全 文 ：2015年第1期
摘要：异柠檬酸裂解酶是乙醛酸支路中的关键酶，研究褐环黏盖牛肝菌中异柠檬酸裂解酶的基因序列，能为今后研
究其结构和性质提供科学依据。关于未知序列引物的设计，使用NCBI，UniProt，PROSITE，Blast等生物信息资源和
DNAMAN，Oligo 6.0等生物软件，结合异柠檬酸裂解酶的催化模体和密码子的偏好性，设计褐环黏盖牛肝菌中异柠
檬酸裂解酶的简并引物。简并引物的成功设计，对后续褐环黏盖牛肝菌中异柠檬酸裂解酶基因的克隆奠定基础。结
果表明，简并引物的设计能够提高引物的特异性，有利于试验成功。
关键词：褐环黏盖牛肝菌；异柠檬酸裂解酶；简并引物
中图分类号：S646 文献标志码：A doi：10.3969/jissn.1671-9646（X）.2015.01.035
Degenerate Primers Design ofSuillus Luteus Isocitrate Lyase Gene
HUANG Lei，XING Yanping，*CHEN Youjun
（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018，China）
Abstract：Isocitrate lyase is the key enzyme of glyoxalic acid branch. Researching the gene sequences of isocitrate lyase in the
Suillus luteus can provide the scientific basis for future studies of its structure and properties. This article explores about the
design of the unknown sequence primers. Used NCBI，UniProt，PROSITE，Blast and other biological information resources
and DNAMAN，Oligo 6.0 biological software，and combined with isocitrate lyase catalytic motif and bias of codon，to design
Suillus luteus isocitrate lyase degenerate primers. The successful design of the degenerate primers lay the foundation for the
subsequent cloning ofSuillus luteus isocitrate lyase gene. The results show that the design of degenerate primers can improve
the specificity of the primers，which is helpful to the successful of the experiments.
Key words：Suillu luteus；isocitrate lyase；degenerate primers
收稿日期：2014-09-16
作者简介：黄 蕾（1988— ），女，在读硕士，研究方向为微生物生理与发酵工艺。
*通讯作者：陈有君（1961— ），男，博士，硕士生导师，研究方向为微生物生理与发酵工艺。
聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction，
PCR） 又叫体外基因扩增或无细胞分子克隆系统，是
20世纪后期发展起来的一种能够在体外扩增特异性
DNA片断的技术。自其发明以来，就一直是生物学
者们构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控等研
究的必要前提和基础[1]，由于其具有快速、简便及高
度敏感等优点，能够极大地缩短目的基因扩增时
间[2]，更是被广泛应用于分子生物学、基因工程、遗
传学及农业科学等领域。引物设计是PCR 技术中至
关重要的一环，找到1对合适的核苷酸片段作为引
物，使其有效地扩增模板 DNA 序列，无疑决定着
PCR的成败[3]。
笔者研究的褐环黏盖牛肝菌中异柠檬酸裂解酶
的序列是没有收录的，对于这类未知序列PCR要求
设计的引物必须确保对预期产物具有高度特异性，
并且允许存在预测的碱基差别。针对这种情况，本
文采用结合引物设计的原则，进行人工设计褐环黏
盖牛肝菌中异柠檬酸裂解酶基因的简并引物。
1 引物设计前的准备工作
1.1 褐环黏盖牛肝菌中异柠檬酸裂解酶基因设计的
目的及意义
褐环黏盖牛肝菌[Suillus luteus（L.：Fr） Gray]，
隶属于真菌界、担子菌纲、伞菌目、牛肝菌科、黏
盖牛肝菌属[4]，是一种应用价值较高的外生菌根真
菌，能极大地提高宿主植物对不良环境的适应能力，
抗盐碱胁迫、抗重金属、改善磷营养，做成菌根菌
剂后将会有巨大的市场空间；并且其子实体营养丰
富，有较高的食用价值和药用价值，具有显著的经
济效益[5]；它所产生的植物激素、抗生素、酶和挥
发性物质，对植物生长发育及分化起着调控等多重
作用[6-7]。
异柠檬酸裂解酶是乙醛酸支路中的关键限速酶，
负责催化异柠檬酸裂解成琥珀酸和乙醛酸，与苹果
褐环黏盖牛肝菌中异柠檬酸裂解酶基因的简并引物设计
黄 蕾，邢燕平，*陈有君
（内蒙古农业大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）
文章编号：1671-9646（2015） 01b-0019-04
第1期（总第376期） 农产品加工 No.1
2015年1月 Farm Products Processing Jan.
