeofEnvironmentalScienceandEngineering, OceanUniversityofChina, Qingdao, 266100, China)
Abstract　Inordertofacilitatethereclamationofmunicipalsewagesludge(MSS), thecultivationofChlo-
relapacifica, aspeciesofmarinemicroalgae, withMSSreplacingtraditionalF/2 culturemediumwasstudied.
Firstly, sewagesludgedischargedbyamunicipalwastewatertreatmentplantwasextractedwiththemethodof
pestlefolowedbycentrifugation.Secondly, theculturesolutionwaspreparedbymixingthesludgeextractionflu-
idwithF/2 culturemediuminavolumeratioproportionof7∶3.Thirdly, themicroalgaewasinoculatedinthe
mixtureandcultivatedfor6daysattheoptimalconditions, theconcentrationofinorganicnitrogenandphosphor-
usweredetecteddaily, andalgalbiomass, contentsofprotein, aminoacidsandheavymetalsinthedriedalgae
werealsomeasuredaftercultivation.Theresultsshowedthat, theabsorptioneficiencyforPO3-4 -P, NO-2 -N,
NH+4 -NandNO-3 -Narivedat97.32%, 96.72%, 97.55% and78.13%, respectively.Algalbiomassinthe
mixturefor6dwas11.5% greaterthanthatintheF/2culturemedium.While, therewaslitlediferenceinthe
contentsofcrudeproteinandaminoacidsindriedmicroalgaegrowinginthetwoculturemediums.Contentsof
heavymetalsonthebasisofdriedbiomasmeetwiththefeedindustrystandards.
Keywords　sewagesludge;cultivation;Chlorelapacifica
收稿日期:2009-05-05;修订日期:2009-06-30
作者简介:张聪(1982～ ), 女 ,硕士研究生 , 研究方向为环境污染生
物净化。 E-mail:7183812@163.com
＊通讯联系人 , E-mail:fanpingm@tom.com
　　微藻具有利用太阳光能效率高 、生长繁殖迅速 、
产量高 、营养丰富 、对环境适应性强 、容易培养和调
控等特点。小球藻的粗纤维含量低 ,蛋白含量高达
50% ～ 60%,经过干燥粉碎后可以作为添加剂生产
微藻型饲料 ,有效缓解动物饲料紧张的问题 [ 1] 。目
前 ,限制微藻大规模生产的主要原因是传统培养基
中必 须加入大量 的 NaHCO3、 NaNO3 或尿素 、
K2HPO4 [ 2] ,以满足微藻快速生长对氮 、磷的需要 ,导
致微藻培养成本较高 。
污泥是一种由有机残片 、细菌菌体 、胶体 、各种
