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第 38 卷第 7 期
2014 年 7 月
水 产 学 报
JOUＲNAL OF FISHEＲIES OF CHINA
Vol． 38，No． 7
July，2014
文章编号:1000 － 0615(2014)07 － 0920 － 09 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2014． 49008
收稿日期:2013-11-26 修回日期:2014-05-08
资助项目:浙江省自然科学基金(LY13D060007) ;浙江省科技创新团队(2010Ｒ50025-25)
通信作者:孙 雪，E-mail:sunxue@ nbu． edu． cn
盐度和无机碳对蛋白核小球藻生长、
胞外碳酸酐酶活性及其基因表达的影响
王玮蔚1，2， 孙 雪1，2* ， 王冬梅1，2， 沈 佳1，2， 徐年军1，2
(1．宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211;
2．浙江省海洋生物工程重点实验室，浙江 宁波 315211)
摘要:为探讨小球藻中碳酸酐酶对环境调控的响应规律，提高小球藻的生物量及对无机碳
的利用，实验采用生化和荧光定量 PCＲ 方法研究了盐度和 2 种无机碳对蛋白核小球藻生
长、胞外碳酸酐酶(CA)活性及 3 种亚型碳酸酐酶基因(ca)表达的影响。结果发现，培养至
第 9 天时盐度 15 和 30 培养藻生长较快，盐度 45 藻细胞密度降为盐度 15 的 0． 83 倍;CA 活
性随着盐度增加而降低，盐度 45 长时间处理酶活性降低更为明显，3 种亚型 ca 基因表达量
则随盐度升高而增加。2 倍空气 CO2浓度培养藻密度可达空气 CO2浓度的 1． 23 倍，但 CA
活性较低，第 8 天为空气 CO2浓度组的 0． 41 倍，α-ca和 γ-ca基因表达量比空气 CO2浓度组
略有升高。在 0 ～ 10 mmol /L HCO －3 条件下，蛋白核小球藻随 HCO
－
3 含量升高生长加快，
CA 活性在 5 mmol /L HCO －3 最高，而 3 种亚型 ca 基因表达量在 1 mmol /L HCO
－
3 处理组最
高。研究表明，蛋白核小球藻生长比较适合中低盐度、2 倍空气 CO2浓度和高 HCO
－
3 处理，
其 CA 活性可被低盐、空气 CO2浓度和 5 mmol /L HCO
－
3 所诱导，而 ca基因表达在高盐、2 倍
空气 CO2浓度和低 HCO
－
3 条件下较高。
关键词:蛋白核小球藻;盐度;CO2;碳酸酐酶;ca基因
中图分类号:S 917． 3 文献标志码:A
海洋微藻的光合固碳量约占全球总光合固碳
量的 50%，是海洋碳循环系统中的重要组成部
分［1］。海水 pH值大约为 8． 1 ～ 8． 4［2］，其中的无机
碳存在形式以碳酸氢根(HCO －3 )为主，CO2浓度较
低，但很多藻类均能在低 CO2环境中获得较高的光
合作用速率，其主要原因是微藻细胞内存在 CO2浓
缩机制(carbon dioxide concentrating mechanism，
CCM)。CCM 即通过活性无机碳(Ci)摄取系统，
升高胞内 Ci 水平，利用各亚型碳酸酐酶(carbonic
anhydrase，CA)将其转化成 CO2，为光合固碳酶
Ｒubisco 的羧化反应提供足够的 CO2底物。
尽管真核藻类和原核蓝藻的 CCM 组成不
同［3 － 4］，但碳酸酐酶都是两者的重要组成部分。
CA 的基本功能是参与 CO2的水化作用，催化 CO2
与 HCO －3 之间的相互转换，其转换数高达 10
6，是
己知金属酶中催化效率最高的酶之一［5］。藻类
中存在多种类型 CA，根据其一级结构的不同，CA
可被分为 α-CA、β-CA、γ-CA、δ-CA、ε-CA 和 ζ-
CA 等 6 种类型，有研究认为它们来自不同的进
化途径［6 － 7］。CA 活性受多种环境因素调控，其中
CO2水平在调节 CA 活性中发挥着重要作用
［8 － 9］。
HCO －3 是影响藻类 CA 活性的另一种无机碳
［10］，
而盐度变化对 CA 活性也有重要影响［11 － 12］。此
外，N /P、pH 以及 Zn2 +等也是影响藻类 CA 活性
的重要环境因素［13 － 15］。
真核藻类中对碳酸酐酶研究最多的是模式绿