农产品加工 2015年第1期
酸合酶以及三羧酸循环中的部分反应共同组成乙醛
酸循环[8]。乙醛酸支路是可以补充三羧酸循环的重要
代谢途径之一，最主要的作用是绕过三羧酸循环中
的2个氧化步骤，从而保护乙酰辅酶A中的碳不被
转化成二氧化碳，而是被用来合成细胞生命物质[9]，
异柠檬酸裂解酶的作用就在于此。它的产物经脱碳
后生成的草酰乙酸利用糖异生途径形成葡萄糖，进
一步生成蛋白质和核酸，而琥珀酸则可补充三羧酸
循环的一些中间产物[10-11]。
通过查阅国内外文献发现，目前对真菌中异柠
檬酸裂解酶的研究较少，NCBI 上尚无褐环黏盖牛
肝菌中异柠檬酸裂解酶的基因序列记载，且褐环黏
盖牛肝菌的全基因序列也未收录，所能查到的最相
近的物种与褐环黏盖牛肝菌同属伞菌目，差距较
大，这对该基因的扩增、克隆及测序有很大难度，
因此要求设计符合序列特性和稳定性的引物[12]具有
重大意义。
1.2 获取基因序列做模板
在扩增未知基因引物设计时，模板的选择需要
根据比较基因组定位的原理，选择研究具有保守功
能基因的DNA，mRNA和蛋白质序列为模板来设计
引物。
现在，进行引物设计时常用的核酸、蛋白质等
数据库有 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）——核
酸数据库，UniProt （http://www.uniprot.org/）——蛋
白质数据库，PROSITE（http://prosite.expasy.org/）
——蛋白质功能位点数据库。
在上述的几大数据库中，可以获得想要的基因
序列。
2 引物设计
2.1 引物设计的原则
引物设计有3条基本原则：引物与模板的序列
要紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚
体或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发
DNA聚合反应（即错配）。具体实现这3条基本原则
需考虑的因素有引物长度、产物长度、序列Tm值、
引物与模板形成双链的内部稳定性、形成引物二聚
体及发夹结构的能值、在错配位点的引发效率、引
物及产物的GC含量等[13]。具体来说，要遵循下面的
原则：
（1） 引物的长度一般为 15~30 bp，常用的是
18~24 bp，但不应大于 38 bp。因为太短易形成错
配，降低特异性；而过长也会降低特异性，并且降
低产量。
（2） 引物应在保守区内设计并具有特异性，若
模板是DNA，引物所在模板应该位于外显子区，这
样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和分析。
（3） G+C含量在40%~60%之间，且上下游引物
序列的G+C含量差异不能太大，尤其3端最后5个
碱基最好不要富含G+C，特别是连续3个的G或C。
且上下游引物不能发生互补，避免产生引物二聚体。
（4） 引物自身的4种碱基要随机分布，不要有
连续3个以上碱基存在，更不能有连续3个以上碱
基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构，形成
引物本身复性。
（5） 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃
左右复性条件最佳，两引物间的Tm值越近越好。
（6）△G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，
该值反应了双链结构内部碱基对的相对稳定性，应
该以5端向3端递减。
（7） 引物3端不可修饰，对引物的修饰一般是
在5端引进酶切位点和标记物。
2.2 引物设计软件
目前，常用到的引物设计软件DNAMAN，Primer
Premier5.0等，除此之外还需要结合Blast，DNAstar，
Oligo 6.0等软件进行分析。
2.3 引物设计方法
引物设计流程见图1。
2.3.1 利用生物信息数据库，查找异柠檬酸裂解酶
的基因序列
从NCBI和UniProt数据库中查找异柠檬酸裂解
酶的核苷酸序列和氨基酸序列，从中找出与褐环黏
盖牛肝菌物种最为接近的几种真菌，分别是裂褶菌
（Schizophyllum）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、双
色蜡蘑（Laccaria bicolor）、灰盖鬼伞菌（Coprinopsis
cinerea）、粉孢革菌 （Coniophora puteana）、念珠菌
（Moniliophthora） 等。在PROSITE数据库中查找异柠
檬酸裂解酶具有保守的催化模体，序列是KKCGH。
2.3.2 利用软件进行比对分析