微生物以及有机 、无机颗粒组成的非匀质体 [ 3] 。
2008年 全国城市污水处理厂的污泥产量为
2 662万 t,折算为干污泥 (含水率以 80%计)约为
532万 t/年。长期以来 , 我国一直存在着重废水处
理 、轻污泥处理的倾向 ,目前污泥处理处置多采用海
第 5期 张　聪等:城市污水厂污泥替代营养盐培养海水小球藻的研究
洋投弃 、卫生填埋等方式 ,容易造成二次污染 。因
此 ,寻找更加安全合理的污泥处置和利用方式具有
十分重要的意义 [ 4] 。城市污水处理过程中产生的
污泥含有丰富的 N、P和 K等营养成分 [ 5, 6] ,如果采
用适当方法提取后用作微藻的培养基质 ,既可降低
微藻的生产成本 ,也可实现污泥的资源化利用 。笔
者前期的研究[ 7]已证明 ,利用研磨 -离心法处理城
市污水厂二沉池中的剩余污泥 ,所得到的污泥抽提
液可部分取代传统培养基用于微藻培养 ,当污泥抽
提液与 F/2培养基按体积比 7:3混合后 ,在其他条
件相同的情况下 ,所培养的海水小球藻比生长率明
显高于其他体积比的混合液。当然 ,由于大多数污
泥中或多或少含有重金属等有害成分 [ 5] ,它们是否
能够通过微藻进行富集 ,直接关系到以污泥为原料
培养的微藻用于动物饲料添加剂的安全性 ,再者 ,微
藻所含的营养成分(蛋白质 、氨基酸等)能否满足动
物饲料添加剂的要求 ,也是需要关注的问题。
本研究将研磨 -离心法制备的污泥抽提液与传
统培养基按一定体积比混合 ,用于培养海水小球藻 。
首先通过正交试验优化培养体系的光照周期 、光照
强度 、温度和培养液 pH,然后在最适条件下连续培
养微藻 ,分别测定混合培养液中各种营养盐的浓度
变化以及培养结束时的微藻生物量 、干藻中蛋白质 、
氨基酸和重金属的含量。通过与传统培养基中生长
的微藻相关指标进行比较 ,说明利用污泥培养微藻
的可行性;通过与我国的饲料行业标准 、联合国粮农
组织(FAO)标准等进行比较 ,分析这种微藻用作动
物饲料的营养价值和安全性。
1　实验材料和方法
1.1　实验材料
微藻藻种:海水小球藻(Chlorelapacifica)由中
国海洋大学微藻库提供。
海水:取自青岛市崂山湾海域 ,经 0.45μm滤膜
抽滤 ,煮沸消毒后冷却备用 。
污泥抽提液:剩余污泥采自青岛市李村河污水
处理厂二沉池 ,含水率为 97.75%、总氮为 5.25%
(干基);总磷为 1%(干基)。按文献 [ 7]的方法 ,将
剩余污泥混匀后 ,自然沉淀 1h,弃除上部清水 ,留下
的沉淀物研磨成浆。为保证后续微藻生长所需的盐
度 ,将匀浆液与海水按体积比 1∶10混合后 ,离心
(6 000r/min)3次 ,收集上清液于 121℃灭菌后得
到污泥抽提液 ,其中的氮 、磷营养盐浓度见表 1。
F/2培养基:按照文献 [ 8]的方法配制。 1 L海水
中含有 NaNO3 75 mg、NaH2PO4· H2O5 mg、Na2SiO3
· 9H2O 20 mg、Na2EDTA4.36 mg、FeCl3 · 6H2O
3.16 mg、 CuSO4 · 5H2O 0.01 mg、 ZnSO4 · 7H2O
0.023 mg、CoCl2 · 6H2O 0.012 mg、MnCl2 · 4H2O
0.18 mg、 Na2MoO4 · 2H2O 0.07 mg、维生素 B1
0.1mg、维生素 B12 0.5 mg和生物素 0.5 mg。该培
养基中的氮 、磷营养盐浓度见表 1。
混合培养液:按照笔者之前的研究结果[ 7] ,将
污泥抽提液与 F/2培养基按体积比(V抽提液:VF/2)为
7∶3进行混合。所用化学试剂均为分析纯。
表 1　污泥抽提液与 F/2培养基中营养盐的浓度
Table1　ConcentrationofnutrientsinsludgeextractionandF/2 culturemedium (mg/L)
