全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０４􀆰 ００６
收稿日期：２０１３－０４－０６
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１３ＣＢ７３３６００）；中组部青年拔尖人才支持计划；江苏省杰出青年金（ＢＫ２０１２００２）
作者简介：王菲菲 （ １９８８—），女，山东德州人，硕士研究生，研究方向：食品微生物制造工程；刘立明 （联系人），教授， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｍｉｎｇｌｌ ＠
ｊｉａｎｇｎａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
系统代谢工程改造树干毕赤酵母生产琥珀酸
王菲菲，刘　 婷，刘立明
（江南大学 食品科学与技术国家重点实验室 工业生物技术教育部重点实验室
食品微生物制造工程研究室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：为提高树干毕赤酵母发酵生产琥珀酸的产量，借助基因组规模代谢网络模型 ｉＴＬ８８５ 获得琥珀酸合成的最
佳代谢途径为扩增 ｉｃｌ１基因和敲除 ｓｄｈ１基因。 在此基础上，借助代谢工程策略构建过量表达异柠檬酸裂解酶基因
ｉｃｌ１的重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ、缺失琥珀酸脱氢酶基因 ｓｄｈ１的重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ和缺失 ｓｄｈ１基因同时过量表达 ｉｃｌ１基因
的重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ。 结果表明：３株重组菌的异柠檬酸裂解酶活性由 ０􀆰 ３３ Ｕ ／ ｍｇ分别增加为 １􀆰 ６、５􀆰 ６和 ６􀆰 ６
Ｕ ／ ｍｇ；而琥珀酸脱氢酶活性则从 １３􀆰 ８ Ｕ ／ ｍｇ分别降为 １０􀆰 ７、０􀆰 ３和 ０􀆰 ３ Ｕ ／ ｍｇ。 在以木糖为 Ｃ源的培养基中，３株重
组菌生产琥珀酸的能力分别是 ０􀆰 ３０、１􀆰 ２０和 １􀆰 ６０ ｇ ／ Ｌ。
关键词：异柠檬酸裂解酶；树干毕赤酵母；琥珀酸；琥珀酸脱氢酶；系统代谢工程
中图分类号：Ｑ７８９　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－００２４－０８
Ｓｙｓｔｅｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＷＡＮＧ Ｆｅｉｆｅｉ，ＬＩＵ Ｔｉｎｇ，ＬＩＵ Ｌｉｍｉｎｇ
（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ⁃Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ｘｙｌｏｓｅ ａｓ ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，ａｎ
ｏｐｔｉｍｕｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｅｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｉｄｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ⁃
ｓｃａｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍｏｄｅｌ ｉＴＬ８８５􀆰 Ｉｎ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐａｔｈｗａｙ，ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｃｌ１ ｗａｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｕｔ
ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｓｄｈ１ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｌｅｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅｎ， ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔａｉｎｓ ＦＰＬｉｃｌ ｏｖｅｒ⁃
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｃｌ１，ＦＰＬΔｓｄｈ ｄｅｌｅｔｉｎｇ ｓｄｈ１ ａｎｄ ＦＰＬΔｓｄｈ⁃ｉｃｌ ｗｉｔｈ ｓｄｈ１⁃ｄｅｌｅｔｅｄ ａｎｄ ｉｃｌ１ ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｅｒｅ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ＩＣＬ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ａｔ １􀆰 ６， ５􀆰 ６ ａｎｄ ６􀆰 ６ Ｕ ／ ｍｇ， ｔｈｅ ＳＤＨ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏ １０􀆰 ７，０􀆰 ３ ａｎｄ ０􀆰 ３ Ｕ ／ ｍｇ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ，０􀆰 ３０，１􀆰 ２０ ａｎｄ １􀆰 ６０
ｇ ／ Ｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ ｘｙｌｏｓｅ ａｓ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ； Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ； ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ； ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； ｓｙｓｔｅｍ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
