全 文 ：第 35 卷第 23 期
2015年 12月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol．35，No．23
Dec．，2015
http:/ /www．ecologica．cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31160049)
收稿日期:2014-04-20; 网络出版日期:2015-05-19
* 通讯作者 Corresponding author．E-mail:zjbshz@ 126．com
DOI:10．5846 /stxb201404200774
杨晶，祝建波，张亚敏，李曹龙，王海霞，王爱英．低温胁迫对转新疆雪莲 sikＲbcs2基因烟草光合作用的影响．生态学报，2015，35(23) :7868-7877．
Yang J，Zhu J B，Zhang Y M，Li C L，Wang H X，Wang A Y．Effects of low temperature stress on photosynthesis in sikＲbcs2 transgenic tobacco．Acta
Ecologica Sinica，2015，35(23) :7868-7877．
低温胁迫对转新疆雪莲 sikＲbcs2 基因烟草光合作用的
影响
杨 晶，祝建波* ，张亚敏，李曹龙，王海霞，王爱英
新疆石河子大学生命科学学院，石河子 832000
摘要:研究分布于新疆的雪莲(Saussurea involucrata)中的 sikＲbcs2基因在低温条件下对植物光合作用的影响，以 16、10、6、4 ℃
温度梯度处理非转基因型和转 sikＲbcs2基因型烟草，每个温度处理 72 h，比较研究其叶绿素荧光特性和光合特性。实验分析结
果:低温胁迫下，转基因型烟草叶片叶绿素 a(Chla)、叶绿素 b(Chlb)、叶绿素 a+b(Chla+Chlb)、类胡萝卜素(Car)含量都显著高
于非转基因型烟草。叶绿素荧光参数分析:低温胁迫下，转基因烟草 PSⅡ最大光化学效率(Fv /Fm)、qP(光化学猝灭系数)、
ETＲ(电子传递效率)都显著或极显著高于非转基因型，光合参数测定:随着低温胁迫程度的加剧，转基因烟草和非转基因型烟
草净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间 CO2浓度(Ci)总体都呈下降趋势，但转基因烟草的净光合速率有一个
明显的动态变化，先急剧下降后有一个稳定上升的趋势。通过对生长指标的测定发现:在低温处理后和恢复后转基因烟草生物
量的积累都显著高于非转基因型烟草。研究结果表明:转新疆雪莲 sikＲbcs2 基因的烟草在低温条件下具有较高的 Fv /Fm、qP、
ETＲ，对光合机构的损伤小，降低了低温胁迫效应，提高了烟草在低温胁迫条件下的耐受性。
关键词:低温胁迫;叶绿素荧光;光合作用;Ｒbcs
Effects of low temperature stress on photosynthesis in sikＲbcs2 transgenic tobacco
YANG Jing，ZHU Jianbo* ，ZHANG Yamin，LI Caolong，WANG Haixia，WANG Aiying
College of Life Science Shihezi University，Shihezi 832000，China
Abstract:1，5-Diphosphate ribulose carboxylase /oxygenase (EC 4．1．1．39，Ｒubisco)is the key enzyme in the metabolism
of photosynthetic carbon in higher plants，and it catalyzes CO2 fixation and reduction． Ｒubisco controls the metabolic rate of
photosynthesis and photorespiration and has a critical effect on the net photosynthetic rate． The enzyme comprises eight
major subunit (rbcL)and eight small subunit (rbcs)L8S8 polymer composites． The expression of small subunits is
important for regulating the expression of large subunits． Enzyme activity is important in photosynthetic electron transport
and photochemical quenching．The influence of low temperature on plant physiological metabolism is multifaceted，especially
with respect to the key factors that influence the photosynthetic system． The major manifestations are the blocking synthesis