营养盐种类 NO-2 -N NH+4 -N NO-3 -N PO3-4 -P
F/2培养基 0.004±0.001 0.107±0.023 1.902±0.108 0.722±0.008
污泥抽提液 0.141±0.012 1.301±0.034 2.429±0.166 2.116±0.007
1.2　实验方法
1.2.1　海水小球藻的基本培养方法
在 500mL三角瓶中加入 200 mL混合培养液 ,
接种海水小球藻后 ,用 2层纱布封住瓶口 ,在 GXZ-
260B型智能光照培养箱中连续培养 6 d,每天搅动
3次 ,并且随机调换三角瓶的位置以尽可能使各试
验藻液受光均匀 。每天在相同时间采集藻液 ,显微
镜观察 , 以血球计数板计数 , 计算藻细胞密度
(106个 /mL),结果以(平均值 ±标准差)表示。
1.2.2　微藻培养条件的优化
设计 4因素(光暗周期 、光照强度 、温度和培养
液初始 pH)4水平的正交实验对微藻培养体系进行
优化 ,详见表 2。以培养 6d后的藻细胞密度作为评
价指标 ,确定微藻在混合培养液中的最适生长条件 。
1.2.3　微藻的分离与干化
微藻接种后培养 6 d, 离心 (3 000 r/min,
10min),弃去上清液后 ,获得下层藻泥 。将藻泥在
50℃下烘干至恒重 ,冷却 ,干燥保存 ,用于生物量 、
蛋白质 、氨基酸和重金属含量测定。
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环 境 工 程 学 报 第 4卷
表 2　正交实验因素水平表
Table2　Factorsandlevelsinorthogonalexperiments
水平 温度(℃) 光暗周期(h∶h) 光照强度(lx) pH
1 5 6∶18 500 5.5
2 15 12∶12 1 500 6.5
3 25 18∶6 2 500 7.5
4 35 24∶0 3 500 8.5
1.2.4　培养液中营养盐浓度测定
取 10mL培养液 ,在 5 000 r/min转速下离心
15 min后 ,取其上清液 ,按照 《水和废水监测分析方
法 》[ 9]对污泥抽提液中的营养盐进行测定 , 其中 ,
NH+4 -N:次溴酸盐氧化法;NO-2 -N:萘乙二胺分光光
度法;NO-3 -N:锌镉还原法;PO3-4 -P:磷钼蓝分光光
度法。营养盐的吸收利用率按以下公式进行计算:
　　　　　　r=(C0 -Ct)C0 ×100%
　　式中 , C0和 Ct分别为营养盐的起始浓度和培
养 t天后的浓度(mg/L)。
1.2.5　微藻生物量及蛋白质和氨基酸含量测定
微藻生物量:采用干重法 [ 10]测定。微藻蛋白质
含量:采用凯氏定氮法[ 11]测定。微藻氨基酸含量:
按照江枝河等 [ 12] 的方法 ,将烘干样品用 6 mol/L
HCl在 110℃水解 22h,然后采用日立 835型氨基酸
自动分析仪测定 。微藻重金属含量:根据张剑荣
等 [ 13]的方法 ,采用 SOLAARM6型火焰-石墨炉原子
吸收光谱仪(美国热电公司)测定 。
2　结果与讨论
2.1　混合培养液中海水小球藻的生长条件优化
混合培养液中海水小球藻的接种量为 3.0 ×
10
6个 /mL。在正交实验中 ,各实验组的海水小球藻
细胞密度随培养时间的延长持续增加 ,到培养 6 d
时 ,藻细胞密度相差较大(表 3):最小的为 7.5 ×
10
6个 /mL(实验 4),最大的为 92×106个 /mL(实验
11)。根据极差的大小判断 ,在 4种因素中 ,以温度
对混合培养液中微藻的生长影响最大 ,其次为 pH
和光暗周期 ,而光照时间的影响最小 。
温度是水环境中一个极其重要的生态因子 。藻
类的生长繁殖等生命活动只有在一定温度范围内才
能正常进行 [ 14] 。从表 3可以看出 , 温度较低时
