全 文 ：生 态 学 报 2011，31(8):2203—2208
Acta Ecologica Sinica
http:/ /www． ecologica． cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30872029) ;北京市自然科学基金重点项目(6071001) ;北京市自然科学基金项目(6092007)、北京市教
委重点项目(KZ201010020016) ;北京市教委平台建设项目(PXM2010 _014207 _098661) ;北京市属高校人才强教深化计划资助项目
(PHR20090516，PHR200906134)
收稿日期:2010-03-23; 修订日期:2010-07-01
* 通讯作者 Corresponding author． E-mail:glshi@ 126． com
旋覆花提取物对朱砂叶螨的生物活性及酶活性的影响
段丹丹1，王有年1，成 军1，仝宝生2，师光禄1，*
(1． 农业部都市农业(北方)重点开放实验室，北京农学院生物技术学院，北京 102206;
2． 内蒙古永业生物技术有限责任公司，内蒙古 010010)
摘要:研究了旋覆花石油醚提取物对朱砂叶螨的毒力作用及其对相关酶活性的影响。结果表明:旋覆花石油醚提取物的杀螨活
性较高，浓度为 2mg /mL时，校正死亡率达到 92． 05%。通过对旋覆花石油醚提取物进一步萃取、柱层析分离、薄层层析，发现最
终得到的 38 个流分中，杀螨效果较好的是流分 7，其校正死亡率为 85． 53%。流分 7 经 GC /MS鉴定为羽扇豆醇，其校正死亡率
达到 66． 46%。进一步测定羽扇豆醇对朱砂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶、Ca2 + -ATPase、过氧化物歧化酶的活性以及总蛋白含量的
影响，结果表明经羽扇豆醇处理后，螨体内过氧化物歧化酶被激活，而谷胱甘肽-S-转移酶和 Ca2 + -ATPase均受到不同程度的抑
制，蛋白总量在这个过程中没有明显的变化。结果表明旋覆花提取物羽扇豆醇可以有效地杀死朱砂叶螨，这为旋覆花作为新型
植物源农药提供一定的理论依据。
关键词:旋覆花;羽扇豆醇;朱砂叶螨;酶活性
The toxicity of lupeol of Inula britanica on Tetranychus cinnabarinus and its effects
on mite enzyme activity
DUAN Dandan1，WANG Younian1，CHENG Jun1，TONG Baosheng2，SHI Guanglu1，*
1 Key Laboratory of Urban Agriculture (North)of Ministry of Agriculture P． R． China;College of Biotechnology Beijing University of Agriculture，Beijing
102206，China
2 Inner Mongolia Yongye Biotechnology Co．，Ltd．，Neimenggu 010010，China
Abstract:The aim of the study is to determine the acaricidal compounds of Inula britanica extracts and its action
mechanism． Petroleum ether extract of I． britanica were found to have high acaricidal activity to Tetranychus cinnabarinus
with a mortality of 92． 05% at the concentration of 2mg /mL． Afterwards，the petroleum ether extracts of I． britanica were
further purified using column chromatography，and 38 fractions were got． The toxicities of these 38 fractions to T．
cinnabarinus were determined． Fraction-7 was found to have high acaricidal activity to T． cinnabarinus with a mortality of
85． 53% at the concentration of 2mg /mL． The main compounds of the high bioactive fraction-7 were identified by GC-MS．