在DNAMAN软件中对上述几个序列进行比对，
发现异柠檬酸裂解酶基因保守性不是很高，只能将
高度保守的催化模体序列当做一条引物，继续查找
比对。最终确定 2 段高保守的连续氨基酸序列区，
分别为 KKCGHMAGKVLVP 和 YNLSPSFNWE。但
是，用这2条引物进行PCR不能获得全部的异柠檬
图1 引物设计流程
获取DNA，mRNA，蛋白质序列（NCBI，UniProt，PROSITE）
整理序列获得保守序列，比对分析（DNAMAN，Blastn/p）
引物设计（DNAMAN结合密码子偏好性）
引物筛选及优化（DNAMAN，Oligo6.0等）
PCR扩增试验验证（凝胶成像系统）
20· ·
2015年第1期
酸裂解酶基因，只能得到其中一部分，约为600 bp。
2.3.3 引物筛选及优化
将保守的氨基酸序列对应到NCBI的核苷酸序列
中，得到的核苷酸序列并不单一，具有多种情况，
此时需要结合真菌中密码子的偏好性，选定几种可
能的简并引物，利用Oligo 6.0对选定的简并引物进
行分析（有无发夹结构及二聚体等），最后分别筛选
出4条上游引物和4条下游引物，交送上海生工生
物工程有限公司合成。
最终通过PCR扩增后的凝胶成像进行试验验证：
看特异性如何，是否会形成引物二聚体条带，PCR
扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。
3 结果
3.1 引物设计结果
筛选出的上、下游引物见表1。
3.2 PCR 电泳结果
以上述引物进行PCR扩增，上游引物HU4和下
游引物HD3组合，得到的PCR产物条带单一，特异
性最高，片段大小为600~700 bp，与预测结果基本
一致。
异柠檬酸裂解酶基因部分PCR结果见图2。
3.3 PCR产物分析
PCR产物经测序后得知片段大小为612 bp，测
序结果通过Blastx检索GenBank进行相似性比较。
所测片段在经Blastx比对后的相似性结果见表2。
由表2可以看出，克隆的褐环黏盖牛肝菌异柠
檬酸裂解酶基因所编码的氨基酸序列与粉孢革菌的
异柠檬酸裂解酶氨基酸序列相似性达到了80%以上，
与双孢蘑菇、双色蜡蘑、裂褶菌、念珠菌、灰盖鬼
伞菌的异柠檬酸裂解酶基因所编码的氨基酸序列相
似性都达到了70%以上。所以，获得的片段属于异
柠檬酸裂解酶基因。
4 引物设计时的注意问题
现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，
可以直接提交模板序列到特定网页，也可以在本地
计算机上运行引物设计专业软件[14]，得到设计好的引
物，这些都是扩增已知的序列。但是，还有许多类
似的情况需要扩增未知序列，如基因家族不同成员
的克隆、不同品种鉴别基因的克隆，像本试验这种
亲缘关系较远的情况，只能通过氨基酸序列数据模
糊推测的基因序列克隆，这类产物PCR要求设计的
引物必须确保对预期产物高度特异性，并且允许存
在预测的碱基差别[15]。
在DNAMAN软件中对上述几个序列进行比对，
发现异柠檬酸裂解酶基因保守性不是很高。由于研
究的是酶，所以一定具有的高保守片段是酶的催化
区域，这样就能确定其中一条序列，再通过
DNAMAN软件比对确定了另外一条保守序列，就可
以在这2段高度保守区中筛选引物了。由于通过氨
基酸序列推测核苷酸序列来设计引物产生的引物有
很多条，此时就需要结合真菌中密码子的偏好性，
然后利用DNAMAN观察上下游引物与模板mRNA的
匹配度，再结合Oligo 6.0对引物进行分析，最后根
据片段长度来确定最合适的引物对。由于本试验的
保守序列用作引物较长，导致找不到各种指标都十
分合适的引物，但是为提高引物的特异性，在这种
情况下就只能退而求其次，尽量满足条件。
虽然，设计特异性引物有一些规律可循，但是
在试验过程中仍有较大的不确定性和偶然性。对于
不能直接使用软件设计未知序列引物的情况，设计
者只有查阅大量的文献，通过大量试验才可确定符
合条件的引物，引物的成功设计，为后续的序列研
究提供了前提条件。
表1 筛选出的上、下游引物
引物名称 引物序列
退火温度
θ /℃
上游HU1
上游HU2
上游HU3
上游HU4
下游HD1
下游HD2
下游HD3
下游HD4
5-CAAGAAGTGCGGCCACATGGCTGGCAAG-3
5-CAAAAAGTGTGGCCACATGGCGGGCAAG-3
5-CAAGAAATGTGGTCATATGGCTGGCAAG-3
5-CAAGAAGTGCGGTCATATGGCTGGCAAG-3
5-CCAGTTGAAGGATGGACTCAAGTTGTA-3
5-CCAATTGAAGGAAGGGCTCAGGTTGTA-3
5-CCAGTTGAACGACGGGCTGAGGTTGTA-3