　 　 琥珀酸作为一种重要的化工原料，广泛应用于
食品、制药、农业和化工等领域。 同时，还可转化为
其他大宗化学品，具有巨大的潜在市场空间［１］。 现
在，传统的琥珀酸生产存在工艺原料短缺、耗资大
和环境污染严重等问题，限制了其进一步发展。 近
年来，发酵法生产琥珀酸则逐渐成为国内外研究热
点，主要集中在产琥珀酸放线杆菌［２］、产琥珀酸曼
氏杆菌［３－４］、产琥珀酸厌氧螺菌［５］和重组大肠杆
菌［６－７］等。 然而，由于这些微生物存在发酵、纯化工
艺复杂等原因，限制了其在工业化生产中的应
用［８－１０］。 树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）是能利用木
糖的优势菌株，而木糖广泛存在于林业及农业废弃
物中，因此，研究代谢改造树干毕赤酵母生产琥珀
酸对生物质资源的利用具有重要意义。 此外，
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ具有耐受低 ｐＨ、高糖等优点［１１］，能极大地
简化下游工序、降低生产成本，是发酵生产琥珀酸
的潜在优势菌株。
本研究中笔者借助树干毕赤酵母全基因组代
谢网络模型 ｉＴＬ８８５［１２］，设计琥珀酸最佳合成途径，
进而利用代谢工程策略对树干毕赤酵母进行代谢
改造，以期提高琥珀酸产量。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种和质粒
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＦＰＬ ＵＣ７［１３］，由美国威斯康辛大学
Ｊｅｆｆｒｉｅｓ 教授惠赠； Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，质粒 ｐＹ２６ＴＥＦ
ＧＰＤ［１４］、ｐＵＧ７２由笔者所在食品微生物制造工程实
验室保存。
１􀆰 ２　 主要试剂和仪器
ＰＣＲ 仪 （ Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司），高效液相色谱仪
（ＤＩＯＮＥＸ ＵＩｔｉｍａｔｅ ３０００），５ Ｌ 发酵罐（上海宝兴生
物设备工程有限公司）。
所用内切酶、ＰＣＲ 酶及胶回收试剂盒，大连宝
生物公司（ＴａＫａＲａ）；酵母基因组提取试剂盒和质粒
提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；琥珀酸
脱氢酶试剂盒，南京建成科技有限公司；胰蛋白胨
和酵母粉，英国 ＯＸＯＩＤ公司；其他生化试剂，上海生
工生物工程有限公司；测序工作由上海华大基因有
限公司完成。
１􀆰 ３　 代谢网络模型模拟与分析
模型 ｉＴＬ８８５［１４］是笔者所在实验室成员根据
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ６０５４基因组序列构建的，包含 ８８５ 个
基因、８７０个代谢物和 １ ２４０个代谢反应。
采取 ｉＴＬ８８５ 模拟分析高产琥珀酸代谢工程策
略，利用 ＣＯＢＲＡ Ｔｏｏｌｂｏｘ将模型 ｉＴＬ８８５ Ｅｘｃｅｌ文件读
入 Ｍａｔｌａｂ中转化为系数矩阵，并以流量平衡分析方
法（ＦＢＡ） ［１５］进行模拟分析，约束条件下求解目标方
程，获得代谢反应流量分布。 模拟的约束条件来源于
实验数据，模拟基因过量表达时，将基因对应的生化
反应代谢流量设置为原流量的 ５ 倍，模拟基因敲除
时，将基因控制的生化反应的代谢流量设为 ０。
１􀆰 ４　 重组菌株的构建方法
１􀆰 ４􀆰 １　 重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ的构建
参照 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ６０５４ ｉｃｌ１ 基因序列，设计带
有 ＢａｍＨ Ｉ和 ＥｃｏＲ Ｉ酶切位点的引物 ＩＣＬ Ｆ ／ ＩＣＬ
Ｒ（表 １），以 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＦＰＬ ＵＣ７ 基因组为模板，利
用 ＰＣＲ获得目的基因片段。 将纯化后的 ｉｃｌ１ 基因
片段和载体质粒 ｐＹ２６ＴＥＦ ＧＰＤ 进行 ＢａｍＨ Ｉ 和
ＥｃｏＲ Ｉ双酶切，柱式纯化回收，１６ ℃连接过夜，将连
接产物转化到 ＪＭ１０９ 感受态细胞中后，涂布带有氨
苄青霉素的 ＬＢ平板，挑取转化子接种到 ＬＢ 液体培
养基（含氨苄）摇瓶中培养，提取质粒酶切验证，测
序验证，从而获得表达质粒 ｐＹ２６ ｉｃｌ１。
采用电转化法将构建的重组质粒转化到 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
ＦＰＬ ＵＣ７感受态中，电转条件：电压 １􀆰 ５ ｋＶ，电容 ２５
μＦ，电阻 ２００ Ω，电击 ４ ｍｓ。 经过 ＳＣ培养基筛选及质
粒提取酶切验证，得到重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ１。
１􀆰 ４􀆰 ２　 重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ的构建
采用同源重组的方法敲除出发菌株 ＦＰＬ ＵＣ７
的琥珀酸脱氢酶基因（ ｓｄｈ１），由于 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 的同源
重组率比较低，因此要扩增相对较大的同源臂与尿
嘧啶标记基因融合，构成敲除组件。 具体步骤如
下：参照 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ６０５４基因组序列，分别设计扩
增琥珀酸脱氢酶基因（ ｓｄｈ１）的上下游 ８００ ｂｐ ＤＮＡ
片段的引物，引物分别为 ｕｐｐｅｒ Ｆ ／ ｕｐｐｅｒ Ｒ、
ｌｏｗｅｒ Ｆ ／ ｌｏｗｅｒ Ｒ，参照质粒 ｐＵＧ７２ 序列设计扩增
尿嘧啶基因片段的引物，引物为 ｕｒａ Ｆ ／ ｕｒａ Ｒ，分
别 ＰＣＲ得到 ３ 个目的片段，质量分数为 １％的琼脂
糖凝胶电泳回收，以融合 ＰＣＲ方法将 ３ 个片段融合
连接起来，构成敲除组件，琼脂糖凝胶回收并测序。
将敲除片段电转化 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＦＰＬ ＵＣ７ 感受
态，经过筛选获得转化子，再分别用两对验证引物