Lupeol was identified from fraction-7 of I． britanica by GC-MS，and lupeol was found to have high acarcidal activity to T．
cinnabarinus with a mortality of 66． 46% at the concentration of 2mg /mL． Lupeol may be main acaricidal compounds of I．
britanica extracts．
The effects of lupeol on the activities of Glutathione-S-transferase (GSTs) ，Ca2 + -ATPase，SOD and protein content of
T． cinnabarinus were assayed by colorimetric method at the 4th，8th，12th，16th，20th and 24th hour after treated with
Lupeol． The results showed that the activities of GSTs at the 4th、12th hour post lupeol treatment were higher than those of
the control group． Especially the GSTs activities of the control mites were 82% of the treated group at the 12th hr post
treatment． However，GSTs activities of the lupeol treated mites were restrained at the 8th，16th，20th and 24th hr post
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treatment． As to Ca2 + -ATPase activity，the change trend of the specific activities of Ca2 + -ATPase of the treated mites were
similar to that of the control group mites． However，the activities of Ca2 + -ATPase of the lupeol treated mites were lower than
the control group all along the 24 h post treatment． Particularly the activities of Ca2 + -ATPase of the control group were 2．
1 times of the treated mites at the 16th hr post treatment． Similarly，the change trend of the activities of SOD of the treated
mites were similar to those of the control group． In addition，the activities of SOD of the treated mites were higher than the
control group all along the 24 h post treatment，and the activities of SOD of the treated mites were 1． 5 times of the control
group at the 8 th hr post treatment． The results showed that the change trend of the total protein content of the treated mites
were similar to that of the control group the total protein content of the mites． The total protein content of the treated mites
were higher than the control group before 12th hr post treatment，and then the total protein content of the treated mites were
lower than the control group after 12th hr post treatment． Prticularly the total protein content of the treated mites were 1． 5