(5℃),海水小球藻的细胞密度增加缓慢;随着温度
升高 ,细胞密度显著增加 ,至 25℃时细胞密度增值
幅度最大;温度升到 35℃时 ,细胞密度增加幅度有
所下降。因此 , 海水小球藻生长的最适温度为
25℃。这与前人报道的海水小球藻最适生长温度在
25℃[ 14]相符。
混合培养液的初始 pH也对微藻的生长产生一
定影响 ,仅次于温度。培养过程中 ,由于微藻细胞对
培养液中 CO2和 HCO-3 的大量吸收 ,引起培养液的
pH上升 ,甚至大于 11[ 15] 。当 pH变化超出微藻的
适应范围将影响藻细胞的正常生长 。根据表 3的分
析结果 , pH为 6.5和 7.5时 ,海水小球藻生长情况
较好 ,细胞密度增加较快;而 pH为 5.5和 8.5时 ,海
水小球藻生长受到抑制 ,细胞密度增加缓慢。因此 ,
利用含有污泥抽提液的混合液培养海水小球藻时 ,
最适 pH为 6.5 ～ 7.5。
表 3　混合培养液中海水小球藻生长条件
正交实验设计与结果
Table3　Designandresultsoforthogonalexperiments
forcultivationconditionsofChlorelaPacifica
inmixedculturemedium
实验序号
因素与水平
温度
(℃)
光暗周期
(h:h)
光照强度
(lx) pH
6d后的细胞密度
(106 个 /mL)
1 5 6:18 500 5.5 8.35
2 5 12:12 1 500 6.5 9.25
3 5 18:6 2 500 7.5 7.95
4 5 24:0 3 500 8.5 7.50
5 15 6:18 1 500 7.5 45.00
6 15 12:12 500 8.5 37.00
7 15 18:6 3 500 5.5 20.55
8 15 24:0 2 500 6.5 30.15
9 25 6:18 2 500 8.5 62.00
10 25 12:12 3 500 7.5 78.00
11 25 18:6 500 6.5 92.00
12 25 24:0 1 500 5.5 70.00
13 35 6:18 3 500 6.5 40.00
14 35 12:12 2 500 5.5 27.55
15 35 18:6 1 500 8.5 24.25
16 35 24:0 500 7.5 32.40
均值 1 8.262 38.837 42.438 31.613
均值 2 33.175 37.950 37.125 42.850
均值 3 75.500 36.188 31.912 40.837
均值 4 31.050 35.013 36.513 32.688
极差 R 67.238 3.824 10.526 11.237
　　微藻作为一类含有叶绿素的生物 ,只有在光照
条件下才能进行光合作用[ 15] 。由表 3可见 ,在以污
泥抽提液为主的混合液中 ,海水小球藻生长所需的
适宜光照强度和光暗周期分别为 500 lx和 6 h∶
18h。
综合上述分析 ,确定海水小球藻在混合培养液
中的最佳培养条件为:温度 25℃,体系的 pH6.5,光
照强度 500lx,光暗周期 6h∶18 h。
2.2　海水小球藻对混合培养液中营养盐的吸收利
用能力
在上述优化的条件下培养海水小球藻 6d,混合
培养液中各种营养盐的利用率变化情况见图 1。可
见 ,随着培养时间的延长 ,海水小球藻对各种营养盐
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第 5期 张　聪等:城市污水厂污泥替代营养盐培养海水小球藻的研究
的吸收利用率几乎呈直线上升趋势 ,培养 6 d后 ,混
合培养液中 PO3-4 -P、NO-2 -N、NH+4 -N和 NO-3 -N的