Ｙ Ｆ１ ／ Ｙ Ｒ１和 Ｙ Ｆ２ ／ Ｙ Ｒ２进行验证，从而获得
正确的重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ。
１􀆰 ４􀆰 ３　 重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ的构建
同样采取同源重组的方法使重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ
重新获得尿嘧啶标记。 设计具有同源臂的引物
ｕｐｐｅｒ Ｆ ／ ｕｐｐｅｒ Ａ和 ｌｏｗｅｒ Ｓ ／ ｌｏｗｅｒ Ｒ，分别扩增
ｓｄｈ１的上下游序列 ８００ ｂｐ，得到的目的片段凝胶回
收，融合 ＰＣＲ法进行拼接，构成尿嘧啶标记敲除组
件，琼脂糖凝胶回收并测序。 将构建好的敲除片段
电转化到 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＦＰＬΔｓｄｈ 感受态中，转化液经后
５２　 第 ４期 王菲菲等：系统代谢工程改造树干毕赤酵母生产琥珀酸
培养后，涂布 ５ 氟乳清酸（５ ＦＯＡ）筛选平板，３０ ℃
培养，挑取其中较大的转化子传代培养，筛选得到的
转化子摇瓶培养提取基因组，进行 ＰＣＲ验证，最后得
到恢复尿嘧啶缺失标记的重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈΔｕｒａ。
接下 来 将 重 组 质 粒 ｐＹ２６ ｉｃｌ１ 电 转 化 到
ＦＰＬΔｓｄｈΔｕｒａ感受态中，用 ＳＣ 筛选培养基传代培
养，提取质粒验证，最终得到 ｓｄｈ１ 基因缺失同时过
量表达 ｉｃｌ１基因的重组菌株 ＰＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ。
１􀆰 ４􀆰 ４　 对照菌 ＦＰＬｐｙ２６的构建
将空质粒 ｐＹ２６ＴＥＦ ＧＰＤ 转化到 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
ＦＰＬ ＵＣ７感受态中，平板筛选转化子并进行传代
培养，得到表达 ｕｒａ３基因能在基本培养基上生长的
对照菌 ＦＰＬｐｙ２６。
本实验所使用的引物见表 １。
表 １　 本实验所用到的引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
引物 序列（５′→３′）
ＩＣＬ Ｆ ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＡＣＡＣＴＧ
ＩＣＬ Ｒ ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＣＴＡＴＣＴＡＧＣＴＴＡＧＴ
ｕｐｐｅｒ Ｆ ＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＣ
ｕｐｐｅｒ Ｒ ＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＡＡＡＴＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣ
ｕｒａ Ｆ ＧＣＡＡＡＣＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＡＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＴＧＴＣＧ
ｕｒａ Ｒ ＡＣＣＴＴＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＡＧＴＴＴＣＣＴＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＧＧＧＧＡ
ｌｏｗｅｒ Ｆ ＣＡＴＴＡＡＴＴＡＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＡＡＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＧＧＴ
ｌｏｗｅｒ Ｒ ＧＣＴＡＧＣＴＡＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＣＴＣＴＴ
ｕｐｐｅｒ Ｒ ＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＡＡＡＴＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣ
Ｙ Ｆ１ ＴＧＡＣＴＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧ
Ｙ Ｒ１ ＧＡＣＡＣＴＣＡＧＴＡＣＧＡＡＡＧＣＧＴＣＡ
Ｙ Ｆ２ ＡＡＡＡＣＧＡＣＴＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣ
Ｙ Ｒ２ ＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＴＡＧＴＡＧＧＧＡＧＡ
ｕｐｐｅｒ Ａ ＡＡＣＣＴＴＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣ
ｌｏｗｅｒ Ｓ ＧＣＡＡＡＣＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＧＧＴ
１􀆰 ５　 培养条件
１􀆰 ５􀆰 １　 培养基
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ培养与保存培养基为 ＬＢ 培养基（ｇ ／ Ｌ）：
酵母膏 ５、蛋白胨 １０、ＮａＣｌ １０。 加入 ５０ ｍｇ ／ Ｌ 氨苄
青霉素的 ＬＢ用于筛选转化子。
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ转化子的筛选（ＳＣ）培养基（ ｇ ／ Ｌ）：木
糖 ２０、ＹＮＢ （不含 （ＮＨ４） ２ＳＯ４） １􀆰 ７、（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ５。
５ ＦＯＡ 筛选培养基：ＳＣ 培养基加入 ５０ ｍｇ ／ Ｌ
尿嘧啶和 １ ｇ ／ Ｌ ５ 氟乳清酸；５ ＦＯＡ 用二甲基亚
砜溶解，过滤除菌。
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 种子培养基（ＹＰＸ） （ ｇ ／ Ｌ）： 酵母粉
