全 文 ：·实验研究·
基金项目:“十二五”“重大新药创制”科技重大专项(No． 2013ZX09507005)
作者简介:黄一凡，女，研究方向:药物分析，E － mail:383539919@ qq． com
通讯作者:孟宪生，男，博士研究生，教授，博士生导师，研究方向:中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析，Tel:0411 － 85890185，E － mail:
mxsvvv@ 126． com
旋覆花中倍半萜内酯类成分提取工艺的优化及体外抗肿瘤药效研究
黄一凡1，王 帅1，2，3，孟宪生1，2，3，包永睿1，2，3
(1．辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600;2．辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600;
3．辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)
摘要:目的 采用正交试验设计考察旋覆花中倍半萜内酯类提取的影响因素，优选其最佳提取工艺，并结合体
外抗肿瘤药效学实验，考察其抗肿瘤的药理活性，为旋覆花的开发和利用提供理论依据。方法 采用正交试验设
计以 1 － O －乙酰基大花旋覆花内酯为考察指标，对影响倍半萜内酯类成分的提取工艺的 4 个因素乙醇浓度、提取
时间、提取次数、乙醇用量进行考察，优选最佳提取工艺。采用四唑盐 MTT 比色法检测对人肝癌细胞生长的影响，
探讨其体外抗肿瘤细胞增殖作用的规律。结果 最佳提取工艺条件为 15 倍量 80%乙醇提取 3 次，每次 2 h，其抗
肿瘤增殖作用呈现出良好的时间 －剂量 －效应关系。结论 本实验优选的最佳提取工艺及其体外抗肿瘤作用为
旋覆花的研究提供实验依据和理论基础。
关键词:旋覆花;倍半萜内酯;正交设计;提取工艺;抗肿瘤活性
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:A 文章编号:2095 －5375(2015)02 －0069 －003
Study on extraction process of sesquiterpene lactones from Flos Inulae
and the anti － cancer effect in vitro
HUANG Yi-fan1，WANG Shuai1，2，3，MENG Xian-sheng1，2，3，BAO Yong-rui1，2，3
(1． College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China;
2． Liaoning Province Multi －Component Chinese Medicine Engineering Technology Ｒesearch Center，Dalian 116600，China;
3． Liaoning Province Modern TCM Ｒesearch and Engineering Laboratory，Dalian 116600，China)
Abstract:Objective To inspect the influencing factors of extracting sesquiterpene lactones from Flos Inulae，and op-
timize the extraction process by orthogonal test． To investigate the pharmacological activity of anti － cancer effect combining
with the experiments of antineoplastic pharmacodynamics in vitro，and provide references and theoretical basis for the devel-
opment and utilization of Flos Inulae．Methods Four main factors of ethanol concentration，extraction time，times and etha-
nol amount were investigated to screen the optimum extraction process with ABL as investigating index by orthogonal experi-
mental design． This experiment used MTT assay to evaluate the antitumor activities of sesquiterpene lactones to the cell line
of HepG2 cells，and to explore the rule of the antitumor activities． Ｒesults The optimum conditions for the extraction of
Flos Inulae were:15 times amount of 80% ethanol，3 times reflux extraction，2 hour each time． The sesquiterpene lactones
