全 文 ：新疆雪莲 rbcs基因的克隆及序列分析
杨 晶 1，张亚敏 2，李曹龙 2，王爱英 2，祝建波 1
（新疆石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000）
摘 要：为获得新疆雪莲Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）小亚基基因，并对其序列进行生物信
息学分析；从已建立的新疆雪莲cDNA文库中，随机挑取单克隆，采用通用引物M13扩增并测序，测序结
果在NCBI网址进行Blast比对，结果发现了 2个与 rbcs基因同源的序列并命名为 sikrbcs1和 sikrbcs2；生
物信息学分析表明：sikrbcs1基因包含 l个540 bp的完整开放阅读框，编码179个氨基酸，sikrbcs2基因包
含 l个420 bp的完整开放阅读框，编码139个氨基酸。sikrbcs1基因编码的蛋白质的理论等电点是8.90，
分子量为 20.1042 kD，具有 2个跨膜区域，sikrbcs2基因编码的蛋白质理论等电点是 7.58，分子量为
15.1093 kD，不具有跨膜区域。氨基酸多序列比对表明，Sikrbcs1与黄顶菊和向日葵的相似性最高，达到
83.89%，Sikrbcs2与向日葵的相似性最高达到57.54%；系统进化树显示表明，sikrbcs1和 sikrbcs2都与菊花
亲缘关系最近。
关键词：新疆雪莲；克隆；序列分析；rbcs
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：2013-2891
Cloning and Sequence Analysis of rbcs Gene from Sasussured involucrata Kar. et Kir
Yang Jing1, Zhang Yamin2, Li Caolong2, Wang Aiying2, Zhu Jianbo1
(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832000)
Abstract: To obtain rubisco (Ribulose- 1,5- bisphosphate carboxylase/oxygenase) small subunit gene from
Sasussured involucrata Kar.et Kir, in this study the gene was cloned and analyzed. The monoclone was selected
in established cDNA library randomly for PCR directed with universal M13 primer and sequencing, the
sequence was compared in NCBI ,finally the two rbcs gene homologous sequences were obtained，named
Sikrbcs1 and Sikrbcs2. Bioinformatics analysis indicated that the Sikrbcs1 cDNA contained an open reading
frame of 540 nucleotides encoding 179 amino acids; the Sikrbcs2 cDNA contained an open reading frame of
420 nucleotides encoding 139 amino acids. Forecasted the Sikrbcs1 protein relative molecular weight was
20.1042 kD, theoretical PI was 8.9, contained two span membrane structures, the Sikrbcs2 protein relative
molecular weight was 15.1093 kD, theoretical PI was 7.58, no span membrane structure. Multiple sequence
alignment of rbcs proteins revealed that the amino acid sequence of Sikrbcs1 protein showed high identity of
83.89% to those of rbcs from Flaveriapringlei and Helianthusannuus. Sikrbcs2 showed high identity of 57.54%
to that of rbcs from Helianthusannuus. Phylogenetic analysis further showed that the Sikrbcs1 and Sikrbcs2 had
nearest relationship with Chrysanthemum xmorifolium.