in the chloroplast，the destruction of chloroplast structure，the decrease in photosynthetic electron transport activity，and the
decline in related enzyme activity in the process of photosynthesis． Under low temperature stress，reactive oxygen species
accumulate and damage the photosynthetic apparatus through oxidation． In contrast， the light-harvesting ability，
Photosystem II maximal photochemical efficiency (Fv /Fm) ，and other indices decrease． In addition，enzyme activities that
catalyze the photo dark reaction also decline． Saussurea involucrata is a typical extreme low temperature-resistant higher
plant． After a long period of natural selection in extreme environmental conditions，S． involucrata formed a series of
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mechanisms to adapt to harsh natural conditions，and developed a unique mechanism to maintain high photosynthetic
activity at low temperatures． Previous research by our laboratory isolated a full-length cDNA encoding a Ｒubisco small
subunit gene，named sikＲbcs2，from a cDNA library of S． involucrata leaves induced by cold stress． Sikrbcs2 showed high
identity of 57． 54% to that of rbcs from Helianthus annuus，and could noticeably improve the cold resistance ability of
tobacco．Tobacco is used as one of the model organisms for studying plant molecular biology． Low temperature has a clear
effect on tobacco photosynthesis． To study the effects of the S． involucrata sikＲbcs2 gene on plant photosynthesis under cold
conditions，sikＲbcs2-transgenic tobacco and non-transgenic tobacco plants were exposed to various temperatures (16，10，
6，and 4 ℃)under low light (70 μmol m－2 s－1)for 72 h，and the chloroplast pigment content，photosynthetic rate，and
chlorophyll fluorescence parameters were measured in the leaves． The contents of chlorophyll a，chlorophyll b，and
chlorophyll a+b were significantly higher in transgenic tobacco than in non-transgenic tobacco after cold stress treatment．
Furthermore，the Fv /Fm，photosynthetic electron transport (ETＲ) ，and photochemical quenching coefficient (qP)of
transgenic tobacco decreased more slowly than those of non-transgenic tobacco under low temperature stress． In comparison，
the nonphotochemical quenching coefficient (qN)increased faster in transgenic than non-transgenic tobacco． Measurements