suppressed the proliferation of HepG2 cells，it had a good does － time － effect relations． Conclusion The experiment was
designed to optimize the extraction process of Flos Inulae and the antitumor activities of sesquiterpene lactones in vitro，it
provided the basis of experiment and theoretical basis for Flos Inulae．
Key words:Flos Inulae;Sesquiterpene lactones;Orthogonal experimental design;Extraction process;Antitumor activi-
ties
·96·药学研究·Journal of Pharmaceutical Ｒesearch 2015 Vol． 34，No． 2
DOI:10.13506/j.cnki.jpr.2015.02.002
旋覆花为菊科植物旋覆花(Inula japonica
Thunb．)或欧亚旋覆花(Inula britannica L. )的干燥
头状花序［1］，旋覆花化学成分主要有甾醇类、黄酮
类、倍半萜内酯、萜类化合物和挥发油成分等，倍半
萜内酯类化合物中，1 － O －乙酰基大花旋覆花内酯
是其主要的有效成分之一［2］，其中倍半萜类化合物
是旋覆花属植物中特征性活性成分［3］，且具有抗
炎、抗肝炎、抗肝损伤、抗肿瘤等多种生物活性。旋
覆花中含有 1 － O －乙酰基大花旋覆花内酯(ABL)
等多种倍半萜内酯类化合物［4，5］，并且对肿瘤细胞
有明显的细胞毒活性［6］。中药化学成分复杂，发挥
药效的为具有相似性质的有效物质组，因此本实验
对旋覆花中倍半萜内酯类化合物的提取工艺进行研
究，为其工业化大生产提供实验依据。同时本实验
对提取得到的内酯类成分进行体外抗肿瘤药效学研
究，验证其抗肿瘤药理活性，为抗癌活性药物及其衍
生物的设计奠定物质基础，为旋覆花药材的临床应
用提供理论依据。
1 仪器与材料
LC － 10Avp 高效液相色谱仪(日本岛津);Sun-
rise 型酶标仪(奥地利 Tecan 公司);1 － O －乙酰基
大花旋覆花内酯对照品(四川省维克奇生物科技有
限公司，批号:131209);旋覆花药材购于大连民大
中药饮片有限公司，产地山东，经辽宁中医药大学翟
延君教授鉴定为欧亚旋覆花 Inula britannica L．的干
燥头状花序;人肝癌细胞株 HepG2(大连医科大
学);乙腈色谱纯(TEDIA公司);其他化学试剂均为
分析纯。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液的制备 精密称取 1 － O －乙酰基
大花旋覆花内酯对照品适量，加甲醇制成每 1 mL含
0. 148 mg的溶液，即得。
2. 2 供试品溶液的制备 取 9 份旋覆花药材粉末
5 g，精密称定，按正交实验设计表进行回流提取，滤
过，滤液减压浓缩，定容至 100 mL 容量瓶中，摇匀，
即得。所得样品溶液经 0. 45 μm 微孔滤膜滤过后
作为供试品溶液，备用。
2. 3 色谱条件 色谱柱为 Kromasil 100 － 5 － C18柱
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm);流动相为乙腈 －水(25
∶75);流速:1 mL·min －1;柱温:30 ℃ ;检测波长:
210 nm［7］。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶
液各 10 μL，注入液相色谱仪，测定。
2. 4 正交实验优选旋覆花中内酯类成分的提取工
艺 根据内酯类成分的性质、实际生产选择乙醇浓
度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、乙醇用量
(D)为考察因素进行 L9(3
4)正交试验考察，以 1 － O
－乙酰基大花旋覆花内酯的含量为考察指标，进行
提取工艺优化，正交实验设计及结果见表 1 ～ 3。
表 1 优选旋覆花倍半萜内酯类成分提取工艺
正交试验因素水平
水平 A乙醇浓度(%) B提取时间(h) C提取次数(次) D乙醇用量(倍)
1 65 1 1 15
2 80 1． 5 2 20
3 95 2 3 25
表 2 正交试验设计表及直观分析结果
实验
序号
A B C D
乙醇浓度 提取时间 提取次数 乙醇用量
1 － O －乙酰基大花旋覆花
内酯的含量(mg·g － 1)
1 65 1 1 15 0． 583 7
2 65 1． 5 2 20 0． 837 6
3 65 2 3 25 0． 960 8
4 80 1 2 25 0． 931 6
5 80 1． 5 3 15 1． 019 2
6 80 2 1 20 0． 863 2
7 95 1 3 20 0． 860 0
8 95 1． 5 1 25 0． 804 0
9 95 2 2 15 1． 001 8
K1 0． 794 0． 792 0． 750 0． 868
K2 0． 938 0． 887 0． 924 0． 854
K3 0． 889 0． 942 0． 947 0． 899