Key words: Sasussured involucrata Kar et Kir; cloning; sequence analysis; rbcs
基金项目：国家自然基金资助项目“新疆雪莲Rubisco小亚基Sikrbcs2基因的抗寒机制研究”(31160049)。
第一作者简介：杨晶，女，1987年出生，甘肃武威人，硕士研究生，主要从事植物基因工程研究。通信地址：832000新疆石河子大学生命科学学院农业
生物技术重点实验室315室，Tel：0993-2039660，E-mail：gswwyangjing@163.com。
通讯作者：祝建波，男，1969年出生，新疆石河子人，研究员，博士，研究方向为植物基因工程。通信地址：832000新疆石河子大学生命科学学院农业
生物技术重点实验室315室，Tel：0993-2039660，E-mail：zjbshz@126.com。
收稿日期：2013-11-04，修回日期：2013-12-25。
中国农学通报 2014,30(15):261-267
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
0 引言
光合作用是作物产量形成的基础，而温度是影响
光合作用的重要因素。起源于热带和亚热带的许多重
要的粮食和经济作物对低温极为敏感，当温度低于植
物生长的最适温度时，其生理代谢会发生多方面的变
化，光合作用系统对低温的反应最为敏感，主要表现有
叶绿素的合成受到阻碍[1]，叶绿体结构遭到破坏[2-5]，光
合电子传递活性下降[6]，光合作用过程中酶的活性下
降等[7-8]。低温不仅降低了植物对光能的利用率，而且
增加了冷敏感植物低温发生光抑制的可能性[9]。
新疆雪莲(Sasussured involucrata Kar.et Kir)属菊科
凤毛菊属，为多年生一次性开花结实的高山冰缘草本
植物，生长在海拔 2400~4100 m的高山悬崖峭壁的雪
线附近[10]。雪莲生长环境月平均气温很低，日温度变
化幅度急剧，冰雹、霜冻等自然灾害更是频繁发生。通
过对雪莲的生理生殖生态的研究发现，雪莲具有抗辐
射、抗缺氧和极强的耐寒的能力，可以在月平均温度仅
3~5℃环境下正常完成生理周期[11-12]。新疆雪莲自身形
成了独特的光合保护机制。因此研究其光合保护机制
具有重要的意义。
Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）是高
等植物光合碳代谢中的关键酶，即能催化CO2的固定
又能催化CO2还原，处于一个方向相反但又相互连锁
的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其
活性大小对净光合速率起着决定性作用[13]。高等植物
的Rubisco是多亚基复合体，是由8个大亚基(rbcL)和8
个小亚基(rbcs)组成的L8S8多聚体，其中大亚基由叶
绿体基因编码，小亚基是由细胞核基因编码。rbcs
mRNAs表达水平与Rubisco含量是高度相关的，二者
之间有很好的协同表达，小亚基对大亚基的表达具有
调控作用[12,14]。迄今为止，已经从多种植物中克隆得到
了 rbcs基因，并对其组成、结构和进化等进行了广泛研
究。研究表明 rbcs在植物基因组中为多拷贝且串连重
复，表达呈器官特异性，主要在植物叶片中表达，在不
同的生长发育时期表达也有差异[15]。本试验从新疆雪
莲叶片中克隆得到了2个 rbcs基因，并对其进行了生物
信息学分析，以此来指导其功能研究并对新疆雪莲的
光合生理特征的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 新疆雪莲组培苗由石河子大学生命科
学学院重点实验室培养。
1.1.2 菌株与试剂 大肠杆菌(Escherichia coli) top10、新
疆雪莲cDNA文库保存于石河子大学生命科学学院农
业生物技术重点实验室。植物总RNA提取试剂盒购
于艾德莱生物公司，cDNA合成试剂盒和凝胶回收试
剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。T4 DNA
连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司，pGM-T克隆