of the photosynthetic parameters showed that，as temperature decreases，the net photosynthesis rate (Pn) ，stomatal
conductance (Gs) ，transpiration rate (Tr) ，and intercellular CO2 concentration (Ci)of both transgenic tobacco and non-
transgenic tobacco declines． However，the Pn of transgenic tobacco exhibited a noticeably variable trend，initially falling
sharply and then rising steadily． After cold treatment，the leaf plastochron index，shoot length，stem diameter，fresh weight
of the shoot and root，and dry weight of the shoot and root were higher for transgenic than non-transgenic tobacco． The
results indicate that low temperatures damage non-transgenic tobacco． In contrast，the damage to transgenic tobacco
containing large numbers of sikＲbcs2 proteins，which act as molecular chaperones，was reduced in response to cold stress，
with better low temperature stress tolerance and higher biomass accumulation． Through the preliminary analysis ofchlorophyll
fluorescence and photosynthesis characteristics of sikＲbcs2-transgenic tobacco and non-transgenic tobacco plants under low
temperature conditions， this study provides the experimental and theoretical grounding for the further study of the
mechanism of how the sikrbcs2 gene acts in photosynthesis．
Key Words:low temperature stress;photosynthesis;chlorophyll fluorescence;Ｒbcs
温度是影响植物光合作用的重要因素［1］，植物处于高温或低温的环境中其光合作用会受到明显的影响。
低温胁迫会引起植物叶绿素合成受到阻碍［2］，叶绿体结构遭到破坏［3］，光合电子传递活性下降［4］，光合作用
过程中酶的活性降低，CO2的同化受阻
［5］，导致植物光合作用效率降低。
Ｒubisco(1，5-二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶)是高等植物光合碳代谢过程中的关键酶，处于光合碳还原和
光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性
大小对净光合速率起着决定性作用［6］。Ｒubisco由 8个大亚基(ＲbcL)和 8个小亚基(Ｒbcs)组成，大亚基由叶
绿体基因组编码，小亚基是由细胞核基因组编码。小亚基 Ｒbcs mＲNAs 表达水平与 Ｒubisco 含量是高度相关
的，二者之间有很好的协同表达，小亚基对大亚基的表达具有调控作用［7-8］。Ｒubisco 的活性中心位于大亚基
上，行使主要功能，但其多个小亚基编码基因的功能还不是很清楚。Spreitzer［9］认为，小亚基可能在进化过程
中扮演聚集大亚基活性位点的角色，并且小亚基可能有更多特异性功能，小亚基能促进 CO2与 Mg
2+对 Ｒubisco
的活化，维持和稳定 Ｒubisco的活化构象。Miao 和 Li［10］通过烟草和水稻大、小亚基的异源分子杂交发现，杂
合酶的羧化和氧化比值与小亚基的来源有很大的关系。Du Y C 等［11］利用蓝藻的实验结果也揭示小亚基在
调控 Ｒubisco羧化 /氧化比值方面的重要作用。为此，人们希望用不同植物的大、小亚基组成全酶来提高羧化
活性和降低加氧活性［12］。但是，到目前为止，还没有成功的报道。澳大利亚的 Badger 认为 Ｒubisco 的羧化和
氧化的比值与酶反应速率有某种相关，羧化和氧化的比值越高，反应速率越慢［13］。因此推测提高 Ｒubisco 羧
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化和氧化的比值的定点修饰有可能会导致酶反应速率的下降。
大豆 Ｒbcs 基因含有 3 个不同拷贝，对许多外界因子如水杨酸、盐胁迫和干旱处理具有明显的应答反应。
但不同浓度的水杨酸和 NaCl对 Ｒbcs基因的转录有不同程度的诱导［14］。说明 Ｒbcs基因表达调控与植物抗逆