利用率分别达到 97.32%、 96.72%、 97.55%和
78.13%,表明在最适宜的培养条件下 ,海水小球藻
生长旺盛 ,繁殖迅速 ,能够吸收大量的营养盐。
图 1　优化条件下混合培养液中营养盐吸收率的变化
(数据以 3次平行测定的平均值 ±标准差表示)
Fig.1　Changeofabsorptionefficiencyof
nutrientsinmixedculturemediumunder
optimalconditions.Dataaremean±SD(n=3)
2.3　混合培养液与全 F/2培养基中海水小球藻的
生物量比较
在上述优化的生长条件下 ,混合液的海水小球
藻生物量(干重)为 3.01±0.09 g/L,比全 F/2培养
基的海水小球藻生物量 (2.70 ±0.07 g/L)增加
11.5%,两者达到差异显著(P<0.05)。可见 ,由于
污泥抽提液中含有较高浓度的无机氮和无机磷
(表 1),当其部分替代传统培养基后 ,可以为微藻生
长提供充足的氮 、磷营养盐 , 因而促进了微藻的
生长。
2.4　混合液所培养的微藻营养成分分析
蛋白质是评价动物饲料营养性的一项重要指
标 。据报道 ,国内利用马铃薯淀粉生产废渣 、玉米秸
杆生产单细胞蛋白饲料 ,粗蛋白质含量分别可达到
38.88%和 32.39%[ 16, 17] 。本研究中 ,混合液中生长
的海水小球藻粗蛋白含量(干重)为 55.7%,不仅接
近于全 F/2培养基中生长的海水小球藻蛋白质含量
(56.8%),而且明显高于文献报道的单细胞蛋白饲
料中粗蛋白含量 。
氨基酸种类和含量是评价动物饲料营养性的另
一项重要指标。由表 4可见 ,与全 F/2培养基中的
海水小球藻相同 ,混合液中的海水小球藻含有异亮
氨酸(Ile)等 7种必需氨基酸和甘氨酸(Gly)等 8种
非必需氨基酸(注:色氨酸未测)。其中 ,异亮氨酸
和赖氨酸含量稍高一些 ,其他 5种必需氨基酸的含
量则稍低一些 , 但总体上差异不大。总氨基酸
(TAA)中以谷氨酸含量最高 ,必需氨基酸(EAA)中
以亮氨酸含量最高 。 EAA占 TAA的 48.44%, EAA
与非必需氨基酸(NEAA)的比值为 93.94%。 1973
年由联合国粮农组织 (FAO)和世界卫生组织
(WHO)提出的理想模式标准 [ 18]为:质量较佳的蛋
白质氨基酸组成为 EAA/TAA在 40%左右 , EAA/
NEAA在 60%以上 。可见 ,本研究采用混合液培养
的海水小球藻符合这一模式的要求 。
由于微藻细胞蛋白中含有植物性饲料所缺乏的
赖氨酸和甲硫氨酸 ,其生物营养价值大大优于后者 ,
国内采用微藻单细胞蛋白作为饲料添加剂进行鱼
类 、肉鸡的饲喂试验已取得了较好效果[ 19] 。因此 ,
从蛋白质和氨基酸含量考虑 ,由混合液培养的海水
小球藻适于作为动物饲料添加剂。
表 4　2种培养基质中海水小球藻的氨基酸含量(%干重)
Table4　Contentsofaminoacid(%dw)inChlorela
pacificagrownintwokindsofculturemedium
必需氨基酸
(EAA) 混合液
F/2
培养基
非必需氨基酸
(NEAA) 混合液
F/2
培养基
异亮氨酸 4.27 4.16 甘氨酸 3.76 3.68
苏氨酸 3.00 3.24 丝氨酸 2.93 3.04
亮氨酸 5.45 5.85 谷氨酸 7.26 7.48
甲硫氨酸 1.87 1.93 酪氨酸 3.12 3.28
苯丙氨酸 4.03 4.19 丙氨酸 4.58 4.08
赖氨酸 3.16 3.04 半胱氨酸 0.93 1.04
缬氨酸 5.04 5.13 天冬氨酸 5.12 5.42
色氨酸 未测 未测 组氨酸 0.85 1.12
精氨酸 未检出 未检出
合计 26.82 27.54 合 计 28.55 29.14
2.5　混合液所培养的微藻重金属含量