载体、10×Taq Reaction Buffer、Taq DNA Polymerase、
dNTP购自TIANGEN公司。
1.2 方法
1.2.1 新疆雪莲总RNA的提取和 cDNA的合成 参照
EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒说明书提取
新疆雪莲幼苗叶片的RNA。cDNA的合成参照北京康
为世纪生物科技有限公司的SuperRT cDNA第一链合
成试剂盒中的说明书。
1.2.2 新疆雪莲 rbcs基因的克隆 从已构建的新疆雪莲
幼苗叶片的 cDNA文库中随机挑取单克隆，采用M13
引物进行PCR扩增并测序，测序结果在NCBI网址进
行Blast比对，结果发现了2个与 rbcs基因同源的序列，
但这 2个序列的同源性很低。根据该序列，利用引物
设计软件(Primer5.0)设计特异性引物。
rbcs1上：5’- ATGGCCACACACTCCTCCTCCGC
CG-3’；
rbcs1下：5’-CCAAGCCAGAAGGGTACTAA-3’；
rbcs2 上：5’- ATGGCCTCCATCTCCTCCTCCGC
G-3’；
rbcs2 下：5’- ACTGATTCCGCCCAGGTGTTGA
-3’；
将以反转录成的新疆雪莲 cDNA为模板进行PCR
扩增，PCR的反应体系参见Taq DNA Polymerase说明
书。PCR反应程序为：94℃预变性 10 min；94℃变性
30 s，62℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸
7 min；16℃保存。PCR产物采用浓度为1.0%的琼脂糖
凝胶电泳分离，参照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回
收目的条带。将回收的目的片段与 pGM-T Easy克隆
载体连接，连接产物转化大肠杆菌 top10感受态细胞，
进行蓝白斑筛选。进一步进行菌液 PCR和双酶切鉴
定正确后交由华大基因公司进行测序。
1.2.3 序列分析和进化树的构建 利用DNAMAN软件
确定基因的开放阅读框和氨基酸序列。用ProtParam
(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质的理化性
质。利用ExPASY的网站提供的在线工具(ProtScale、
TMPRED、CDD)预测蛋白质的亲水性/疏水性、跨膜结
构，蛋白质基序。通过Blast进行同源性搜索并利用
DNAMAN软件对来自不同物种的同源氨基酸进行多
重比对。用 Clustalx和MEGA4.1软件构建系统进
化树。
··262
2 结果与分析
2.1 新疆雪莲 rbcs基因的克隆
采用M13引物从新疆雪莲cDNA文库中扩增得到
了特异性的片段。回收后与 pGM-T Easy Vecter载体
连接、转化大肠杆菌 top10感受态细胞、酶切鉴定正确
后测序。将测序结果在NCBI上比对得到 2种不同的
序列，都与Rubisco小亚基基因有着极高的相似性，为
方便后期实验将其命名为 Sikrbcs1，Sikrbcs2。以新疆
雪莲幼苗叶片 cDNA为模板，利用特异性引物PCR扩
增，得到目的条带（图1、图2）。将目的片段回收、连接
pGM-T Easy载体，转化大肠杆菌 top10感受态细胞，挑
取阳性克隆扩大培养，经菌液PCR和双酶切鉴定正确
后送去测序。测序结果经 DNAMAN软件分析，
Sikrbcs1包含 1个长 540 bp的完整开放阅读框，编码
179个氨基酸，Sikrbcs2包含 1个长 420 bp的完整开放
阅读框，编码139个氨基酸。
500 bp 540 bp 420 bp
500 bp
图1 Sikrbcs1基因PCR扩增 图2 Sikrbcs2基因PCR扩增
2.2 蛋白质理化性质的分析
利用 Protparm 软件在线预测基因 Sikrbcs1 和
Sikrbcs2的理化性质，得出 Sikrbcs1基因所编码蛋白的
理论等电点为8.90，相对分子质量为20.1042 kD，负电
荷氨基酸残基(Asp+Glu)的数目共有 16个，正电荷氨
基酸残基(Arg+Lys)的数目共有 21个，不稳定系数为
32.41，属于稳定蛋白，总平均亲水性为 - 0.256。