性有一定的关联。新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar．et Kir．Exmaxim) ，主要生长在海拔 2400—5800 m 的高
山流石坡以及雪线附近的碎石间。那里气候奇寒、终年积雪不化，最高月平均温 3—5 ℃，最低月平均温
－19—－21 ℃，无霜期仅有 50d左右［15］。经过长期极端环境条件的自然选择，新疆雪莲自身形成了独特的光
合保护机制，研究其 Ｒbcs基因在低温光保护机制中的作用具有重要的意义。
烟草作为植物分子生物学研究的模式植物，原产于亚热带，生长最适温度为 25—28 ℃，低于 10 ℃时生长
受阻，低温对烟草的生长发育、产量和品质都有明显的影响［16］。本试验前期从新疆雪莲 cDNA文库中克隆了
1个 Ｒubisco的小亚基基因(sikＲbcs2)cDNA 全长序列，该基因与向日葵氨基酸序列的同源性最高，只有
57．54%。构建了诱导表达载体 ＲD29A:sikＲbcs2和过表达载体 35S:sikＲbcs2，通过农杆菌介导转化 NC-89 烟
草，获得了 T0代的转基因烟草种子。组成型表达的转基因烟草植株能够明显的提高烟草的抗寒能力，并且在
低温条件保持较高的光化学效率。在此基础上本试验采用低温胁迫法对非转基因型烟草和转 SikＲbcs2 基因
的烟草进行处理，测定叶绿体色素含量、叶绿素荧光参数、光合参数以及生物量，分析在不同低温胁迫下
sikＲbcs2对叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素，净光合速率、气孔导度、胞间 CO2浓度以及叶绿素荧光参数的影
响，为进一步研究新疆雪莲 sikＲbcs2基因在低温光合中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
植物材料 植物材料为‘NC98’烟草、转 ＲD29A:sikＲbcs2和 35S:sikＲbcs2基因的‘NC98’烟草由本实验保存。
1．2 方法
1．2．1 试验材料的培养与胁迫处理
将经卡那霉素筛选获得的转基因型烟草幼苗(ＲD29A:sikＲbcs2 和 35S:sikＲbcs2)和空白对照烟草移栽于装有
营养土(草炭∶蛭石∶珍珠岩 3∶1∶1)的营养钵(内径为 8 cm，高度为 10 cm杯底有孔)中，置于植物生长室中培养。定
期浇水，每天光照 12 h，昼夜温度为 25 ℃ / 18℃。当苗生长 3月龄时，将长势一致的对照烟草和 2种转基因烟草移
入人工气候箱中(光照强度 70 μmol m－2 s－1，温度 25 ℃ /25 ℃，光周期为 12 h /12 h，相对湿度为 60%—70%)适应两
天后，进行持续低温胁迫处理，温度梯度为 16、10、6、4 ℃，每个温度处理 72 h。实验重复 3次，每次重复非转基因型
和转基因型烟草(ＲD29A ∶ sikＲbcs2和 35S ∶ sikＲbcs2)各 20株苗。
1．2．2 叶绿素荧光参数及光合参数的测定
选择并标记植株倒四叶，各温度处理 72h后，用 GFS-3000 便携式光合系统测定仪测定气孔导度(Gs)、蒸腾速
率(Tr)、净光合速率(Pn)、胞间 CO2浓度(Ci)。将待测植株暗处理 20 min后，用 Mini-PAM光量子分析仪测定荧光
参数:初始荧光强度(Fo)、最大荧光强度(Fm)、PSⅡ最大光化学效率(Fv /Fm)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝
灭系数(qN)、电子传递速率(ETＲ)。每叶测定 3个值，取平均值。
1．2．3 叶绿素含量和类胡萝卜素含量的测定［17］
在各温度处理后，取非转基因型烟草和转基因型烟草植株倒四叶中部叶片，选取的叶片要求无黑斑、无病变、
无腐烂，颜色均匀一致。剪成约 1 mm宽的细丝，准确称取 0．1 g放至试管，加入 15 mL 丙酮乙醇混合液(体积分数
为1 ∶1) ，在室温下避光提取至细丝完全变白后，混匀取上清液用分光光度计测定 470、645 nm和 663 nm处的吸光度
值。计算叶绿素 a(Chla) ，叶绿素 b(Chlb)和类胡萝卜素(Car)含量。
1．2．4 生长指标的测定
叶片生长指数(PI)根据 Coleman和 Grcyson［18］的测定方法，计算公式为 PI = n + (In n－In Ｒ)/ (In Ln－In Ln +
1) ，式中参比叶长 Ｒ为 180 mm，n 为叶片长度长于参比叶长的叶片数，In Ln 和 In Ln + 1分别为第 n 及 n + 1 片叶
的长度。株高用直尺测量，茎的直径用游标卡尺测量，叶长和叶宽用直尺测量，鲜重和干重用电子天平测量，分别
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在处理前、低温梯度持续处理 12d后和恢复 14d测定。
1．2．5 数据处理
采用 SPSS17．0软件进行数据处理分析，以 LSD法进行差异显著性分析，显著性水平设定为 P＜0．05(显著水平)
和 P＜0．01(极显著水平) ，采用 Excel软件作图。
2 结果与分析
2．1 低温胁迫对转 sikＲbcs2基因烟草叶绿素荧光参数的影响
图 1 低温胁迫对 CK型和 sikＲbcs2型烟草初始荧光、最大荧光和 PSⅡ最大光化学效率的影响
Fig．1 Effect of low temperature stress on Fo，Fm and Fv /Fm in CK and sikＲbcs2 tobacco