5-CCAATTGAACGACGGGCTCAGGTTGTA-3
69.3
67.9
63.5
66.4
62.0
63.5
66.6
65.0
图2 异柠檬酸裂解酶基因部分PCR结果
M-Maker DL 1000；1，2-icl中间片段
1000
700
500
400
300
200
100
M 1 2
表2 所测片段在经Blastx比对后的相似性结果
GenBank登录号 物种 分值/分 期望值 同源性/%
XP_007319729.1
XP_006462690.1
XP_001875907.1
XP_003034466.1
XP_007845644.1
XP_001835698.1
粉孢革菌
双孢蘑菇
双色蜡蘑
裂褶菌
念珠菌
灰盖鬼伞菌
350
340
328
326
323
320
2×10-115
4×10-112
1×10-106
9×10-106
9×10-105
3×10-103
81
78
74
75
76
73
黄 蕾，等：褐环黏盖牛肝菌中异柠檬酸裂解酶基因的简并引物设计 21· ·
农产品加工 2015年第1期
pressure superheated steam and far infrared radiation dry-
ing [J] . Applied Thermal Engineering，2007，27（14/15）：
2 483-2 494.
李宝玉，毕金峰，钟耕. 香蕉干燥技术研究进展 [J] . 食
品科学，2009，30（23）：539-543.
Xiao H W，Pang C L，Wang L H，et al. Drying kinetics
and quality of Monukka seedless grapes dried in an air -
impingement jet dryer [J] . Biosystems Engineering，2010，
105（2）：233-240.
Bórquez R. Stability of n -3 fatty acids in fish particles
during processing by impingement jet [J] . Journal of Food
Engineering，2003，56（2/3）：245-247.
Hadrich B，Kechaou N. Mathematical modeling and simu－
lation of shrunk cylindrical materials drying kinetics -Ap－
proximation and application to banana [J] . Food and bio－
products processing，2009，87（2）：96-101.
Doymaz I. Air drying characteristics of tomatoes [J] . Jour－
nal of Food Engineering，2007，78（4）：1 291-1 297.
肖旭霖，高晓丽，李文峰，等. 采用热管气体射流冲击
技术干燥香菇 [J] . 食品与发酵工业，2012，38（10）：
106-110.
Baini R，Langrish T A G. Choosing an appropriate drying
model for intermittent and continuous drying of bananas [J] .
Journal of Food Engineering，2007，79（1）：330-343.
Falade K O，Solademi O J. Modelling of air drying of fresh
and blanched sweet potato slices [J] . International Journal
of Food Science and Technology，2010，45（2）：278-288.
Swasdisevi T，Devahastin S，Sa-Adchom P，et al. Math－
ematical modeling of combined far -infrared and vacuum
drying banana slice [J] . Journal of Food Engineering，2009，
92（1）：100-106.
Doymaz I. Effect of dipping treatment on air drying of
plums [J] . Journal of Food Engineering，2004，64（4）：
465-470.