Ｒ 0． 144 0． 150 0． 197 0． 045
表 3 正交试验方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 0． 032 2 10． 667 19． 000
B 0． 035 2 11． 667 19． 000
C 0． 069 2 23． 000 19． 000 *
D(误差) 0． 003 2 1． 000 19． 000
由直观分析及方差分析影响提取工艺的因素顺
序为 C ＞ B ＞ A ＞ D，其中提取次数(C)对提取率影
响最大且有显著性意义(P ＜ 0. 05)，提取次数为 3
次符合药厂生产实际需要，再增加提取次数不适合
工业生产，因此确定最佳提取次数为 3 次。同时从
提取效率和节约溶剂角度，选择 A2B3D1，优选提取
工艺为 A2B3C3D1，即 15 倍量 80%乙醇提取 3 次，每
次 2 h。
2. 5 验证试验 为了确定最佳提取工艺的稳定性，
对其进行验证试验。分别称取 3 份等量的药材，按照
正交试验优选出的最佳提取工艺进行提取，1 － O －
乙酰基大花旋覆花内酯的平均含量为 1. 23 mg·g －1，
ＲSD为 2. 45%。
2. 6 旋覆花倍半萜内酯类成分对 HepG2 细胞增殖
抑制作用
2. 6. 1 给药溶液的配制 按照优化的提取工艺对
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旋覆花中内酯类成分进行提取，称取提取物粉末
0. 1 g用含 10%胎牛血清的 50 mL DMEM培养液溶
解，0. 2% DMSO助溶，0. 22 μm 微孔滤膜滤过作用
于 HepG2 细胞。
2. 6. 2 取处于对数生长期生长状态良好的 HepG2
细胞用胰酶制成细胞悬液并计数，调整细胞浓度 5
× 104 个·mL －1，接种于 96 孔培养板中，每孔接种
细胞悬液 100 μL，于 37 ℃ 5%CO2 及饱和湿度下培
养 24 h后，实验组加入样品溶液 60、100、140 μL 作
为低、中、高剂量组(每个剂量组设 5 个复孔)，空白
对照组加入等体积的培养液，继续培养 24、36、48 h
后，避光每孔加入 20 μL MTT 溶液(5 mg·mL －1)，
继续孵育 4 h后，吸弃上清，每孔加入 150 μL DMSO
至摇床上振摇 10 min 后，于酶标仪 492 nm 处测定
吸光值(OD)，计算药物对细胞的增殖抑制率，结果
见表 4。
抑制率 = (1 － 试验组 OD 值 /对照组 OD 值)
× 100%。
表 4 旋覆花内酯类有效组分对肝癌细胞 HepG2
的生长抑制作用
作用时间(h) 给药剂量 OD值(x ± s) 抑制率(%)
24
空白对照组 1． 033 2 ± 0． 042 6 －
低剂量组 0． 765 1 ± 0． 035 4* 25． 95
中剂量组 0． 706 3 ± 0． 086 3* 31． 64
高剂量组 0． 601 5 ± 0． 084 9* 41． 78
36
空白对照组 1． 221 0 ± 0． 047 9 －
低剂量组 0． 806 9 ± 0． 074 6* 33． 92
中剂量组 0． 732 9 ± 0． 090 7* 39． 98
高剂量组 0． 633 4 ± 0． 066 9* 48． 12
48
空白对照组 1． 384 6 ± 0． 054 7 －
低剂量组 0． 842 1 ± 0． 049 4* 39． 18
中剂量组 0． 804 9 ± 0． 067 1* 41． 87
高剂量组 0． 652 2 ± 0． 040 3* 52． 90
注:与空白对照组相比，* P ＜ 0. 05
由表 4 可知，随着给药剂量和作用时间的延长，
人肝癌细胞 HepG2 的增殖活力逐渐下降，即增殖抑
制率增加，在作用 48 h 后，各剂量组的抑制率达到
最大值，分别为 39. 18%、41. 87%、52. 90%，其抗肿
瘤增殖作用呈现出良好的时间 －剂量 －效应关系。
3 讨论
中药有效成分复杂，针对某方面的疗效为有效
成分群，即有效物质组，因此对中药中发挥药效组分
物质进行研究为中药的进一步开发具有一定的意
义。本研究前期通过尝试 Kedde 试剂即 3，5 －二硝
基苯甲酸试液及 KOH 溶液及 Baljet 碱性苦味酸试
剂测定总内酯含量效果不理想，可能与含有的内酯
类成分不含活性次甲基有关。同时由于旋覆花中含
有黄酮类成分，能与 FeCl3 反应，因此不能用异羟肟
酸铁反应测定总内酯的含量。旋覆花中含有多种内
酯类成分，其中 1 － O －乙酰基大花旋覆花内酯含量
较高且有细胞毒活性［6］，因此选取其为倍半萜内酯
类成分提取工艺的考察指标。
本实验对最佳提取工艺提取的内酯类成分进行
体外抗肿瘤药效学研究，结果表明其对 HepG2 细胞
的增殖抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性，说明
了旋覆花中倍半萜内酯类有效部位含量的高低、作
用时间与体外药效强弱呈正向线性关系，即内酯类
量越高、作用时间越长所对应的药效活性越强。
本研究首先采用定量方法优选其最佳提取工
艺，同时采用药理活性方法验证其体外抗肿瘤药效，
充分说明了提取成分与药效的关系，为旋覆花的进
一步开发和临床抗肿瘤药物的筛选提供依据。
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