藻———莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
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7 期 王玮蔚，等:盐度和无机碳对蛋白核小球藻生长、胞外碳酸酐酶活性及其基因表达的影响
现已发现莱茵衣藻中存在 12 种 ca 编码基因，包
括 3 条 α-ca、6 条 β-ca 和 3 条 γ-ca 基因［16］。另
外，关于莱茵衣藻 CA 活性的环境因素调控、胞外
CA 定位等也有报道［17 － 18］。
小 球 藻 属 (Chlorella ) 是 绿 藻 门
(Chlorophyta)的一类重要经济微藻，易培养、生
长快、光合效率高，是光合作用研究的好材料。关
于小球藻 CCM 的研究也逐渐增多，如 CA 活性与
环境因素的关系和 CA 酶鉴定等［19 － 22］。本研究
选取蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为实
验材料，研究盐度和 2 种无机碳———CO2 和
HCO －3 对其生长、胞外 CA 活性及其转录水平的
影响，并探讨对小球藻中 CA 的环境调控，以期为
提高小球藻无机碳的利用、固碳效率和生物量等
提供资料。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
蛋白核小球藻 820 海水株，由宁波大学海洋
生物工程重点实验室藻种室提供。培养温度为
25 ℃，光照强度约为 40 μmol /(m2·s) ，光暗周
期为 12L ∶ 12D，使用 f /2 人工海水培养基［23］
培养。
1． 2 实验设计
盐度(15、30 和 45)设置用盐度计和添加
NaCl 来调节。HCO －3 浓度设置通过加入不同
NaHCO3来实现，其终浓度依次为 1、2、5 和
10 mmol /L，以未加 NaHCO3作为对照。CO2浓度
设置利用 CO2光照培养箱来控制，未开启 CO2通
气阀时，箱内 CO2浓度为空气 CO2浓度，显示值为
0． 043%;开启 CO2通气阀来调节培养箱内的 CO2
浓度为 0． 086%，即 2 倍空气 CO2浓度。
1． 3 生长测定
先从固体培养平板中将藻转接到相应盐度或
无机碳浓度的培养基中培养 7 d，再按照 20%的
比例转接到盛有 300 mL 新鲜培养基的 500 mL
锥形瓶中培养。每天固定时间取样，连续 9 d 测
定藻液在 440 nm 波长下的吸光度，再根据公式
Y = 15． 528OD440 － 0． 917 8(Ｒ
2 = 0． 996 0)计算藻
细胞密度。每种处理 3 个重复，结果取其平均值，
绘制生长曲线。
1． 4 胞外碳酸酐酶活性测定
根据 Wilbur-Anderson方法［24］用 pH 电极法
测定碳酸酐酶活性，并稍有改进。4 ℃条件下，
8 000 r /min离心 10 min 收集 10 mL 藻液，弃去
上清，使用 4 ℃预冷的 20 mmol /L 巴比妥缓冲
液(pH 8． 4)2 mL 洗涤藻细胞 1 次，8 000 r /min
离心 10 min后再使用 2 mL 巴比妥缓冲液悬浮
藻细胞。迅速向悬浮藻液中加入 1 mL 0 ℃饱和
CO2的蒸馏水(向 0 ℃蒸馏水中持续充入 CO2气
体约 1 h) ，用 pH计监测反应体系 pH值的变化，
记录 pH值下降 1 个单位所需的时间。根据 CA
活性(U)计算公式:U = 10 ×(T0 /T － 1)来计算
胞外 CA 活性，其中 T0和 T分别为反应体系中未
加藻和加入藻细胞悬浮液时 pH 值下降 1 个单
位所需的时间。从第 3 天到第 8 天，每天固定时
间取样，每种处理 3 个重复，结果取其平均值。
1． 5 荧光定量 PCＲ检测碳酸酐酶基因表达
引物设计 根据该小球藻转录组测序得到
的 ca基因序列(尚未发布) ，利用 Primer Premier
5． 0 软件设计荧光定量 PCＲ 引物(表 1) ，引物合
成与 DNA 测序由上海英潍捷基贸易有限公司完
成。以蛋白核小球藻 18S rDNA 作为内参
基因［25］。
基因定量表达 分别离心收集不同盐度
或无机碳浓度处理 12 h 的藻细胞，用 Trizol 试
剂(Invitrogen)提取其总 ＲNA，利用 Prime Script
ＲT reagent Kit w ith gDNA Eraser(TaKaＲa，大
连)反转录成 cDNA 后用作实时荧光定量 PCＲ