CK:非转基因型烟草，35S ∶sikＲbcs2 表示转 35S ∶ sikＲbcs2 型烟草，ＲD29A ∶ sikＲbcs2 表示转 ＲD29A ∶ sikＲbcs2 型烟草;Fo:初始荧光 Minimal
fluorescence，Fm:最大荧光 Maximal fluorescence，Fv /Fm:PSⅡ最大光化学效率 The maximal photochemical efficient of PSⅡ;* 同一温度胁迫
处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比差异达到显著水平(P＜0．05) ;＊＊同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比差异达到
极显著水平(P＜0．01)
2．1．1 低温胁迫对初始荧光强度(Fo)、最大荧光强度(Fm)和 PSⅡ最大光化学效率(Fv /Fm)的影响
Fo为初始荧光，表示已经暗适应的光合机构 PSⅡ反应中心完全开放时的荧光强度，即原初电子受体 QA完全
氧化时的荧光产量。Fo值的上升表明 PSⅡ反应中心发生可逆失活或破坏［19］。由图 1可知，随着胁迫温度的降低，
非转基因型烟草的 Fo值呈逐渐上升的趋势，转基因型烟草的 Fo值先下降后上升，在 4℃胁迫处理后，转基因型烟
草 Fo值极显著低于非转基因型烟草，说明转基因型烟草 PSⅡ反应中心遭到的破坏程度要小于非转基因型烟草。
Fm为最大荧光产量，指已经暗适应的光合机构 PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光强度。随着胁迫温度的降低，非
转基因型烟草的 Fm值降幅较大，组成型表达 sikＲbcs2基因的烟草 Fm值在 10 ℃胁迫后，极显著高于非转基因型烟
草的 Fm值，但是诱导型表达 sikＲbcs2基因的烟草 Fm值一直保持较低的水平，并且随着胁迫温度的降低其降幅也
较小。Fv /Fm是 PSⅡ最大光化学效率，能反映 PSⅡ反应中心光能转化效率，其值的降低表明植物发生了光抑
制［20］。低温胁迫下非转基因型烟草和转基因型烟草叶片的 Fv /Fm下降与胁迫程度呈正相关，到 4 ℃胁迫处理后非转
基因型烟草 Fv /Fm值下降 20%，组成型表达 sikＲbcs2烟草 Fv /Fm值下降 11%，诱导型表达 sikＲbcs2烟草 Fv /Fm值下降
14%，由此说明转 35S ∶sikＲbcs2型烟草发生光抑制程度小于转 Ｒd29A ∶sikＲbcs2型烟草且都小于非转基因型烟草。
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2．1．2 低温胁迫对光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)的影响
qP为光化学猝灭系数，反映了 PSⅡ原初电子受体 QA的还原状态和 PSⅡ开放中心的数目，其值下降说明 QA-
QB的电子传递受到抑制［19］。其值越低说明 PSⅡ反应中心开放部分的比例越小，能够传递的电子数量也较少，在
单位时间内光合电子传递的速度较慢［21］。由图 2可知，随着胁迫温度的降低，非转基因型烟草的 qP值有明显的下
降趋势，4 ℃胁迫后其值下降 50．15%，组成型表达 sikＲbcs2烟草 qP值下降 26．39%，诱导型表达 sikＲbcs2 烟草 qP值
下降 10．29%，由此说明，低温胁迫下，非转基因型烟草 QA-QB的电子传递发生了较大程度的抑制，而转基因型烟草
QA-QB的电子传递受到的抑制程度较小。
图 2 低温胁迫对 CK型和 sikＲbcs2型烟草光化学猝灭系数和非光化学猝灭猝系数的影响
Fig．2 Effect of low temperature stress on qP and qN in CK and sikＲbcs2 tobacco
qP:光化学猝灭系数 Photochemical quenching，qN:非光化学猝灭系数 Non-photochemical quenching;* 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草
与 CK型烟草相比差异达到显著水平(P＜0．05) ;＊＊ 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比差异达到极显著水平(P＜0．01)
图 3 低温胁迫对 CK型和 sikＲbcs2型烟草电子传递效率的影响
Fig． 3 Effect of low temperature stress on ETＲ in CK and
sikＲbcs2 tobacco
ETＲ:电子传递效率 Ｒate of electronic transmission;* 同一温度胁
迫处理下 sikＲbcs2 型烟草与 CK 型烟草相比差异达到显著水平
(P＜0．05) ;＊＊ 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草
相比差异达到极显著水平(P＜0．01)
qN为非光化学淬灭，反映了 PSⅡ天线色素吸收的光
能不能用于光合电子传递而是以热的形式耗散的部分，当
PSⅡ反应中心天线色素吸收了过量的光能时，如不能及时
地耗散掉，将对光合机构造成失活或破坏，所以非光化学
淬灭是植物体的一种自我保护机制，对光合机构起一定的