Sikrbcs2基因所编码蛋白的理论等电点为7.58，相对分
子质量为15.1093 kD，负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)的
数目共有12个，正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)的数目共
有 13个，不稳定系数为 36.17，属于稳定蛋白，总平均
亲水性为-0.082。
用TMPRED工具进行跨膜结构分析得出Sikrbcs1
由膜内向膜外存在1个跨膜区域，由膜外向膜内存在1
个跨膜区域。Sikrbcs2不存在跨膜结构。用 ProtScale
分析 Sikrbcs1和 Sikrbcs2基因所编码蛋白质的亲/疏水
性，由图 3和 4图分析可得：Sikrbcs1和 Sikrbcs2都是易
溶、亲水性较强的蛋白。
图3 Sikrbcs1基因编码蛋白的氨基酸序列疏水性/亲水性预测
杨 晶等：新疆雪莲 rbcs基因的克隆及序列分析 ··263
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
通过Motif Scan工具对Sikrbcs1的序列进行分析，
结果表明Sikrbcs1包含了1个酪蛋白激酶2磷酸化位点
(175—178)，3个肉豆蔻酰基化位点(14—19、28—33、
133—138)，1个蛋白激酶C的磷酸化位点(37—39)，1
个酪氨酸蛋白激酶位点(67—74)。Sikrbcs2包含了2个
天冬酰胺糖基化位点(13—16、112—115)，1个酪蛋白
激酶 2磷酸化位点(113—116)，3个肉豆蔻酰基化位点
(28—33、123—128、133—138)，1个蛋白激酶C的磷酸
化位点(38—40)，1个酪氨酸激酶磷酸化位点(66—73)。
利用NCBI的在线分析工具CDD进行结构域分
析，结果如图5、6所示，由图可知Sikrbcs1和Sikrbcs2属
于RuBisco-small-superfamily蛋白家族。Sikrbcs1具有
典型的PLNO2289结构域，Sikrbcs2不具有此结构域。
2.3 同源性及进化树分析
2.3.1 新疆雪莲 Sikrbcs1基因同源性及进化树分析 在
GenBank中检索发现，Sikrbcs1基因序列编码的氨基酸
序列与已经报道的其他高等植物：紫茎泽兰
Eupatorium adenophorum Spreng(ACO35888)、向日葵
Helianthusannuus (P08705)、黄 顶 菊 Flaveria bidentis
(Q39746)、菊花Dendranthema morifolium (AAO25119)、
黄 菊 花 Rudbeckia laciniata (P07089)、莴 苣 Lactuca
tatarica (AAF19793）、刺龙芽 Aralia elata(AFO67218)、
人参Panaxginseng (BAE46384)、苹果Malus pumila Mil
(AAA33866)、野草莓 Fragaria vesca(XP- 004299075)、
蓝桉树 Eucalyptus globules Labill(BAI53118)的氨基酸
序列具有较高的相似性，其中新疆雪Sikrbcs1与黄顶
菊和向日葵的相似性最高，达到 83.89%（图 7）。为了
分析新疆雪莲 Sikrbcs1与其他物种 rbcs基因间的亲缘
关系，利用MEGA4.1软件将 Sikrbcs1与GenBank中公
布的其他11个物种的 rbcs进行系统进化分析，结果显
示，新疆雪莲 Sikrbcs1与菊花亲缘关系最近，如图 8
所示。
2.3.2 新疆雪莲 Sikrbcs2同源性及进化树分析 通过
Blast同源性搜索，选取菜豆、蒺藜苜蓿、紫花苜蓿菊
花、黄顶菊、黄菊花、紫茎泽兰、人参、向日葵、苹果、刺
龙芽陆地棉同源性较高的 13个物种氨基酸进行多序
列比对发现同源性在46.96%~57.54%，和向日葵中 rbcs
最接近（图 9），对 13个物种的氨基酸序列建立系统发
图4 Sikrbcs2基因编码蛋白的氨基酸序列疏水性/亲水性预测
图5 Sikrbcs1基因的保守结构域的预测
图6 Sikrbcs2基因的保守结构域的预测
··264