times of the control group at 4th hr post treatment．
Furthermore，statistical analysis revealed that the main enzyme activities of the mites were changed by Lupeol，which
may finally lead the mites to death． These results suggested that lupeol of the petroleum ether extract of I． britanica had
acaricidal activities against T． cinnabarinus． These data provided useful information for the use of I． britanica as a novel
resource of botanical acaricides．
Key Words:Inula britanica;Lupeol;Tetranychus cinnabarinus;enzyme activity
植食性螨类具有个体小、繁殖快、种群密度大、为害重等特点，是难以防治的有害生物类群［1］。朱砂叶螨
(Tetranychus cinnabarinus)隶属蛛形纲、真螨目、叶螨科，主要危害果蔬和温室植物［2-3］。目前化学杀螨剂对环
境污染严重，对害螨产生抗药性，寻找新型杀螨物质是亟待解决的重要研究课题。已有报道核桃叶［4］，瑞香
狼毒［5］，地肤［6］等植物中存在杀螨活性物质。旋覆花在我国常供药用，《神农本草经》中记载其常用于治疗外
感发热、小便不利、痈疮肿毒、湿疹等。从本属植物中得到的许多倍半萜类化合物具有良好的细胞毒活性，是
一种极具潜在药用价值的传统中药。近年来人们也在注意其在抑菌活性中的研究和应用，但对于其杀螨活性
的研究却未见报道。
羽扇豆醇属三萜类化合物，具有广泛的生物活性:在动物实验中有抗炎［7］、抗氧化［8］、促进皮肤愈合［9］等
药理作用。但关于其对螨类的活性和作用机理尚不明确。
本实验以朱砂叶螨为研究对象，通过研究发现旋覆花石油醚提取物羽扇豆醇有较好的杀螨效果。测定了
羽扇豆醇对它的生物活性，探讨了其杀螨作用机制。发现了旋覆花提取物羽扇豆醇主要通过影响螨体内参与
代谢的几种重要酶的活性来杀螨的。此项研究表明旋覆花作为新型植物杀螨剂具有良好的开发前景。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
将试验所用旋覆花粉碎后在室内阴干(约 25℃) ，过 60 目筛，放入冰箱中储藏备用。
朱砂叶螨为室内饲养的敏感品系，在人工气候室内连续饲养多年，饲养条件为:室温 (24 ± 1)℃，相对湿
度(60 ± 10)%，光照条件 L∶ D为 18h∶ 6h。饲养过程中不接触任何药剂，将该品系视为敏感品系。
1． 2 旋覆花活性成分的提取
采用冷浸提取的方法，将植物干粉加入 5 倍量的石油醚，浸泡 3—5d，过滤，取浸提液，室温下(25 ± 2)℃
浸提 3 次，合并 3 次的提取液减压浓缩，得石油醚提取物。
1． 3 旋覆花活性成分的分离
称取石油醚提取物 6g，采用常压柱层析法进行层析分离。洗脱后的流分经薄层层析检测合并，收集到 38
个流分，减压浓缩至稠状，待用。
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1． 4 生物活性分析
用直接浸液法测定毒杀作用。触杀作用采用 FAO［10］方法测定螨类抗药性的标准。试验重复 3 次，1%
吐温-80溶液为对照。按 Abbort公式计算校正死亡率［11］。
1． 5 酶液制备
分别取触杀处理后 4、8、12、16、20、24h 朱砂叶螨雌成虫 150 头，加 0． 25mL 生理盐水在冰浴中匀浆，
10000r /min、4℃下离心 10min，取上清液备用［12］。其中测总蛋白含量的试螨放入 0． 125mL 生理盐水中;谷胱
甘肽-S-转移酶置于 60mmol /L磷酸缓冲液(pH7． 0)中。
1． 6 蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量［13］。取酶液 0． 1mL 于试管中，对照管中加入 0． 1mL 磷酸缓冲液，5mL
考马斯亮蓝 G-250 试剂，混匀，25℃ 水浴加热 2min，于 595nm波长处比色测定 OD值。根据标准曲线计算出
蛋白质含量。
1． 7 酶活性测定
谷胱甘肽-S-转移酶参照《植物化学保护研究方法》［14］中的有关方法进行酶活性测定。每毫克组织蛋白，
在 37℃反应 1min扣除非酶促反应，使反应体系中 GST浓度降低 1umol /L 为一个酶活力单位;Ca2 + -ATP 酶活