保护作用［22］。由图 2所示，随着低温胁迫程度的加剧，非
转基因型烟草的 qN基本没有变化，但转基因型烟草 qN呈
上升趋势，诱导型表达 sikＲbcs2基因的烟草在 16 ℃处理后
有明显的上升趋势，说明转基因型烟草受到低温胁迫后能
够以热的形式耗散过多的光能，对光合机构起到一定的保
护作用，在低温胁迫下有更好的适应性和耐受性。
2．1．3 低温胁迫对电子传递速率(ETＲ)的影响
ETＲ为表观光合电子传递速率，是光合作用中光能转
化最大效率的一种度量，可以反映光合机构机能的变
化［3，23］。如图 3 所示，在低温胁迫后，非转基因型烟草的
电子传递效率极显著低于转基因型烟草的 ETＲ 值(P＜
0．01)并且降幅较大。在正常生长条件下，组成型表达
sikＲbcs2基因的烟草电子传递效率显著高于非转基因型烟
草，16 ℃胁迫处理后转基因烟草的电子传递效率显著高于非转基因型烟草(P＜0．05) ，随着胁迫温度的降低，转基
因烟草的电子传递效率极显著高于非转基因型。在 4 ℃胁迫处理后，非转基因型烟草电子传递效率下降 50%，组
成型表达 sikＲbcs2基因的烟草电子传递效率下降 30%，诱导型表达 sikＲbcs2基因的烟草电子传递效率下降 16%，说
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明在低温胁迫期间，转基因型烟草与非转基因型烟草相比，一定程度上改善了低温胁迫对烟草叶片表观光合量子
传递效率的抑制。
表 1 正常生长条件下(3 月龄)CK 型和 sikＲbcs2 型烟草植物学
性状
Tablel 1 Botanical traits of CK and sikＲbcs2 In normal condition
(3 months)
株系 Type CK 35S ∶sikＲbcs2 ＲD29A ∶sikＲbcs2
叶形 Leaf type 卵圆形 橄榄形 卵圆形
叶面
Leaf surface 平 皱折 较平
叶缘
Leaf margin 较平 皱折 较平
叶色
Leaf color 绿 浓绿 深绿
叶片厚度
Leaf thickness 中 厚 较厚
最大叶片长 / cm
Length of maximum leaf
20．91 19．56 21．46
最大叶片宽 / cm
Width of maximum leaf
9．56 11．82 11．53
叶片数
Vane number
14 18 17
2．2 低温胁迫对叶绿体色素含量的影响
通过对转基因型和非转基因型烟草的植物学性状
比较发现，转基因型烟草和非转基因型烟草有较大的区
别(表 1)。如叶色，非转基因型烟草叶色呈绿色，组成
型表达 sikＲbcs2基因的烟草叶色呈浓绿色，诱导型表达
sikＲbcs2基因的烟草叶色呈深绿。其次叶片厚度有明显
的差异，厚度依次为 35s ∶sikＲbcs2＞ＲD29A ∶sikＲbcs2＞CK。
由此推断转基因烟草叶片叶绿素含量可能高于非转基
因型烟草，进一步对叶绿体色素含量进行测定，结果如
图 4所示，组成型表达 sikＲbcs2基因的烟草在正常生长
条件下和低温处理处理期间，叶绿素含量都显著高于非
转基因型烟草，而诱导型表达 sikＲbcs2 基因的烟草在在
正常生长条件下低于非转基因型烟草，但随着胁迫程度
的加剧，叶绿素含量缓慢上升，非转基因型烟草则呈下
降趋势。叶绿素 a /b的比值在 16℃胁迫后低于非转基
因型烟草，随后缓慢上升。组成型表达 sikＲbcs2 基因的
烟草在胁迫处理前后，叶绿素 a和叶绿素 b含量显著高
于非转基因型烟草，而诱导型表达 sikＲbcs2基因的烟草与非转基因型烟草相比变化不显著，但随着胁迫温度
的降低，其值有一定的波动。与叶绿素含量相似，类胡萝卜素(Car)含量的变化是转基因烟草随胁迫温度的
降低有一个动态变化的过程，而非转基因型烟草呈下降趋势。
2．3 低温胁迫对光合特性的影响
由图 5可知，低温对于烟草植物的净光合速率，气孔导度，蒸腾速率影响很大，不论是转基因烟草还是非
转基因型烟草，在 16 ℃处理 72h后，净光合速率，气孔导度，蒸腾速率急剧下降，并在持续的低温处理期间，一
直处于较低的水平。转基因烟草和非转基因型烟草胞间 CO2浓度随着温度梯度的呈下降趋势，转基因烟草下
降趋势趋缓，并在 16—4 ℃区间维持相对较高的水平。通常认为植物在受到逆境胁迫时，净光合速率的下降
是由以下两种因素引起，一种是气孔因素，另一种是非气孔因素［24-25］。当净光合速率下降是由于气孔关闭导
致细胞间隙 CO2浓度降低从而降低了光合能力说明是由气孔因素引起的。当净光合速率和气孔导度下降的
同时胞间 CO2浓度却上升，即净光合速率的降低是由非气孔因素引起的。本试验结果表明在低温胁迫下非转
基因型烟草和转基因型烟草的净光合速率下降主要是由气孔关闭引起的。
2．4 低温胁迫对生长发育及生物量的影响
2．4．1 低温胁迫对叶片生长指数、株高、直径的影响
如图 6所示，在低温胁迫处理 12d后，非转基因型烟草叶片生长指数 PI基本不变，表明其生长基本停止，
转基因型烟草叶片生长指数与处理前相比有一定的增加，其中组成型表达 sikＲbcs2 基因的烟草增加12．18%，
诱导型表达 sikＲbcs2基因的烟草增加 10．55%。恢复处理 14d 后，非转基因型烟草 PI 值增加 9．1%，组成型表
达 sikＲbcs2基因的烟草增加 36．81%，诱导型表达 sikＲbcs2基因的烟草增加 22．68%。由此可见，在低温胁迫解