李哲，李芬芳，袁德保，等.超声波辅助提取低褐变程度
香蕉皮中总酚的研究 [J] .现代食品科技，2012，28（9）：
1 166-1 172. ◇
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
(上接第15页)
蔡旋 . 微生物源性抗氧化剂体外抗氧化能力的初步研
究 [J] . 生物技术，2011，21：84-87
Folch-Cano C，Jullian C，Speisky H，et al. Antioxidant
activity of inclusion complexes of tea catechins with β -
cyclodextrins by ORAC assays [J] . Food Res. Int.，2010，
43：2 039-2 044.
Cao G， Prior R L. Measurement of oxygen radical ab－
sorbance capacity in biological samples [J] . Methods En－
zymol，1999，299：50-62.
蔡旋，王元凤，毛芳芳，等. 茶花粗多糖的降血糖作用
和对高血糖的预防作用 [J] . 现代食品科技，2011，27：
262-266.
Wei X，Cai X，Xiong S，et al. Hypoglycemic effect of oral
crude tea flower polysaccharides on alloxan modeling
Sprague-dawley rats and the possible mechanism [J] . Cy－
TA-Journal of Food，2012（5）：1-8.
万娅琼，伍玉菡. 抹茶蛋糕加工工艺研究 [J] . 安徽农学
通报（上半月刊），2011，23：169-170.
曾维才，贾利蓉. 松针提取物抑菌作用的研究 [J] . 食品
科学，2009，30（7）：87-90.
李勇，孔令青，高洪，等. 自由基与疾病研究进展 [J] .
动物医学进展，2008（4）：85-88.
Cai X，Chen X，Wang X， et al. Pre-protective effect of
lipoic acid on injury induced by H2O2 in IPEC-J2 cells [J] .
Molecular and Cellular Biochemistry，2013，378：73-81.◇
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
(上接第18页)
参考文献：
艾得希 H A. PCR 技术-DNA 扩增的原理与应用 [M] .
北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，
1991：24-30.
卢圣栋. 现代分子生物学实验技术 [M] . 北京：中国协
和医科大学出版社，1999：467-477.
任亮，朱宝芹，张轶博，等 . 利用软件 Primer Premier
5.0 进行 PCR 引物设计的研究 [J] . 锦州医学院学报，
2004，25（6）：43-46.
李敏. 褐环乳牛肝菌 （Suillusluteus（L:Fr.） Gray） 发酵
生物学的研究 [D] . 呼和浩特：内蒙古农业大学，2007.
蔡楠楠 . 褐环黏盖牛肝菌菌丝与培养基 pH 的相互作
用 [D] . 呼和浩特：内蒙古农业大学，2011.
刘杨. 褐环黏盖牛肝菌培养条件的研究 [D] . 呼和浩特：
内蒙古农业大学，2007.
刘淑清，陈有君，包健. pH条件和接种量对褐环乳牛肝
菌生长影响 [J] .内蒙古科技与经济，2008（11）：29-31.
张洁琼. 异柠檬酸裂解酶基因克隆与表达特征研究 [D] .
长春：长春工业大学，2010.
赖煦卉，王洪海，张雪莲. 异柠檬酸裂解酶——新型抗
结核药物靶标 [J] . 中国感染控制杂志，2008，7（5）：
359-362.
牛雪，吴丛梅，高冷.结核分枝杆菌H37RV异柠檬酸裂解
酶基因的克隆表达及活性 [J] .吉林大学学报，2011（4）：
17-19.
郝方，裴秀英，张雪莲. 结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶
基因的克隆表达及酶学性质研究 [J] . 中华结核和呼吸
杂志，2005（12）：845-848.
王艳秋，张培军 . PCR 引物设计 [ J] . 海洋科学，
1995（5）：9-10.
磨美兰，甘书钻. 动物传染病研究中 PCR引物设计的技
巧及相关软件介绍 [J] . 广西农业生物科学，2008（27）：
72-75.
张新宇，高燕宇. PCR引物设计及软件使用技巧 [J] . 生
物信息学，2004（4）：15-18.
朱新产，张涌，廖祥儒. PCR技术战略 [J] . 生物技术通
报，1988（3）：29-33. ◇
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇
◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇◇
22· ·