力测定:参照刘素媛［15］的方法，以每分钟分解每毫克组织蛋白产生的无机磷的含量来表示酶活力;过氧化物
歧化酶活性测定:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羫胺形成亚硝酸盐，
在显色剂作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当测定样品中含有 SOD时，则对超氧阴离子
自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过
公式计算可求出被测样品中的 SOD活力。
2 结果与分析
2． 1 旋覆花石油醚提取物、流分 7 以及羽扇豆醇对朱砂叶螨生物活性的影响
首先通过生物活性分析测定石油醚提取物、石油醚提取物分离得到的流分 7 以及羽扇豆醇对朱砂叶螨生
物活性的影响。其中旋覆花石油醚提取物、流分 7 以及羽扇豆醇对朱砂叶螨的触杀作用比较明显(表 1)。从
表 1 可以看出，旋覆花石油醚提取物的杀螨活性很高，24h 校正死亡率达到 92． 05%;流分 7 对朱砂叶螨 24h
校正死亡率达到 85． 53%;羽扇豆醇对朱砂叶螨 24h校正死亡率达到 62． 64%。
表 1 旋覆花提取物对朱砂叶螨的触杀作用*
Table 1 The mortality of extracts from Inula britanica against Tetranychus cinnabarinus
旋覆花提取物 Extracts /(2 mg /mL) 提取率 Extraction rate /% 死亡率 Mortality /%
石油醚提取物 Petroleum ether extract 1． 56 ± 0． 09a 92． 05 ± 1． 4250a
流分 7 Fraction 7 0． 98 ± 0． 03b 85． 53 ± 1． 0596b
羽扇豆醇 Lupeol 0． 81 ± 0． 03b 62． 64 ± 0． 2802c
* 表中数据为 3 次试验重复结果(平均值 ±标准误) ;同一列的不同字母表示差异显著(P ＜ 0． 05)
2． 2 最佳流分 GC /MS测定
将对朱砂叶螨的触杀效果较好的流分 7 进行 GC /MS 测定，流分 7 的 GC /MS 检测表明，其主要成分为羽
扇豆醇，匹配度达到了 90%以上(图 1)。且由于其纯度较高，因此选择该物质进行毒理研究。
2． 3 对朱砂叶螨体内谷胱甘肽-s-转移酶活性的影响
由图 2 可以看出，对照组的朱砂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶活性随时间推移有先上升后下降的趋势。对照
组和处理组整体趋势保持一致。用羽扇豆醇处理朱砂叶螨后，朱砂叶螨体内谷胱甘肽-S-转移酶活性在处理
8h后被激发，并在 12h达到高峰。之后，羽扇豆醇对其谷胱甘肽-S-转移酶活性进行抑制。在 4、12h 时，处理
组酶活性高于对照组，特别是在 12h对照组酶活性只有处理组的 82%。然而在其他时间段，处理组的酶活性
均低于对照组，说明羽扇豆醇对朱砂叶螨体内的谷胱甘肽-S-转移酶的活性，在 4、12h 时有激活作用，其他时
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间有抑制作用。
图 1 流分 7 的 GC/MS 总离子流图
Fig． 1 Total ion current analysis of G7
图 2 羽扇豆醇对朱砂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响
Fig． 2 Effect of GST activity of the Lupeol against Tetranychus
cinnabarinus
2． 4 对朱砂叶螨体内 Ca2 + -ATP酶活性的影响
图 3 羽扇豆醇对朱砂叶螨 Ca2 + -ATP酶活性的影响
Fig． 3 Effect of Ca2 + -ATPase activity of the Lupeol against
Tetranychus cinnabarinus
大多数杀螨剂是通过干扰神经系统来发挥致死作
用的，Ca2 + -ATP 酶在调节神经细胞兴奋与传导中起重
要调节作用。然而，羽扇豆醇是否是通过调节 Ca2 + -
ATP酶活性来杀死螨虫的?Ca2 + -ATP酶活性检测实验
显示(图 3) ，用羽扇豆醇处理朱砂叶螨，处理组各个时
间点的 Ca2 + -ATP酶活性始终低于对照组，处理组的酶
活性从 4h到 8h有略微上升趋势，从 8h 开始到 16h 急
剧下降，随后从 16h 到 20h 又有所上升，20h 到 24h 再
次下降。处理组和对照组整体趋势保持一致。但是在
16h时对照组的酶活性是处理组的 2． 1 倍。这说明羽
扇豆醇对朱砂叶螨体内的 Ca2 + -ATP 酶活性有强烈抑