１０、胰蛋白胨 ２０、木糖 ２０。
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 发酵培养基 （ ＹＮＢＸ） （ ｇ ／ Ｌ）： ＹＮＢ
１􀆰 ７、尿素 ２􀆰 ２７、木糖 ５０。
１􀆰 ５􀆰 ２　 培养方法　
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ 培养方法：挑取平板活化的单菌落接种
到装有 ２５ ｍＬ ＬＢ 培养基的 ２５０ ｍＬ 摇瓶中，３７ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养，培养携带质粒的菌种时，培养基中
要加氨苄青霉素。
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ发酵培养方法：挑取平板活化的单菌
落到种子培养基，于 ３０℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇瓶培养 ２４
ｈ，以体积分数 ５％接种量接种到 ５ Ｌ 发酵罐发酵培
养，温度为 ３０℃，ｐＨ为 ６􀆰 ５，转速为 ４００ ｒ ／ ｍｉｎ，通气
量为 １􀆰 ０ ｖｖｍ（ｖｖｍ表示每分钟通气量与罐体实际料
液体积的比值）。
６２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
１􀆰 ６　 分析方法
１􀆰 ６􀆰 １　 酶活的测定方法
粗酶液制备：取对数生长中期 ３ ｍＬ发酵液于离
心管中，８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、５ ｍｉｎ 离心，去除上清液，菌体
用 ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ ７􀆰 ４）重悬洗涤并离心 ２ 次，去除
上清，菌体加入 ２ ｍＬ 缓冲液，超声破碎 ２０ ｍｉｎ，
４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ８ ｍｉｎ，上清即粗酶液。 总蛋白浓
度测定参照考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白（ＢＳＡ）做
蛋白浓度标准曲线。
异柠檬酸裂解酶酶活测定参照文献［１６］。 酶
活定义：１ ｍｉｎ 内氧化 １ μｍｏｌ ＮＡＤＨ 所需的酶量定
义为 １ Ｕ。 比酶活定义为每毫克蛋白含有的酶活
（Ｕ ／ ｍｇ）。
琥珀酸脱氢酶酶活测定参照琥珀酸脱氢酶试
剂盒测定，测定粗酶液于 ６００ ｎｍ 吸光度的变化值。
酶活定义：每毫克蛋白每分钟使反应体系的吸光度
降低 ０􀆰 １为 １个比酶活单位。
１􀆰 ６􀆰 ２　 发酵及代谢物分析
细胞生长用分光光度计于 ６００ ｎｍ 处测定吸光
值，细胞干质量 （ ＤＣＷ）换算公式为： ρ （ ＤＣＷ） ＝
ＯＤ６００×０􀆰 ２１。 发酵液中相关代谢物质的浓度用液相
检测。 检测条件：色谱柱为 Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ
（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司），流动相 ０􀆰 ００５ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ ＳＯ４，流速
０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ３５ ℃，检测器紫外检测器、示差折
光检测器，紫外检测波长 ２１０ ｎｍ。 琥珀酸检测用紫
外检测器，乙酸、木糖检测用示差折光检测器。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 基于 ＧＳＭＭ模型 ｉＴＬ８８５的琥珀酸最佳合成
途径的设计
　 　 将对照菌 ＦＰＬｐｙ２６ 于恒化培养器中进行培养，
测定培养过程中细胞浓度及木糖浓度随发酵时间
变化规律。 最大比生长速率（０􀆰 １０ ｈ－１）时，木糖比
消耗速率为 ２􀆰 ２３ ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ）。 将木糖消耗速率和
琥珀酸合成速率作为模型约束条件，以生物量方程
为目标方程，通过 ＦＢＡ 计算获得模型 ｉＴＬ８８５ 中不
同琥珀酸合成途径中代谢流量的分布，如图 １（ａ）所
示，琥珀酸比合成速率为 ８􀆰 ９ × １０－３ ｍｍｏｌ ／ （ ｇ·ｈ）。
进一步借助 ＦＢＡ 模拟关键节点处代谢改造对碳代
谢流分布及琥珀酸合成的影响，结果发现：①过量
表达异柠檬酸裂解酶基因 ｉｃｌ１增加乙醛酸（ＴＣＡ）循
环代谢流量，琥珀酸合成速率从 ８􀆰 ９×１０－３ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ）
增大到 ０􀆰 ０２ ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ） （图 １（ｂ））；②敲除 ｓｄｈ１
基因能阻断三羧酸循环中琥珀酸的进一步代谢，增
大三羧酸循环 乙醛酸循环流量，琥珀酸合成速增加
到 ０􀆰 １５ ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ）（图 １（ｃ））；③在过量表达 ｉｃｌ１
基因的同时敲除 ｓｄｈ１基因，可使琥珀酸合成速率提
高到 ０􀆰 １９ ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ）（图 １（ｄ））。
２􀆰 ２　 构建高效合成琥珀酸的树干毕赤酵母重组菌株
根据 ２􀆰 １模拟结果，提高树干毕赤酵母生产琥
珀酸产量的代谢工程策略包括：①过量表达异柠檬
酸裂解酶基因；②敲除琥珀酸脱氢酶基因；③同时
过量表达异柠檬酸裂解酶基因和敲除琥珀酸脱氢
酶基因。 本研究借助代谢工程策略构建了树干毕
赤酵母重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ、ＦＰＬΔｓｄｈ和 ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ。
２􀆰 ２􀆰 １　 构建过量表达 ｉｃｌ１的重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ
以 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＦＰＬ ＵＣ７ 基因组为模板，按照方
法 １􀆰 ４􀆰 １进行 ＰＣＲ，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，
ＰＣＲ和酶切电泳结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知：扩
增产物大小约 １ ７００ ｂｐ，经测序鉴定为 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｉｃｌ１
基因，无点突变。 将扩增片段和载体 ｐＹ２６ＴＥＦ
ＧＰＤ进行 ＢａｍＨ Ｉ和 ＥｃｏＲ Ｉ双酶切，经纯化后连接、
转化。 提取转化子质粒进行酶切验证，得到约 ７ ４３０
和１ ７００ ｂｐ大小的片段，分别为载体和基因片段，结
果表明表达载体 ｐＹ２６ ｉｃｌ１构建成功。 将重组质粒
ｐＹ２６ ｉｃｌ１转化到 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓＦＰＬ ＵＣ７ 中构建，获得
过量表达异柠檬酸裂解酶基因的重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ。
２􀆰 ２􀆰 ２　 构建缺失 ｓｄｈ１基因的重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ
按照方法 １􀆰 ４􀆰 ２ 敲除菌株 ＦＰＬ ＵＣ７ 的 ｓｄｈ１
基因，敲除步骤如图 ３（ａ）所示。 以 ＦＰＬ ＵＣ７ 基因
组为模板，分别扩增得到琥珀酸脱氢酶（ ｓｄｈ１）的上
下游 ８００ ｂｐ 的片段（加引物同源臂为 ８２５ ｂｐ），以
ｐＵＧ７２为模板扩增出尿嘧啶基因片段 １ ０５０ ｂｐ（图
３（ｂ）），测序结果与 ＮＣＢＩ 上对应序列 １００％匹配。
凝胶回收 ３段片段，通过融合 ＰＣＲ将 ３ 个片段连接
起来，构成敲除框，大小为 ２ ６００ ｂｐ（图 ３（ｃ））。 将
敲除框 ＤＮＡ 片段转化到 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓＦＰＬ ＵＣ７ 中，通
过引物验证转化子基因敲除的正确性，构建获得重
组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ。
２􀆰 ２􀆰 ３　 构建重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ
首先对重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ 进行分子操作，按照
１􀆰 ４􀆰 ３的方法敲除尿嘧啶基因，构建琥珀酸脱氢酶
和尿嘧啶双重缺陷型重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈΔｕｒａ。 提取
ＦＰＬΔｓｄｈ和转化子基因组，用引物 ｕｐｐｅｒ Ｆ ／ ｌｏｗｅｒ
Ｒ进行 ＰＣＲ 验证，出发菌扩增出 ２ ６００ ｂｐ 的 ＤＮＡ
片段，重组菌株扩增出１ ６００ ｂｐ 的 ＤＮＡ 片段，通过
７２　 第 ４期 王菲菲等：系统代谢工程改造树干毕赤酵母生产琥珀酸
ＸＹＬ［ｅ］—ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｘｙｌｏｓｅ；ＸＹＬ—ｘｙｌｏｓｅ；ＰＹＲ—ｐｙｒｕｖａｔｅ； ＡＣＣＯＡ—ａｃｅｔｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ； ＣＩＴ— ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；
ＩＣＩＴ—ｉｓｏｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ； ＡＫＧ—α⁃ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ； ＳＵＣＣＯＡ—ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ； ＳＵＣＣ—ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ； ＦＵＭ—ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ；
ＭＡＬ—ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ；ＯＡＡ—ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ； ＡＣＡＬ—ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ； ＡＣ—ａｃｅｔａｔｅ； ＧＬＸ—ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ； ＳＵＣＣ［ｅ］—ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
图 １　 树干毕赤酵母合成琥珀酸的最佳代谢途径设计
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
测序证明重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈΔｕｒａ 构建完成，图 ４ 为
尿嘧啶敲除示意图和 ＰＣＲ 验证电泳图。 然后将重
组质粒 ｐＹ２６ ｉｃｌ１ 转化到 ＦＰＬΔｓｄｈΔｕｒａ 感受态中，
用 ＳＣ 筛选培养基传代培养，提取质粒验证，获得重
组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ。
２􀆰 ３　 重组菌株酶活测定
于 ３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下将菌株培养到对数
生长中期，取样测定出发菌株和重组菌株中异柠檬
酸裂解酶和琥珀酸脱氢酶的活性，结果列于表 ２。
由表 ２可知：①重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ 中异柠檬酸裂解酶
活性为（１􀆰 ６±０􀆰 ２０） Ｕ ／ ｍｇ，是出发菌株的 ４􀆰 ８ 倍，而
琥珀酸脱氢酶活性则比出发菌株降低了 ２２％，表明