除后，转基因型烟草能够迅速恢复生长而非转基因型烟草恢复较慢。株高、直径是对温度十分敏感的主要农
艺性状之一［26］。低温处理期间，非转基因型烟草的株高和直径基本不变，生长被抑制，转基因型烟草在低温
处理后及恢复后株高和直径都高于非转基因型烟草，其中株高极极显著高于非转基因型烟草。
2．4．2 低温胁迫对生长量的影响
低温处理对生长量的影响如表 2所示，经持续低温处理后非转基因型烟草地上部分鲜重下降，而转基因
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图 4 低温胁迫对 CK型和 sikＲbcs2型烟草叶绿体色素含量的影响
Fig．4 Effect of low temperature stress on the chlorophyll contents in CK and sikＲbcs2 tobacco
Chl a:叶绿素 a Chlorophyll a，Chl b:叶绿素 b Chlorophyll b，Car:类胡萝卜素 Carotenoids;* 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟
草相比差异达到显著水平(P＜0．05) ;＊＊ 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比差异达到极显著水平(P＜0．01)
型烟草地上部分鲜重有比较明显的增加，其中组成型表达 sikＲbcs2 基因的烟草增加 74．49%，诱导型表达
sikＲbcs2基因的烟草增加 19．53%。恢复 14d后转基因型烟草和非转基因型烟草生长量都呈增加趋势，其中组
成型表达 sikＲbcs2基因的烟草增加 43．1%，诱导型表达 sikＲbcs2基因的烟草增加 55．5%，非转基因型烟草增加
22．55%。对于地下部分而言，转基因型烟草根系比较发达，经低温处理后均导致了非转基因型烟草和转基因
型烟草鲜重的降低，在恢复处理后均有所升高。通过干重的比较可以发现，经低温处理后，非转基因型烟草的
地上部分干重下降，而转基因型烟草地上部分干重有一定程度的增加，恢复 14d 后地上部分干重的增幅为
35S:sikＲbcs2(50．26%)＞ＲD29A ∶sikＲbcs2(38．4%)＞CK(26．88%)。低温处理后地下部分干重并未下降，在恢复
过程中都有一定程度的升高，增幅变化为 ＲD29A ∶sikＲbcs2(58．95%)＞ 35S ∶sikＲbcs2(41．34%)＞CK(32．14%)。
当前，对于 Ｒubisco小亚基在抗逆方面尤其是光保护机制的研究几乎是空白。本研究发现，表达新疆雪
莲 Ｒubisco小亚基 sikＲbcs2基因的烟草，不仅对光合系统具有良好的低温光保护作用，而且能够使转基因植物
在低温条件下具有良好的生长特性。在正常的生长条件下，转基因型烟草在形态上与非转基因型烟草表现出
明显的区别。转基因型烟草叶色深，叶片厚，叶面皱折，长宽比减小，根系发达，生长快。这与高山植物叶绿体
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图 5 低温胁迫对 CK型和 sikＲbcs2型烟草净光合速率、气孔导度、胞间 CO2浓度蒸腾速率的影响
Fig．5 Effect of low temperature stress on Pn、Gs、Ci、and Tr in CK and sikＲbcs2 tobacco
Pn:净光合速率 Net photosynthetic rate，Gs:气孔导度 Stomatal conductance，Ci:胞间 CO2浓度 Intercellular CO2 concentration，Tr:蒸腾速率
Traspiration ratio;* 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比差异达到显著水平(P＜0．05) ;＊＊ 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2
型烟草与 CK型烟草相比差异达到极显著水平(P＜0．01)
表 2 低温处理对 CK型和 sikＲbcs2型烟草地上部、地下部生长量的影响
Table 2 Effect of low temperature stress on FW，DW of shoot and root in CK and sikＲbcs2 tobacco
处理 Treatment
鲜重
Fresh weight /(g /株)
干重
Dry weight /(g /株)
地上部 处理前 CK 22．27±2．04 2．09±0．08
Shoot Before treatment 35S ∶sikＲbcs2 26．66±2．90 2．69±0．67
ＲD29A ∶sikＲbcs2 25．60±1．47 2．43±0．22
处理后 CK 21．20±2．57 1．86±0．85
After treatment 35S ∶sikＲbcs2 46．52±2．79＊＊ 3．92±0．32＊＊
ＲD29A ∶sikＲbcs2 30．60±2．31 2．50±0．38
恢复后 CK 25．98±0．60 2．36±0．90
After recovery 35S ∶sikＲbcs2 66．57±2．49＊＊ 5．89±0．18＊＊
ＲD29A ∶sikＲbcs2 47．46±2．17＊＊ 3．46±0．42
