全 文 ：2014年第9期
摘要：为了探明褐环黏盖牛肝菌的草酸代谢途径，研究了pH值、反应温度对褐环黏盖牛肝菌异柠檬酸裂解酶（ICL） 和苹
果酸合酶（MS） 的活性的影响。结果表明，酶促反应褐环黏盖牛肝菌ICL最适pH值为5.6，其最大活性为4.37U/gFW；
MS的最适pH值为7.0，其最大活性为3.57 U/g FW；ICL最适反应温度为 30℃，MS 最适反应温度为 35℃；K+，
Na+，Mg2+三种金属离子中，Mg2+对ICL活性具有明显的激活作用，而Na+对MS的活性具有明显的激活作用。
关键词：褐环黏盖牛肝菌；异柠檬酸裂解酶；苹果酸合酶
中图分类号：S646.3 文献标志码：A doi：10.3969/jissn.1671-9646（X）.2014.09.037
ActivityofIsocitrateLyaseandMalicAcidSynthaseofSuillus luteus
LIChun-ling，*CHENYou-jun，LIGuo-guang，ZHAOLei
（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot，Inner Mongolia 010018，China）
Abstract：This paper studies the activity of isocitrate lyase（ICL） and malic acid synthase（MS） ofSuillus luteus under the
conditions of different pH，temperature and metal ions. The results show that: the ICLs optimum reaction pH ofSuillu luteus
is 5.6，the activity is 4.37 U/gFW，MSs optimum reaction pH is 7.0，the activity is 4.37 U/gFW；ICLs optimum reaction
temperature is 30℃，MSs optimum reaction temperaas 35℃；I he K+，Na+and Mg2+three metal ions，Mg2+has an
obvious activation role to ICL，and Na+has an obvious activation role to MS.
Keywords：Suillus luteus；isocitrate lyase；malic acid synthase
收稿日期：2014-06-07
作者简介：李春玲（1987— ），女，在读硕士，研究方向为真菌生理与发酵工艺。
*通讯作者：陈有君（1961— ），男，教授，研究方向为微生物生理与发酵工艺。
0 引言
褐环黏盖牛肝菌是一种能与松科植物共生的外
生菌根真菌，它在改善土壤营养环境，提高宿主生
物系统抗性方面有着重要作用[1-2]。研究表明，该菌
适宜生长在酸性环境条件下，最适生长pH值为4.5
左右[3]。李国光[4]在进一步研究褐环黏盖牛肝菌草酸
代谢机理时发现，该菌分泌的草酸来自于异柠檬酸
裂解途径，且在该菌中检测到了异柠檬酸裂解酶
（ICL） 和苹果酸合酶（MS） 活性。
ICL和MS是乙醛酸循环中2个至关重要的酶，
也是特有的酶。ICL可将异柠檬酸催化生成 1 分子
琥珀酸和1分子乙醛酸，一部分乙醛酸进一步被氧
化成草酸，而另一部分乙醛酸则进入乙醛酸循环，
在 MS 的催化下与乙酰辅酶 A 合成苹果酸。ICL 作
为乙醛酸循环的关键酶之一，不仅存在于油料种子
的萌发期间，而且也出现在真菌菌丝营养生长期
间[5]，在褐环黏盖牛肝菌草酸的生物合成中发挥着
重要的作用。
目前，有关褐环黏盖牛肝菌菌丝生长条件的研
究较多，但对该菌草酸代谢机理的研究相对较少，
特别是有关该菌ICL和MS的研究未见报道。本文研
究了pH值、反应温度和金属离子对褐环黏盖牛肝菌
菌丝ICL和MS活性的影响，目的在于探索该菌ICL
和MS酶促反应的最佳条件，为进一步研究该菌草酸
代谢机理提供酶学基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
褐环黏盖牛肝菌（sp9），内蒙古农业大学菌根实
验室提供。用Pachlewski（简称Pach） 固体培养基复
壮培养后备用。
1.1.2 基础培养基组成（1 000 mL）
以Pach液体培养基为基础培养基，培养基组成
参照刘淑清等人[3]文献中的配方。
褐环黏盖牛肝菌异柠檬酸裂解酶和
苹果酸合酶活性的研究
李春玲，*陈有君，李国光，赵 磊
（内蒙古农业大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）
文章编号：1671-9646（2014） 09b-0023-03
第9期（总第365期） 农产品加工（学刊） No.9
2014年9月 Academic Periodical of Farm Products Processing Sep.