过量表达 ｉｃｌ１ 基因将减弱琥珀酸到富马酸代谢途
径；②重组菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ 琥珀酸脱氢酶活性较低，
几乎无法检测；而异柠檬酸裂解酶酶活为 （ ５􀆰 ６ ±
０􀆰 １３） Ｕ ／ ｍｇ，是出发菌株的 １７ 倍；③重组菌株
ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ 的异柠檬酸裂解酶酶活为 （ ６􀆰 ６ ±
０􀆰 １７） Ｕ ／ ｍｇ，是出发菌株的 ２０倍。
８２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
Ｍ—ＤＮＡ标准；１—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｉｃｌ１基因；
２—质粒 ｐＹ２６ ｉｃｌ１ 酶切验证
图 ２　 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｉｃｌ１ 基因 ＰＣＲ扩增和质粒
ｐＹ２６ ｉｃｌ１双酶切验证
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｃｌ１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｐＹ２６⁃ｉｃｌ１ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ
ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｍ１—２ ｋｂＤＮＡ标准；Ｍ２—１０ ｋｂ ＤＮＡ标准；
１—ｓｄｈ１基因上游片段（８２５ ｂｐ）；
２—质粒 ＰＵＧ７２ ｕｒａ 基因（１ ０５０ ｂｐ）；
３—ｓｄｈ１基因下游片段（８２５ ｂｐ）；
４—ｓｄｈ１基因敲除框融合 ＰＣＲ（２ ６００ ｂｐ）
图 ３　 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｓｄｈ１基因的敲除
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｄｈ１ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
图 ４　 尿嘧啶敲除示意和敲除验证电泳
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒａ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
表 ２　 重组菌株和出发菌株中关键酶活性的测定
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ
重组菌株 异柠檬酸裂解酶比酶活 ／ （Ｕ·ｍｇ－１）
琥珀酸脱氢酶
比酶活 ／ （Ｕ·ｍｇ－１）
ＦＰＬｐｙ２６ ０􀆰 ３３±０􀆰 ０８ １３􀆰 ８±０􀆰 １６
ＦＰＬｉｃｌ １􀆰 ６±０􀆰 ２０ １０􀆰 ７±０􀆰 １４
ＦＰＬΔｓｄｈ ５􀆰 ６±０􀆰 １３ ０􀆰 ０３±０􀆰 ０１
ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ ６􀆰 ６±０􀆰 １７ ０􀆰 ０３±０􀆰 ０１
２􀆰 ４　 重组菌株发酵生产琥珀酸
将重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ、ＦＰＬΔｓｄｈ、ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ 和
出发菌株 ＦＰＬｐｙ２６ 于 ５ Ｌ 发酵罐中进行培养，进行
３次重复实验，其生产琥珀酸的发酵过程曲线如图 ５
所示，相关发酵参数列于表 ３。 由表 ３ 可知：①与出
发菌株相比，菌株 ＦＰＬｉｃｌ 耗糖速率和菌株生长没有
发生变化，而发酵时琥珀酸质量浓度为 ０􀆰 ３０ ｇ ／ Ｌ，提
高了 ６ 倍。 副产物乙酸质量浓度则从 ５􀆰 ３０ ｇ ／ Ｌ（对
照菌株）降为 ２􀆰 ５０ ｇ ／ Ｌ，降低了 ５３％。 其原因在于
ｉｃｌ１基因的过量表达，导致乙醛酸代谢流量增大，丙
９２　 第 ４期 王菲菲等：系统代谢工程改造树干毕赤酵母生产琥珀酸
　 　 　 　
图 ５　 对照菌和重组菌发酵结果比较
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｘｙｌｏｓｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ，
ｂｉｏｍａｓｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ａｎｄ ａｃｅｔａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｔｒａｃｔ ｓｔｒａｉｎ
ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
酮酸代谢支路流量减少；②菌株 ＦＰＬΔｓｄｈ 细胞生长
并不受 ｓｄｈ１ 基因删除所影响，但与出发菌株相比，
琥珀酸质量浓度达到 １􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，糖耗速率降低 ２６％，
而副 产 物 乙 酸 质 量 浓 度 则 增 加 了 １０５％
（１０􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ）。 其原因在于 ｓｄｈ１ 基因缺失后 ＴＣＡ 循
环受阻，菌株糖代谢能力降低，与此同时，异柠檬酸
裂解酶比酶活增大（表 ２），导致乙醛酸循环代谢流
量增大，乙酸合成途径也成为重要的产能途径［１７］；
③在缺失 ｓｄｈ１ 基因的同时过量表达 ｉｃｌ１ 基因使琥
珀酸产量达到 １􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ，比菌株 ＦＰＬｉｃｌ、ＦＰＬΔｓｄｈ 分
别提高了 ４３３％和 ２５％；而副产物乙酸则比菌株
ＦＰＬΔｓｄｈ减少 ３０％。 胞内乙醛酸流量继续增大，而
乙酸代谢途径流量相对减少，从而使琥珀酸产量进
一步提高，乙酸浓度降低。
３　 结　 论
借助树干毕赤酵母全基因组代谢网络模型
ｉＴＬ８８５对琥珀酸最佳合成途径进行设计，发现过量
表达 ｉｃｌ１基因和敲除 ｓｄｈ１ 基因能有效地提高琥珀
酸的产量。 在此基础上，借助代谢工程策略，构建