对 2种培养基质中生长的海水小球藻进行重金
属含量分析发现 ,在全 F/2培养基中生长的海水小
球藻中均未检出 Cu、Zn、Pb和 Cd,混合液培养的海
水小球藻中 4种重金属均有检出 (表 5),其中 , Pb
和 Cd的含量均明显低于 《实验动物配合饲料通用
质量标准》(GB14924.1-2001)的相关规定值 。对于
该标准中未作出具体规定的 Cu和 Zn,参照《无公害
食品 生猪饲养饲料使用准则(NY5032-2001)》,即:
对于体重小于 30 kg、30 ～ 60kg、大于 60 kg的猪 ,配
合饲料中 Cu含量分别不得高于 250、 150和
25mg/kg,而 Zn含量的规定值则稍高一些 ,可见 ,以
混合液培养的海水小球藻 Cu和 Zn含量也远低于
上述准则的规定值 。由此认为 ,虽然污泥中的重金
属可以转入提取液中 ,并与氮磷营养成分一起被微
藻细胞吸收 ,但是 ,由于本研究所使用的青岛李村河
污水处理厂污泥的重金属(Cu、Zn、Pb和 Cd)含量不
高(表 5),相应的进入污泥抽提液的重金属较少 ,由
其培养的微藻重金属(特别是对饲养动物毒性较大
1189
环 境 工 程 学 报 第 4卷
的 Pb和 Cd)含量也不高 。因此 ,从重金属含量角度
考虑 ,利用污泥提取液培养的海水小球藻作为动物
蛋白饲料是安全的 。当然 ,由于污水处理厂所接受
的废水成分复杂 ,污泥中除了含有重金属外 ,还可能
含有多环芳烃 (PAHs)[ 20]等其他有毒物质 ,为避免
这些有毒物质进入污泥提取液中并通过食物链浓缩
而对人畜产生毒害 ,应选用单纯以生活污水为处理
对象的污水处理厂污泥用于培养海洋微藻 。
表 5　混合液中培养的海水小球藻重金属含量
Table5　ContentofheavymetalsinChlorelapacifica
cultivatedinmixedsolution
样品种类 Cu Zn Pb Cd
海水小球藻干样(mg/kg) 0.545 1.919 0.251 0.013
GB14924.1-2001(mg/kg) — — 1.0 0.2
混合液起始浓度(mg/L) 1.638 9.173 0.462 未检出
李村河污水厂污泥(mg/kg)[ 5] 226.25 281.91 223.37未检出
　　 1)“— ”表示未规定明确标准
3　结　论
(1)污泥提取液可以部分取代 F/2培养基用于
海水小球藻的培养。在污泥提取液和 F/2培养基的
体积比为 7∶3的混合液中 ,当温度为 25℃,光照时
间为 6 h,光照强度为 500 lx, pH为 6.5时 ,微藻的
生长最快。连续培养 6 d期间 ,混合液中的无机营
养盐(PO3-4 -P、NO-2 -N、NH+4 -N和 NO-3 N)能被海水
小球藻快速吸收利用;所得到的海水小球藻生物量
稍高于 F/2培养基生长的微藻生物量 。
(2)在优化的生长条件下培养的海水小球藻蛋
白质含量(干重)为 55.7%,与全 F/2培养基培养得
到的微藻蛋白含量(56.8%)基本相当;海水小球藻
中含有 7种必需氨基酸和 8种非必需氨基酸 ,含量
与全 F/2培养基培养的小球藻近乎相同 ,还含有植
物性饲料所缺乏的赖氨酸和甲硫氨酸 ,因此作为动
物饲料具有很好的营养价值。
(3)以污泥提取液为主的混合液所培养的海水
小球藻重金属含量符合 《实验动物配合饲料通用质
量标准 》等饲料行业标准。为评价这种微藻作为动
物饲料添加剂的安全性 ,还应进一步研究污泥中其
他污染物在藻细胞内的蓄积状况及其达标程度 。
(4)为避免污泥中的重金属等有毒物质通过食
物链浓缩而对人畜产生毒害 ,宜选用单纯以生活污
水为处理对象的污水处理厂污泥培养海洋微藻 。
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