的模板。实时荧光定量 PCＲ(SYBＲ Premix Ex
Taq II，TaKaＲa，大连)扩增程序为 95 ℃预变性
2 min;接着 95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s进
行 40 个循环;用 2 － ΔΔC t法分析 ca 基因的相对表
达量［26］。
表 1 碳酸酐酶基因荧光定量 PCＲ引物
Tab． 1 The primers of carbonic anhydrase genes for
real-time quantitative PCＲ
ca基因
ca gene
CA 亚型
CA subtype
引物序列(5-3)
primer sequence(5-3)
unigene13488 α-CA
CCCCTCAAGCCGCTCCAGTT
GACGCCAAACACCGCCAAGC
unigene11800 β-CA
GTCACCAATGGCAAGTCC
TTCACCGAGATGAGCAAC
unigene8070 γ-CA
GGCGGTGCGGATTGAACAGT
CGGCAACGTGCAGCTAGGGA
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水 产 学 报 38 卷
1． 6 数据处理
数据均采用 Excel 软件作图，用 SPSS 19． 0
软件进行数据差异显著性分析，其中 P ＜ 0． 05 表
示差异显著，P ＜ 0． 01 表示差异极显著。
2 结果
2． 1 盐度对蛋白核小球藻生长、胞外碳酸酐酶活
性及基因表达的影响
盐度 15 ～ 45，蛋白核小球藻 820 均可以生
长。其中，盐度 15 和 30 培养藻生长较快，并且两
者的生长曲线大致重合，而盐度 45 对藻细胞的生
长具有一定的抑制作用。如在第 9 天，盐度 30 和
45 藻细胞密度分别是盐度 15 的 0． 97 倍和 0． 83
倍(图 1)。可见，盐度 15 和 30 更加适合蛋白核
小球藻 820 的生长。
图 1 盐度对蛋白核小球藻 820 生长的影响
Fig． 1 The effect of salinity on the growth of
C． pyrenoidosa 820
盐度是影响藻类 CA 活性的一个重要因素。
从培养的第 3 天到第 8 天，CA 活性随培养时间
的延长先升高后下降(图 2)。在第 5 天，盐度
30 和 45 培养藻 CA 活性最高，分别为 82． 89 U /
109细胞和 22． 13 U /109细胞。而盐度 15 培养藻
在第 6 天 CA 活性最高，为 94． 86 U /109细胞，
并且随着盐度升高 CA 活性逐渐降低。在第 5
天，盐度 30 和 45 藻 CA 活性分别是 15 盐度的
0． 93倍和 0． 24 倍;到第 8 天，盐度 30 和 45 藻
CA 活性分别是盐度 15 藻细胞 CA 活性的 0． 64
倍和 0． 04 倍。可见，随着培养时间的延长，盐
度 45 对蛋白核小球藻 CA 活性的抑制作用越来
越明显。统计学分析结果表明，除第 5 天的盐
度 15 和 30 组之外，其余各组的 CA 活性均差异
显著(P ＜ 0． 05)。
图 2 盐度对蛋白核小球藻 820 碳酸酐酶活性的影响
图中 a、b、c 不同字母表示差异显著(P ＜ 0． 05) ，下图注释
同此
Fig． 2 The effect of salinity on the
CA activity of C． pyrenoidosa 820
Bars with different letters(a，b，c)indicate significant difference
(P ＜ 0． 05)． The same as the following
3 种亚型 ca 基因的表达水平也受盐度影响，
从盐度 15 ～ 45，随着盐度增加大多数 ca 表达量
增加(图 3)。将盐度 15 组 α-ca 基因表达量作为
1，盐度 30 和 45 组的 α-ca 表达量分别是其 1． 60
倍和 1． 90 倍;盐度 30 和 45 组 β-ca 表达量分别
是盐度 15 组 β-ca 表达量的 1． 64 倍和 1． 57 倍;
而盐度 30 和 45 组 γ-ca表达量分别是盐度 15 组
γ-ca 表达量的 2． 07 倍和 2． 16 倍。3 种亚型 ca
的转录表达均受盐度诱导，且盐度对 ca 转录水平
的影响差异显著(P ＜ 0． 05)。