了重组菌株 ＦＰＬｉｃｌ（过量表达 ｉｃｌ１ 基因）、 ＦＰＬΔｓｄｈ
（敲除 ｓｄｈ１基因）、ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ（过量表达 ｉｃｌ１基因
和敲除 ｓｄｈ１基因）。 重组菌株异柠檬酸裂解酶和琥
珀酸脱氢酶比酶活分别为 １􀆰 ６、５􀆰 ６、６􀆰 ６ Ｕ ／ ｍｇ 和
１０􀆰 ７、０􀆰 ３、０􀆰 ３ Ｕ ／ ｍｇ，而琥珀酸产量为 ０􀆰 ３０、１􀆰 ２０和
１􀆰 ６０ ｇ ／ Ｌ，实现了琥珀酸的初步积累。 目前国内外
还没有代谢改造树干毕赤酵母生产琥珀酸的相关
报道，本文中笔者结合 ＧＳＭＭ 对树干毕赤酵母进行
代谢改造，为以木糖为底物发酵生产琥珀酸奠定了
坚实基础。
表 ３　 重组菌株和对照菌株发酵参数的比较
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株 木糖消耗速率 ／（ｇ·Ｌ－１·ｈ－１）
ρ（ＤＣＷ） ａ ／
（ ｇ·Ｌ－１）
ρ（琥珀酸） ／
（ ｇ·Ｌ－１）
琥珀酸产率 ／
（ｍｇ·ｇ－１）
ρ（乙酸） ／
（ ｇ·Ｌ－１）
乙酸产率 ／
（ｇ·ｇ－１）
ＦＰＬｐｙ２６ ０􀆰 ４２±０􀆰 ０１ ５􀆰 ９４±０􀆰 １７ ０􀆰 ０５±０􀆰 ０１ １􀆰 ６０±０􀆰 ２０ ５􀆰 ３０±０􀆰 ２０ ０􀆰 １９±０􀆰 ０１
ＦＰＬｉｃｌ ０􀆰 ４６±０􀆰 ０４ ６􀆰 ３１±０􀆰 １６ ０􀆰 ３０±０􀆰 ０１ ８􀆰 ７４±０􀆰 ２７ ２􀆰 ５０±０􀆰 １５ ０􀆰 １０±０􀆰 ０１
ＦＰＬΔｓｄｈ ０􀆰 ３１±０􀆰 ０３ ６􀆰 ７２±０􀆰 １４ １􀆰 ２０±０􀆰 ０４ ４６􀆰 ７０±１􀆰 ３０ １０􀆰 ９０±０􀆰 ６０ ０􀆰 ３８±０􀆰 ０２
ＦＰＬΔｓｄｈ ｉｃｌ ０􀆰 ３３±０􀆰 ０６ ６􀆰 ５１±０􀆰 １５ １􀆰 ６０±０􀆰 ０６ ５９􀆰 ９２±２􀆰 ０４ ７􀆰 ６０±０􀆰 ７０ ０􀆰 ２８±０􀆰 ０３
　 注：ａ表示 ＯＤ６００的测定是在培养了 ７２ ｈ之后。
参考文献：
［ １ ］　 Ｃｈｅｎｇ Ｋ Ｋ，Ｚｈａｏ Ｘ Ｂ，Ｚｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｆｕｅｌ
Ｂｉｏｐｒｏｄ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ，２０１２，６（３）：３０２⁃３１８．
０３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
［ ２ ］　 Ｇｕｅｔｔｌｅｒ Ｍ Ｖ，Ｒｕｍｌｅｒ Ｄ，Ｊａｉｎ Ｍ Ｋ． Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ
ｓｐ． ｎｏｖ．， ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｃｃｉｎｉｃ⁃ａｃｉｄ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ
ｒｕｍｅｎ［Ｊ］ ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９９，４９（１）：２０７⁃２１６．
［ ３ ］ 　 Ｌｅｅ Ｐ Ｃ，Ｌｅｅ Ｓ Ｙ，Ｈｏｎｇ Ｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ａ ｎｅｗ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ
ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ， ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｍｅｎ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，５８（５）：６６３⁃６６８．
［ ４ ］ 　 Ｏｈ Ｉ Ｊ，Ｌｅｅ Ｈ Ｗ，Ｐａｒｋ Ｃ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｕｓｉｎｇ Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ
ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫ７ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００８， １８
（５）：９０８⁃９１２．
［ ５ ］ 　 Ｌｅｅ Ｐ Ｃ， Ｌｅｅ Ｓ Ｙ， Ｃｈａｎｇ Ｈ Ｎ． Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＡＴＣＣ ２９３０５ ｇｒｏｗｉｎｇ ｏｎ
ｇａｌａｃｔｏｓｅ， ｇａｌａｃｔｏｓｅ ／ ｇｌｕｃｏｓｅ， ａｎｄ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ／ ｌａｃｔｏｓｅ ［ Ｊ ］ ． Ｊ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，１８（１１）：１７９２⁃１７９６．
［ ６ ］ 　 Ｖｅｍｕｒｉ Ｇ Ｎ，Ｅｉｔｅｍａｎ Ｍ Ａ，Ａｌｔｍａｎ Ｅ． Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｄｕａｌ⁃ｐｈａｓｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ
ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｅｒｏｂｉｃ ｔｏ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，２８（６）：３２５⁃３３２．
［ ７ ］ 　 Ｖｅｍｕｒｉ Ｇ Ｎ，Ｅｉｔｅｍａｎ Ｍ Ａ，Ａｌｔｍａｎ Ｅ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｍｏｄｅ ａｎｄ
ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｏｎ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，
２００２，６８（４）：１７１５⁃１７２７．