育树，结果表明新疆雪莲Sikrbcs2与菊花中 rbcs聚为一
类（图10）。
3 讨论与结论
本试验以新疆雪莲幼苗为研究对象，利用文库随
机测序得到了2个 rbcs基因的全长 cDNA序列，这2个
rbcs基因的同源性只有 55%。生物信息学分析表明，
Sikrbcs1基因包含一个540 bp的完整开放阅读框，编码
179个氨基酸，基因所编码蛋白理论等电点8.90，蛋白
质相对分子质量20.1042 kD，负电荷氨基酸残基(Asp+
Glu)的数目共有16个，正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)的
数目共有 21个，不稳定系数为 32.41，属于稳定蛋白，
总平均亲水性为-0.256，该基因所编码蛋白是易溶、亲
图7 新疆雪莲Sikrbcs1蛋白的氨基酸序列与其他相关序列的多重比较
图8 新疆雪莲Sikrbcs1蛋白的氨基酸序列与其他物种的进化树
杨 晶等：新疆雪莲 rbcs基因的克隆及序列分析 ··265
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
图9 新疆雪莲Sikrbcs2蛋白的氨基酸序列与其他相关序列的多重比对
图10 新疆雪莲Sikrbcs2蛋白的氨基酸序列与其他物种的进化树
水性较强的蛋白，存在2个跨膜区域，具有 rbcs典型结
构域，属于Rubisco超级蛋白家族。Sikrbcs2基因包含
一个420 bp的完整开放阅读框，编码139个氨基酸，基
因所编码蛋白的理论等电点 7.58，相对分子质量
15.1093 kD，负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)的数目共有
12个，正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)的数目共有13个，
··266
不稳定系数为 36.17，属于稳定蛋白，总平均亲水性
为-0.082，该基因所编码蛋白是易溶、亲水性较强的蛋
白，不存在跨膜区域，不具有 rbcs典型结构域，属于
Rubisco超级蛋白家族。Sikrbcs1基因编码的氨基酸序
列与黄顶菊和向日葵的相似性最高，达到 83.89%。
Sikrbcs2基因编码的氨基酸序列与向日葵的相似性最
高，达到57.54%。
到目前为止人们已先后从豌豆、拟南芥、水稻、烟
草、矮牵牛、番茄、大豆等植物中克隆得到了 rbcs基
因。绝大多数 rbcs基因表达的研究主要集中在光、光
敏色素和生物钟的调控上[16]。研究发现 rbcs基因对水
杨酸、盐胁迫和干旱胁迫具有明显的应答反应，但不同
浓度的处理对 rbcs基因的转录有不同程度的诱导[17]。
此外 rbcs基因的表达还受温度和光照的调控。通过转
基因研究表明许多植物的 rbcs 5’端序列作为光诱导的
启动子或增强子控制着其mRNA编码蛋白水平 [18]。
rbcs基因可能在植物抗逆过程起重要作用[19]。
人们在研究Rubisco功能时发现其活性中心位于
大亚基上而多个小亚基编码基因 rbcs功能还不是很清
楚。研究表明小亚基可能具有的以下功能：聚集大亚
基的活性位点，促进CO2与Mg2+对Rubisco的活化，维
持和稳定Rubisco的活化构象[20]。通过对的烟草和水
稻大、小亚基的异源分子杂交发现，杂合酶的羧化和氧
化比值与小亚基的来源有很大的关系 [21]。Read和
Tabita用硅藻和蓝藻的实验结果也揭示小亚基在调控
Rubisco羧化/氧化比值方面的重要作用[22]。为此人们
希望用不同植物的大、小亚基组成全酶来提高羧化活
性和降低加氧活性。本研究克隆的 rbcs基因的编码蛋
白是否具有以上功能还要进一步去构建不同的植物表
达载体并转化植物探索其功能。
参考文献
[1] 曾乃燕,何军贤,赵文,等.低温胁迫期间水稻光合膜色素与蛋白水
平的变化[J].西北植物学报,2000,20(1):8-14.
[2] 陈善娜,邹晓菊,梁斌.水稻不同抗冷性品种幼苗叶细胞膜系统的
电镜观察[J].植物生理学通讯,1997,33(3):191-194.
[3] 谢潮添,杨盛昌,廖启炓,等.低温胁迫下董棕(Garyota urens L.)幼苗
叶肉细胞内 Ca2 +水平及细胞超微结构的变化[J].植物学通报,
2003,20(2):212-217.