制作用。
2． 5 对朱砂叶螨体内过氧化物歧化酶活性的影响
由图 4 中可以看出，用羽扇豆醇处理过的朱砂叶螨体内过氧化物歧化酶活性随着时间的推移有先升高后
降低的趋势，其活性一直大于对照组，尤其是在作用后的 4—12h更明显，特别是 8h时药剂诱导刺激处理组酶
活性为对照组的 1． 5 倍左右。从总体趋势来看，朱砂叶螨经羽扇豆醇处理后，与对照组相比整体趋势保持一
致，但是，处理组的过氧化物歧化酶活性一直高于对照组，这说明羽扇豆醇对朱砂叶螨体内过氧化物歧化酶有
较强的激活作用。
2． 6 对朱砂叶螨体内总蛋白含量的影响
从图 5 中可以看出，在 10h前，处理组的总蛋白含量是高于对照组的，特别是在 4h，处理组是对照组的
1. 5 倍。但是在 12h后，处理组的总蛋白含量开始低于对照组的总蛋白含量。从 12—16h 总蛋白含量急剧下
降，从 16—20h总蛋白含量又有所上升，从 20—24h总蛋白含量再次下降，从整体趋势上看，用羽扇豆醇处理
朱砂叶螨后对照组和处理组总蛋白含量变化趋势基本一致。
3 讨论
许多植物中广泛存在杀螨活性物质，然而植物源杀螨剂的开发仍是一个漫长的过程，目前对于植物源杀
螨活性物质发现及其组分鉴定方面研究还很少。实验发现旋覆花石油醚提取物的杀螨活性较高。为此我们
对旋覆花石油醚提取物进一步萃取、柱层析分离和检测生物活性，发现提取物中流分 7 杀螨效果较好，流分 7
经 GC /MS鉴定为羽扇豆醇。羽扇豆醇的提取和鉴定为植物源杀螨剂的开发提供重要的理论依据。
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图 4 羽扇豆醇对朱砂叶螨 SOD酶活性的影响
Fig． 4 Effect of SOD activity of the Lupeol against Tetranychus
cinnabarinus
图 5 羽扇豆醇对朱砂叶螨总蛋白含量的影响
Fig． 5 Effect of protein content of the Lupeol against
Tetranychus cinnabarinus
谷胱甘肽-S-转移酶、Ca2 + -ATP酶和超氧化物歧化酶都是生物体内重要的酶系，对维持朱砂叶螨正常的
生命活动起重要的调节作用。前面的实验结果显示羽扇豆醇对朱砂叶螨校正死亡率较高，然而，羽扇豆醇是
否是通过影响朱砂叶螨体内酶系而发挥作用?谷胱甘肽-S-转移酶是生物体内重要的解毒酶系，能催化生物
体内的还原型谷胱甘肽与外源化合物的亲电子基团发生轭合，最终形成硫醚氨酸排出体外，从而降低它们的
细胞毒性。并且该酶在谷胱甘肽过氧化物酶活力高的条件下，具有清除体内脂质过氧化物的功能，酶活力的
升高可作为昆虫解毒代谢作用的敏感指标能有效促进外源有毒物质在体内分解代谢［16］。当外源有毒物质进
入生物体后，会引起代谢酶活性的增高来加强代谢作用，对其进行分解，保证生物体的正常生理活动。实验结
果发现用羽扇豆醇处理朱砂叶螨后，在 4、12h时，处理组酶活性高于对照组，特别是在 12h对照组酶活性只有
处理组的 82%。说明羽扇豆醇对朱砂叶螨是具有毒性的，因此激发了朱砂叶螨体内的谷胱甘肽-S-转移酶的
活性。师光禄等发现万寿菊根提取物刺激了山楂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶的活性显著升高［17］。曹挥等也通
过研究发现河朔荛花活性成分对山楂叶螨体内的谷胱甘肽-S-转移酶的活性具有激活作用［18］。说明羽扇豆
醇对朱砂叶螨也起到了类似的作用，对朱砂叶螨具有一定的毒性。然而在其他时间段处理组的酶活性均低于
对照组，可能是由于羽扇豆醇对朱砂叶螨体内的谷胱甘肽-S-转移酶的活性有抑制作用。
羽扇豆醇对 Ca2 + -ATP酶活性也有很强的抑制作用。Ca2 + -ATP 酶的主要功能是调节膜外的 Ca2 +浓度，
Ca2 +是神经信号传导过程中的重要物质。在本实验中，用羽扇豆醇处理朱砂叶螨后，朱砂叶螨体内的 Ca2 + -
ATP酶的活性受到抑制，导致害螨不能进行正常的神经信号传导，使害螨过度兴奋，最后因过度兴奋致死。曹
挥等也发现河朔荛花活性成分对山楂叶螨体内的对 Ca2 + -ATP 酶的抑制是山楂叶螨导致死亡的重要因素
之一［18］。
过氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除过氧阴离子自由基
(O －2 )保护细胞免受损伤。本实验用羽扇豆醇处理朱砂叶螨后，处理组的过氧化物歧化酶活性始终高于对照
组的过氧化物歧化酶活性，说明羽扇豆醇对朱砂叶螨的细胞产生了氧化作用。实验发现旋覆花提取物羽扇豆
醇是通过激活或抑制朱砂叶螨体内的重要酶的活性来实现杀螨作用的。旋覆花提取物羽扇豆醇杀螨机制的
研究为其作为新型植物源杀螨剂提供了重要的理论依据。
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