［ ８ ］ 　 Ｃｈｅｎｇ Ｈ Ｙ， Ｙｕ Ｒ Ｃ， Ｃｈｏｕ Ｃ Ｃ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｉｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｃｉｄ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｃｉｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ［ Ｊ］ ． Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ，２００３，３６ （ １）：
４９⁃５６．
［ ９ ］ 　 Ｈｉｐｐｅ Ｈ，Ｈａｇｅｌｓｔｅｉｎ Ａ，Ｋｒａｍｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｆｏｒｍｉｖｉｂｒｉｏ ｃｉｔｒｉｃｕｓ， Ｐｒｏｐｉｏｎｉｖｉｂｒｉｏ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃｕｓ，
Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｔｈｏｍａｓｉｉ， Ｓｕｃｃｉｎｉｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃａ ａｎｄ
Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｎａｃｅａｅ
ｆａｍ．ｎｏｖ［Ｊ］ ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９９，４９（２）：７７９⁃７８２．
［１０］ 　 Ｔｅｅ Ｗ， Ｋｏｒｍａｎ Ｔ Ｍ， Ｗａｔｅｒｓ Ｍ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｒｅｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ
Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ １６Ｓ
ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９８， ３６ （ ５ ）：
１２０９⁃１２１３．
［１１］ 　 Ｓｌｉｎｉｎｇｅｒ Ｐ Ｊ，Ｂｏｔｈａｓｔ Ｒ Ｊ，Ｌａｄｉｓｃｈ Ｍ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ａｎｄ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｘｙｌｏｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ
［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９０，３５（７）：７２７⁃７３１．
［１２］ 　 Ｌｉｕ Ｔ， Ｚｏｕ Ｗ， Ｌｉｕ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ⁃ｂａｓｅｄ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］ ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，２０１２，５（１）：７２．
［１３］ 　 Ｌｕ Ｐ，Ｄａｖｉｓ Ｂ Ｐ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｂｅｔａ⁃ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ （ ＬＥＵ２ ） ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ
ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ＵＲＡ３ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ａｕｘｏｔｒｏｐｈ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，４９（２）：１４１⁃１４６．
［１４］ 　 Ｌｉ Ａ， Ｌｉｕ Ｚ， Ｌｉ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［ Ｊ］ ．
Ｆｅｍｓ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ，２００８，８（１）：６⁃９．
［１５］ 　 Ｏｒｔｈ Ｊ Ｄ，Ｔｈｉｅｌｅ Ｉ，Ｐａｌｓｓｏｎ Ｂ Ｏ．Ｗｈａｔ ｉｓ ｆｌｕｘ ｂａｌａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ？
［Ｊ］ ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，２８（３）：２４５⁃２４８．
［１６］ 　 Ｗｕ Ｈ，Ｌｉ Ｚ Ｍ，Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｆｌＢ ｌｄｈＡ ｄｏｕｂｌｅ
ｍｕｔａｎｔ ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎａｐｌｅｒｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ ａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ［ Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，７３
（２４）：７８３７⁃７８４３．
［１７］ 　 Ｒａａｂ Ａ Ｍ，Ｇｅｂｈａｒｄｔ Ｇ，Ｂｏｌｏｔｉｎａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ］ ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，２０１０，１２（６）：５１８⁃５２５．
（责任编辑　 管　 珺）
１３　 第 ４期 王菲菲等：系统代谢工程改造树干毕赤酵母生产琥珀酸