[4] 沈文云,马德华.光照处理对黄瓜叶绿体超微结构的影响[J].园艺
学报,1995,22(4):397-399.
[5] 王毅,方秀娟,徐欣,等.黄瓜幼苗低温锻炼对叶片细胞叶绿体结构
的影响[J].园艺学报,1995,22(3):299-300.
[6] Yordanov I, Velikova V. Photoinhibition of photosystem Ⅰ [J].
Bulgarian Journal of PlantPhysiology, 2000,26: 70-92.
[7] 郭延平,张良诚,洪双松,等.温州蜜柑叶片气体交换和叶绿素荧光
对低温的响应[J].植物生理学报.2000,26(2):88-94.
[8] Hutchison R S, Groom Q, Ort D R. Differential effects of chilling
induced photooxidation on the redox regulation of photosynthesis
enzymes[J].Biochemistry,2000,39:6679-6688.
[9] Hetherington S E, He J, Smillie R M. Photoinhibition at low
temperature in chilling- sensitive and- resistant plants[J].Plant
Physiol,1989,90:1609-1615.
[10] 庄丽,李卫红,孟丽红.新疆雪莲资源的利用,研发与保护[J].干旱
区资源与环境,2006,20(2):195-202.
[11] Suzuki Y, Ohkubo M, Hatakeyama H et al. Increased Rubisco
Content in Transgenic Rice Transformed with the‘Sense’rbcS
Gene[J]. Plant Cell Physiol,2007, 48(4): 626-637.
[12] 曹玲珍,刁治民,雷青娟.雪莲资源及应用价值[J].青海草业,2006,
15(1):26-28.
[13] Oquist G, HunerN P A. Photosynthesis of overwintering ever-green
plants[ J]. Annu Rev Plant Biol, 2003, 54:329-355.
[14] Parry M A J, Andralojc P J, Mitchell R A C, et al. Manipulation of
Rubisco: the amount activity, function and regulation[J].Exp Bot,
2003,54:1321-1333.
[15] 夏兰芹,Soll Jürgen,何中虎.Rubisco小亚基前体蛋白 preSSU的互
作蛋白分析[J].作物学报,2006,(32)5:762-765.
[16] Matsuba K, Imaizumi N, Kaneko S, et al. Photosynthetic responses
to temperature of phosphoenolpyruvate carboxykinase type C4
species differing in cold sensitivity[J]. Plant Cell Environ, 1997,20:
268-274.
[17] Ivanov B, Edwards G. Influence of ascorbate and the Mehler
peroxidase reaction on non- photochemical quenching of
chlorophyll fluorescence in maize mesophyll chloroplasts[J].Planta,
2000,210:765-774.
[18] Wang Y R, Liu H X, Li P, et al. Effect of lowtemperature on
membrane lipid peroxidation of rice seedling photosynthetic
apparatus under the light and dark [J]. Acta Phytophyologica Sin.,
1986,12:244-251.
[19] 马德华,庞金安,李淑菊,等.短期强低温处理对黄瓜幼苗光合作用
的影响[J].河北农业大学学报,1998,21(2):39-42
[20] Spreitzer R J. Role of the small subunit of ribulose- 1,5-
bisphosphate carboxylase/ voxygenase[J].Arch Biochem Biophys,
2003,414:141-149.
[21] Du Y C, Hong S, Spreitzer R J. RbcS suppressor mutations improve
the thermal stability and CO2/O2 specificity of rbcL-mutant ribulose-
1,5- bisphosphate carboxylase/oxygenase[J].Proc Natl Acad Sci
USA, 2000,97(26):14206-14211.
[22] Livingston A K, Kanazawa A, Cruz J A. Regulation of cyclic
electron flow in C3plants: differential effects of limiting
photosynthesis at ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
and glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase[J]. Plant Cell
Environ, 2010,33(11):1779-1788.
杨 晶等：新疆雪莲 rbcs基因的克隆及序列分析 ··267