图3 盐度对蛋白核小球藻 820 碳酸酐酶基因表达的影响
Fig． 3 The effect of salinity on the
ca expression of C． pyrenoidosa 820
2． 2 CO2对蛋白核小球藻生长、胞外碳酸酐酶活
性及基因表达的影响
空气中 CO2浓度也是影响藻类生长的重要因
素。蛋白核小球藻 820 在 2 倍空气 CO2浓度条件
下比在空气 CO2浓度条件下生长得更快(图 4)。
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7 期 王玮蔚，等:盐度和无机碳对蛋白核小球藻生长、胞外碳酸酐酶活性及其基因表达的影响
到第 9 天，2 倍空气 CO2培养藻细胞密度是空气
CO2条件下培养的 1． 23 倍，表明在一定范围内，高
CO2水平更有利于蛋白核小球藻的生长。
图 4 CO2对蛋白核小球藻 820 生长的影响
Fig． 4 The effect of CO2on the growth of
C． pyrenoidosa 820
CO2浓度是影响藻类 CA 活性的重要因素，
在空气 CO2培养的蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶活
性随培养时间的延长先升高再降低，在第 4 天藻
细胞的 CA 活性最高(37． 68 U /109细胞) ;而 2 倍
空气 CO2培养的 CA 活性随着培养时间增长变化
不大(图 5)。但是，2 种不同 CO2浓度对蛋白核
小球藻 CA 活性影响差异极显著(P ＜ 0． 01)。从
第 3 天到第 8 天，2 倍空气 CO2培养藻的 CA 活性
为空气 CO2培养的 0． 15 ～ 0． 41 倍，说明胞外 CA
活性可被较高浓度 CO2所抑制。
图 5 CO2对蛋白核小球藻 820 碳酸酐酶活性的影响
不同字母表示差异极显著(P ＜ 0． 01) ，以下注释同此
Fig． 5 The effect of CO2 on the CA activity of
C． pyrenoidosa 820
Bars with different letters indicate very significant difference
(P ＜ 0． 01) ，the same as the following
CO2浓度对碳酸酐酶基因表达水平也有影
响。与 CA 活性变化规律不同，2 倍空气 CO2培养
藻的 3 种亚型 ca 基因的表达量都比空气 CO2高
(图 6)。其中，前者的 α-、β-、γ-ca 表达量分别是
后者的 1． 22 倍、1． 09 倍和 1． 47 倍。除了 β-ca之
外，2 种 CO2浓度对 α-ca和 γ-ca表达量的影响差
异显著(P ＜ 0． 05)。可见，较高浓度 CO2有利于
蛋白核小球藻 α-ca和 γ-ca转录水平的表达。
图6 CO2对蛋白核小球藻 820 碳酸酐酶基因表达的影响
Fig． 6 The effect of different CO2 on the
ca expression of C． pyrenoidosa 820
2． 3 HCO －3 对蛋白核小球藻生长、胞外碳酸酐酶
活性及基因表达的影响
碳酸氢盐是影响藻类生长的重要无机盐，它
的添加可以促进蛋白核小球藻的生长(图 7)。从
第 2 天开始，不同 HCO －3 浓度对藻生长的影响差
异越来越明显。随着 HCO －3 浓度的增加，小球藻
生长逐渐加快。在第 9 天，1、2、5 和 10 mmol /L
HCO －3 组的藻细胞密度分别是对照组的 1． 24 倍、
1． 33 倍、1． 38 倍和 1． 55 倍。结果表明，在 0 ～ 10
mmol /L HCO －3 范围内，HCO
－
3 浓度与藻的生长呈
正相关性。
图 7 HCO －3 对蛋白核小球藻 820 生长的影响
Fig． 7 The effect of HCO －3 on the growth of
C． pyrenoidosa 820
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水 产 学 报 38 卷
碳酸氢盐也是影响藻类碳酸酐酶活性的一种
无机碳因素。与盐度、CO2对 CA 活性影响的时
间变化类似，碳酸酐酶活性随着培养时间的增加
也表现了先升再降的趋势(图 8)。在第 5 天，各
碳酸氢盐浓度组培养藻的 CA 活性最高，其中 2