地上部 处理前 CK 1．71±0．76 0．24±0．04
Ｒoot 35S ∶sikＲbcs2 5．60±1．20 0．86±0．16＊＊
ＲD29A ∶sikＲbcs2 3．32±1．39 0．47±0．19＊＊
处理后 CK 1．45±0．27 0．28±0．06
35S ∶sikＲbcs2 5．53±0．32＊＊ 1．04±0．12＊＊
ＲD29A ∶sikＲbcs2 3．28±0．43＊＊ 0．56±0．17＊＊
恢复后 CK 2．00±0．81 0．37±0．13
35S ∶sikＲbcs2 6．33±1．06＊＊ 1．47±0．17＊＊
ＲD29A ∶sikＲbcs2 4．12±0．43* 0．89±0．05＊＊
处理后指从 16—4 ℃持续低温 12d后;恢复后指从低温处理后放置正常生条件下 14d后;* 相同处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比
差异达到显著水平(P＜0．05) ;＊＊ 相同处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比差异达到极显著水平(P＜0．01)
578723期 杨晶 等:低温胁迫对转新疆雪莲 sikＲbcs2基因烟草光合作用的影响
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图 6 低温胁迫对 CK型和 sikＲbcs2型烟草叶片生长指数、株高和直径的影响
Fig．6 Effect of low temperature stress on PI 、shoot lenght and stem diameter in CK and sikＲbcs2 tobacco
处理后指从持续低温 16—4 ℃的 12d后;恢复后指从低温处理后放置正常生条件下 14d后;* 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK
型烟草相比差异达到显著水平(P＜0．05) ;＊＊ 同一温度胁迫处理下 sikＲbcs2型烟草与 CK型烟草相比差异达到极显著水平(P＜0．01)
小而多，叶片厚，栅栏组织发达相类似。诱导型表达 sikＲbcs2基因烟草和组成型表达 sikＲbcs2烟草与非转基因
型烟草相比表现出明显的高山植物光合机构特点的趋向性，这说明 sikＲbcs2基因对于植物生态适应性的表型
发育可能具有一定调节作用。
植物在受到逆境胁迫时，叶绿体色素的含量和组成会发生相应的变化，能够反映植物光合能力的强
弱［27］。转基因烟草在正常和低温胁条件下，叶绿素的含量显著高于非转基因型烟草，保持了较高的光能捕获
能力。在低温胁迫条件下，转基因烟草的 PSⅡ最大光化学效率(Fv /Fm)显著高于非转基因型烟草，而且转基
因型烟草的 qP下降缓慢，电子传递效率 ETＲ值也显著高于非转基因型烟草，说明转基因型烟草能够保持较
高的光合电子传递效率，产生较多的同化力以满足暗反应过程的需求。生物量的测定也证明:在持续的低温
胁迫条件下，转基因型烟草鲜重，干重都远高于非转基因型烟草。
转基因烟草的净光合速率对低温处理更敏感，虽然随着低温处理强度增加和时间的延长，转基因烟草的
净光合速率有缓慢增高的趋势，但总体上净光合速率的水平与非转基因型烟草相差不大。那为什么非转基因
型烟草在低温处理期间，净同化产物为负增长，而转基因植物却产生较多的净同化产物呢?在光周期 12 h /12
h处理期间，非转基因型烟草全天的呼吸消耗大于净光合速率，而转基因烟草植株一方面可能由于处理前期
的生长量大，用于光合作用的叶面积较多，另一种方面转基因植物电子传递效率较好，产生的同化力积累较
多，可能在非光照条件下，能够重新利用呼吸作用产生的 CO2用于暗反应中的碳同化。
较高的电子传递效率，能够产生更多的 ATP 和 NADPH，这对于低温条件生长的植物可能是重要的。非
转基因型烟草在低温胁迫下，光化学猝灭系数 qN处在一个较低的水平，Fo 上升，Fv /Fm 下降，有效电子传递
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效率 ETＲ降低，表明 PSⅡ反应中心发生部分失活或伤害，降低了反应中心对激发能的捕获能力和光合电子由
PSⅡ反应中心向质体醌(QA，QB，PQ)库传递。而转基因烟草 Chla /Chlb比值较高，而较高的叶绿素 a /b 也是
高山植物对低温和强光辐射等多变环境的适应［19-20］，Chla /chlb 比值的变化可以反映出两个光系统核心复合
物与外周天线组分对低温的敏感性和损伤程度［28］。同时，转基因烟草还含有较高水平的类胡萝卜素，它与热
能的耗散密切相关，能够帮助植物耗散过多的光能来抵御光造成的损伤［29］。这说明转基因烟草具有较好的
光合保护力，在低温条件下维持较高的线性电子传递能力。
ＲD29A的启动子具有冷诱导的特点，由它驱动的 sikＲbcs2基因在烟草中的表达，在低温条件下，表现出与
组成型表达 sikＲbcs2 基因烟草相似的 Fv /Fm、ETＲ、qP、qN 和净干物积累较多的光合特性，说明 sikＲbcs2 基因
在提高烟草植物的低温光合中起到了重要作用，这种作用是否是由于改变了 Ｒubisco 羧化酶 /加氧酶特性还
不清楚，有待深入研究。
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