农产品加工（学刊） 2014年第9期
1.2 试验方法
1.2.1 褐环黏盖牛肝菌菌丝的培养
无菌操作下，用直径为6 mm打孔器将生长在对
数期的褐环黏盖牛肝菌打下6块，接入Pach液体培
养基中，三角瓶中培养基的装液量为50 mL/150 mL，
在25℃恒温培养箱中静置培养15 d，备用。
1.2.2 粗酶液的制备
将1.2.1培养好的菌丝滤出，蒸馏水冲洗后用滤
纸吸干，取新鲜菌丝0.5 g，在预冷的研钵中加入少
许石英砂和5 mL的0.01 mol/L，pH值7.2的PBS缓
冲液，冰浴中充分磨匀后转入7 mL离心管中，4℃
下，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。
1.2.3 ICL和MS 活性的测定
ICL活性的测定参照张北壮[6]的方法，MS活性的
测定参照Dixon的方法[7]。以单位时间内吸光度A变
化0.01为1个酶活力单位（U）。
计算公式如下：
1 U= ΔA×Vtm×Vs×0.01×t
.
式中：ΔA——一定波长入射光下，反应时间内吸光
度的变化；
m——所称样品鲜质量，g；
t——反应时间，h；
Vt——提取酶液总体积，mL
Vs——测定时取用酶液总体积，mL。
1.2.4 pH 值对 ICL和MS 活性的影响
在 pH 值 3.0~8.0 内分别测定 ICL 和 MS 活性，
反应温度为30℃，用柠檬酸-磷酸氢二钾缓冲液来
调pH值，绘制ICL和MS的pH值曲线图。每个处
理重复3次。
1.2.5 温度对 ICL和MS 活性的影响
在温度为20，25，30，35，40℃，pH值7.0的
0.01 mol/L的PBS缓冲液条件下分别测定ICL和MS
活性，绘制ICL和MS的温度曲线图。每个处理重复
3次。
1.2.6 金属离子对 ICL和MS 活性的影响
在酶液中分别加入 10 mmol/L 的 KCl，MgCl，
NaCl，保温10 min后加入底物，30℃下水浴锅中反
应30 min，用20%的三氯乙酸终止酶促反应，分别
测定ICL和MS活性。每个处理重复3次。
2 结果与分析
2.1 pH值对ICL和MS活性的影响
pH对褐环黏盖牛肝菌ICL的影响见图1。
由图1可知，该菌ICL活性与pH值关系曲线呈
钟形，在pH值3.5~5.0时，随着酶促反应体系pH值
的升高，ICL活性随pH值增加缓慢的增大；当反应
体系pH值由5.0变为5.6时，酶活性大幅度增加；在
pH值5.5~6.0，其活性达到最大值4.37 U/g FW。随
着反应体系pH值进一步升高，ICL的活性迅速下降，
在缓冲液pH值7.0时，ICL活性下降到1.93 U/gFW，
与最大酶活相比，下降了3.04 U/g FW，在反应体系
pH值由7.0变至8.0时，ICL活性却下降很小。由此
表明褐环黏盖牛肝菌ICL酶活性的催化最适pH值为
5.6~6.0，反应 pH 值过高或过低都会影响其催化
效率。
褐环黏盖牛肝菌MS pH值曲线见图2。
由图2可知，该菌 MS 的催化最适 pH值为 7.0
左右，其最大活性为3.57 U/g FW。在pH值3.6~8.0
内，MS的活性随反应体系pH值的变化缓慢升高或
降低，并不像ICL那样骤升或骤降，这说明褐环黏
盖牛肝菌MS活性对pH值的耐受区间比较宽。
2.2 反应温度对ICL和MS活性的影响
褐环黏盖牛肝菌 ICL 活性随反应温度变化见
图3。
由图3可知，随着反应温度的升高，ICL活性迅
速大幅度的增大，在反应温度为30℃时，其活性达
到最大值 3.8 U/g FW；随着反应温度的继续升高，
ICL的活性开始缓慢下降，由此表明褐环黏盖牛肝菌
ICL酶活性的催化最适温度为30℃左右。
褐环黏盖牛肝菌 MS 活性随反应温度变化见
图4。
由图4可知，MS活性随着反应温度的升高也在
不断增大，与ICL不同的是MS的活性随温度升高缓
慢增大、迅速降低，且MS在温度35℃时达到最大
酶活3.9 U/g FW。由此可知褐环黏盖牛肝菌MS酶活
图1 褐环黏盖牛肝菌ICL pH值曲线
图2 褐环黏盖牛肝菌MS pH值曲线
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