和 5 mmol /L HCO －3 组的酶活性分别为 122． 08 和
180． 50 U /109细胞。在 1 ～ 5 mmol /L HCO －3 范围
内，小球藻胞外碳酸酐酶活性基本随 HCO －3 浓度
的升高而升高;当 HCO －3 浓度达到 10 mmol /L
时，碳酸酐酶活性开始下降。即 5 mmol /L HCO －3
培养藻的 CA 活性最高，并且与其他 HCO －3 浓度
组之间差异显著(P ＜ 0． 05)。
图 8 HCO －3 对蛋白核小球藻
820 碳酸酐酶活性的影响
Fig． 8 The effect of HCO －3 on the
CA activity of C． pyrenoidosa 820
加入不同浓度 HCO －3 的 3 种亚型 ca 的转录
表达量均高于对照，其中 1 mmol /L HCO －3 组最
高，其次为 10 mmol /L HCO －3 组(图 9)。相对于
β-ca和γ-ca，α-ca表达变化最小，其最高表达量
图 9 HCO －3 对蛋白核小球藻 820 碳酸
酐酶基因表达的影响
Fig． 9 The effect of HCO －3 on the ca expression of
C． pyrenoidosa 820
(1 mmol /L HCO －3 组)是对照组的 1． 33 倍。β-ca
基因表达变化最高的 2 组(1 和 10 mmol /L
HCO －3 组)的表达量分别是对照组的 2． 44 倍和
1． 87倍。而 γ-ca基因表达变化最高的 2 组(1 和
10 mmol /L HCO －3 组)的表达量分别是对照组的
2． 13 倍和 1． 97 倍。统计学分析结果表明，5 种
HCO －3 浓度组 ca表达量均差异显著(P ＜ 0． 05)。
3 讨论
3． 1 盐度对微藻生长及碳酸酐酶的影响
盐度是影响微藻生长的重要因子，不同微藻
都有其适宜生长的盐度范围，盐度过高或过低都
不利于微藻的快速生长［27］。即使是极端耐盐的
杜氏藻(Dunaliella salina)仍然有其适宜的盐度
范围［28］。本研究结果表明，尽管高盐度对藻生长
具有一定的抑制作用，但该蛋白核小球藻在盐度
15 ～ 45 范围内均可以快速生长，说明它的适盐范
围比较广。
盐度对微藻碳酸酐酶活性及其转录表达水平
也 有 影 响。如 小 新 月 菱 形 藻 (Nitzschia
closterium)的胞外 CA 活性随盐度升高逐渐降
低［12］。但是不同藻种、不同盐度处理的结果并不
一致，盐度还可能促进碳酸酐酶活性及其基因表
达。如 Fisher 等［11］发现盐生杜氏藻中碳酸酐酶
的 mＲNA 和蛋白表达水平均随 NaCl浓度升高而
增加。Liu等［29］认为，将盐度 30 条件下生长的盐
生杜氏藻转到盐度 5 ～ 20 时，其 CA 活性和基因
表达均显著降低。本研究结果表明，蛋白核小球
藻的 CA 活性随盐度升高而降低，与小新月菱形
藻的结果一致。但本研究中 3 种亚型 ca 基因的
表达却随着盐度升高而增加，该结果与盐生杜氏
藻类似。出现胞外 CA 活性与 ca 基因表达变化
不一致的原因可能是由于碳酸酐酶具有多个亚
型，并且每一亚型又包含多种 CA，如莱茵衣藻的
胞外 CA 有两种 α-CA(CAH1 和 CAH2)编码［16］。
3． 2 CO2对微藻生长及碳酸酐酶的影响
大气 CO2浓度升高可以提高藻类的初级生产
力。这与培养水体中无机碳浓度升高可以促进光
合固碳作用，从而加速藻体生长有关［30］，并且，
CO2浓度的升高可以刺激氮在藻体内的吸收
［31］。
本研究结果也表明，较高 CO2浓度有利于蛋白核
小球藻 820 海水株的生长。
CO2浓度是调节 CCM 的重要因素之一。高
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7 期 王玮蔚，等:盐度和无机碳对蛋白核小球藻生长、胞外碳酸酐酶活性及其基因表达的影响
浓度 CO2可以抑制无机碳的转运，而低浓度 CO2
可以诱导 CCM 机制［20］，即在低无机碳条件下微
藻可以通过增强胞外 CA 活性来提高胞内 CO2水
平从而维持较高的光合固碳能力。如栅藻
(Scenedesmus sp．)在 2% CO2培养下几乎无 CA
活性，而在 0． 035% CO2浓度下可以检测到较高
CA 活性［32］。本实验也表明，2 倍空气 CO2浓度
培养藻的 CA 活性要显著低于空气 CO2浓度。
实验中 2 倍空气 CO2浓度可以增加 α-ca 和
γ-ca基因的表达，而其他微藻中不同 CO2浓度对
ca的 mＲNA 水平影响结果不同，如假微型海链藻
(Thalassiosira pseudonana)在 0． 16%CO2处理下，
3 条 α-ca、δ-ca、ζ-ca 的 mＲNA 表达量均显著下
降，而三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)在
空气 CO2和 5% CO2水平下 6 条 α-ca 和 γ-ca 基
因的 mＲNA 累积量没有变化［33］。
3． 3 HCO －3 浓度对微藻生长及碳酸酐酶的影响
碳酸氢盐是水体中无机碳的主要存在形式，
在藻类的生命活动中发挥着重要作用，如光合作
用、二氧化碳浓缩机制等。藻类具有从培养基中
摄取 HCO －3 的能力，但不同实验中所用方法不同，
因此，对 HCO －3 利用的定量分析结果也有不
同［34］。HCO －3 的含量也会直接影响微藻生长环
境的 pH，最终影响微藻的生长。本研究结果表
明，在0 ～ 10 mmol /L HCO －3 范围内，藻的生长与
其浓度呈正相关性。
碳酸氢盐对碳酸酐酶活性的影响在微藻中也
有报道，如铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在 0 ～ 20
mmol /L HCO －3 范围内，CA 活性与 HCO
－
3 浓度成
反比［10，13］。本结果表明在 0 ～ 5 mmol /L HCO －3
浓度范围内，蛋白核小球藻胞外 CA 活性随
HCO －3 浓度升高而升高。该小球藻与铜锈微囊藻
和雨生红球藻中 CA 活性变化不同，一是因为后
两种藻测定的是胞内 CA 活性，而本研究测定的
是胞外 CA 活性;还有一种可能是，小球藻中存在
HCO －3 直接转运途径
［20，35］，该途径与胞外 CA 活
性无关。当 HCO －3 浓度达到 10 mmol /L 时，碳酸
酐酶活性下降，推测其原因可能是大量 HCO －3 被
转运到细胞内，被胞内 CA 转化成 CO2为 Ｒubisco
羧化酶提供了足够的底物，不需要胞外 CA 来转
运 CO2。
研究表明，高盐条件下蛋白核小球藻生长较
慢，胞外碳酸酐酶活性降低;并且高浓度 CO2可以
促进小球藻生长，而降低胞外 CA 活性，说明该小
球藻中存在胞外碳酸酐酶，并且其活性受高盐和
高 CO2抑制。在 0 ～ 5 mmol /L HCO
－
3 条件下，藻
生长加快，胞外 CA 活性增强，说明该小球藻具有
直接利用 HCO －3 进行快速生长的能力。
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Effects of salinity and inorganic carbon on the growth，
extracellular carbonic anhydrase activity and ca gene
expression of Chlorella pyrenoidosa
WANG Weiwei1，2，SUN Xue1，2* ，WANG Dongmei1，2，SHEN Jia1，2，XU Nianjun1，2
(1． School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China;
2． Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province，Ningbo 315211，China)
Abstract:The aquatic algae have developed a carbon dioxide concentrating mechanism(CCM)to acclimate
to the CO2-limiting environmental conditions，of which carbonic anhydrase is the major component． In order
to explore the response pattern of carbonic anhydrase to environmental factors，and to improve the utilization
of inorganic carbon and algal biomass of Chlorella，the effects of salinity，CO2 and bicarbonate on the