IC
L
活
性
/U
·
g-
1
FW
pH值
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
M
S
活
性
/U
·
g-
1
FW
pH值
24· ·
2014年第9期
图3 褐环黏盖牛肝菌ICL反应温度曲线
图4 褐环黏盖牛肝菌MS反应温度曲线
性的催化最适反应温度为35℃左右。
2.3 金属离子对ICL和MS活性的影响
不同金属离子对ICL活性的影响见图5，不同金
属离子对MS活性的影响见图6。
由图5可知，褐环黏盖牛肝菌ICL反应体系中
加入K+，Na+，Mg2+，ICL表现出不同的活性，其中
Mg2+较其他2种离子对ICL活性有明显的促进作用，
其酶活量可达2.27 U/g FW，其次是Na+，最后是K+，
酶活只有 0.67 U/g FW。由此可知，一定浓度的金
属Mg2+可作为褐环黏盖牛肝菌ICL酶促反应的激活
剂。而在对该菌的 MS 进行同样的研究发现，在反
应体系中加入 K+，Na+，Mg2+后，相比之下 Na+对
MS的活性具有明显的促进作用，最高时可达2.8 U/g
FW，其次才是Mg2+，最后是K+，酶活只有1.47 U/g
FW。可知，对褐环黏盖牛肝菌MS反应体系中酶促
反应影响较大的是Na+。
3 结论与讨论
褐环黏盖牛肝菌 ICL 活性的最适催化 pH 值为
5.6，最适反应温度为 30℃；MS 活性的催化最适
pH 值为 7.0，最适反应温度为 35℃。一定量的金
属离子可以影响酶的活性，不同金属离子对酶的结
构和功能所起的作用不同。在褐环黏盖牛肝菌中，
Mg2+较 Na+和K+而言，对ICL活性有明显的激活作
用，而Na+对MS活性却具有明显的激活作用。
大量的研究已经证明，褐环黏盖牛肝菌适宜生
活在偏酸性环境中，在pH值3.0~7.0下菌丝生长过
程中均能够分泌大量的草酸，且在pH值6.5有最大
分泌量。褐环黏盖牛肝菌分泌的草酸来自于异柠檬
酸裂解途径，ICL是此途径的关键酶，但是从草酸的
量上和该酶的最适催化pH值考察，二者似乎没有必
然的相关性。原因可能是异柠檬酸在ICL的催化下
生成了乙醛酸，而只有一部分乙醛酸被氧化生成草
酸，而另一部分乙醛酸在 MS 的催化下生成了苹果
酸。也有可能在褐环黏盖牛肝菌中存在着草酸的分
解代谢，将部分草酸转化成别的物质，还有可能就
是褐环黏盖牛肝菌的草酸不仅仅来自于异柠檬酸裂
解途径，还有可能来自于别的代谢途径。为了彻底
明确褐环黏盖牛肝菌草酸代谢机理，这些猜想有待
于深入研究。
参考文献：
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Dixon G H，Kornberg H L. Assay method for key enzymes
of glyoxylate cycle [J] . Biochem J，1959，72：3. ◇
15 20 25 30 35 40
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
IC
L
活
性
/U
·
g
FW
-1
反应温度 θ/℃
20 25 30 35 40
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
M
S
活
性
/U
·
g
FW
-1
反应温度 θ/℃
离子
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
IC
L
活
性
/U
·
g-
1
FW
K+ Na+ Mg2+
离子
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
M
S
活
性
/U
·
g-
1
FW
K+ Na+ Mg2+
图5 不同金属离子对ICL活性的影响
图6 不同金属离子对MS活性的影响
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李春玲，等：褐环黏盖牛肝菌异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶活性的研究 25· ·