growth，extracellular carbonic anhydrase activity and 3 subtypes of ca gene expression level of C．
pyrenoidosa were investigated by biochemical and real-time quantitative PCＲ methods in this study． Ｒesults
showed that the alga grew faster cultured in 15 and 30 salinity，and the algal density in 45 salinity was 0． 83-
fold of that in 15 salinity on the 9th day． The extracellular carbonic anhydrase activities were inhibited with
the increasing salinity，which was especially obvious after long-time treatment with 45 salinity． However，the
expression level of three subtypes of ca genes increased from 15 to 45 salinity，which could vary from 1． 52-
fold to 2． 16-fold of that cultured in 15 salinity． The algal density cultured in double air CO2(high CO2
level)could reach 1． 23-fold of that in air CO2(low CO2 level)． But the algal CA activity in high CO2 level
was lower，which was only 0． 41-fold of that cultured in low CO2 level on the 8
th day． The α- and γ-ca
mＲNA accumulations in high CO2 level were slightly higher，which were 1． 22 times and 1． 47 times that in
low CO2 level，respectively． The growth of C． pyrenoidosa was promoted when the bicarbonate concentration
ranged from 0 to 10 mmol /L． And the algal CA activity showed maximum value in 5 mmol /L HCO －3 group．
The highest levels of α-，β-and γ-ca were observed in 1 mmol /L HCO －3 group． It could be concluded that
the growth of C． pyrenoidosa 820 was suitable under the conditions of low and moderate salinity，double air
CO2 and higher bicarbonate concentration，and the CA activity was induced by low salinity，air CO2 and 5
mmol /L HCO －3 ． However，the ca mＲNA level was higher under high salinity，double air CO2 level and 1
mmol /LHCO －3 conditions．
Key words:Chlorella pyrenoidosa;salinity;CO2;carbonic anhydrase;ca gene
Corresponding author:SUN Xue． E-mail:sunxue@ nbu． edu． cn
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