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新疆紫草粗提物对MGC-80人胃癌细胞的体外作用研究



全 文 :基金项目:教育部“长江学者和创新团队发展计划”资助(IRT0871);新疆名医名方与特色方剂学实验室开放课题资助(XJDX0910-2010-01)
作者简介:裴凌鹏(1976-),男,医学博士,副研究员,研究方向:民族医药与临床学,E-mail:lppei@hotmail.com。
新疆紫草粗提物对 MGC-80人胃癌细胞的
体外作用研究
裴凌鹏1,田树革2,申刚义1,黄秀兰1,郑玲玲1,白 岩1
(1中央民族大学国家民委-教育部中国少数民族传统医学重点实验室,北京 100081;2新疆医科大学中医学院,乌鲁木齐 830011)
摘要:目的 研究不同浓度的紫草粗提物(SE)对 MGC-80胃癌细胞的作用。方法 荧光显微镜观察细胞形
态的变化;MTT法检测不同浓度SE培养细胞后细胞的存活率;划痕试验检测不同浓度的SE对细胞迁移力的影
响;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果 不同浓度SE可诱导 MGC-80细胞凋亡,不同浓度(0、1、2、3、4、
5mg/mL)SE处理的细胞存活率分别为[24h:(100.00±2.12)、(98.15±6.20)、(97.62±2.16)、(85.11±2.30)、
(72.40±3.52)、(63.17±2.49);48h:(100.00±2.21)、(95.02±1.62)、(92.20±1.70)、(63.18±2.51)、(30.28±
2.17)、(22.19±2.26);72h:(100.00±1.11)、(92.12±2.71)、(92.81±2.33)、(56.30±1.82)、(22.01±1.52)、
(19.85±2.29);96h:(100.00±1.59)、(93.70±2.26)、(91.26±3.17)、(53.72±2.09)、(19.49±2.11)、(13.62±
1.73);120h:(100.00±1.29)、(95.17±1.18)、(92.74±1.98)、(74.05±3.40)、(18.12±3.03)、(8.09±0.78);
140h:(100.00±2.27)、(96.21±2.26)、(93.31±2.12)、(73.45±3.06)、(22.66±1.49)、(12.36±1.25);168h:
(100.00±1.35)、(98.60±2.17)、(96.27±1.80)、(75.30±1.72)、(24.13±1.70)、(11.89±2.12)]且细胞向划痕
区的愈合速度随着SE浓度(0、1、2、3、4、5mg/mL)的增高不断减慢[24h:(35.23±2.01)、(20.17±2.03)、(17.40
±2.01)、(10.31±2.10)、(7.20±1.80)、(4.18±2.08);48h:(55.10±2.12)、(30.21±2.30)、(23.68±1.89)、
(12.01±2.11)、(4.88±2.15)、(1.20±1.79);72h:(64.01±2.43)、(41.02±2.30)、(30.11±2.26)、(19.30±
1.61)、(3.54±1.06)、(0.81±0.60);96h:(73.28±2.71)、(60.11±2.58)、(43.90±2.05)、(18.01±2.12)、(8.71
±1.35)、(0.65±0.71)];当SE的浓度≥3mg/mL时,细胞周期 G1期比例上升(浓度=3mg/mL时,G1为
70.2%、浓度=4mg/mL时,G1为63.9%、浓度=5mg/mL时,G1为80.3%),并伴随S期比例下降(浓度=
3mg/mL时,S为21.0%、浓度=4mg/mL时,S为12.2%、浓度=5mg/mL时,S为13.8%)。结论 紫草SE能
够诱导 MGC-80细胞凋亡及改变细胞周期分布。
关键词:紫草粗提物;MGC-80;细胞凋亡;半数抑制剂量
中图分类号:R966  文献标识码:A  文章编号:1009-5551(2012)04-0483-04
Effects of shikonin extract on MGC-80cel strain
PEI Ling-peng1,TIAN Shu-ge2,SHEN Gang-yi 1,HUANG Xiu-lan1,ZHENG Ling-ling1,BAI Yan1
(1 State Nationalities Affairs Commission and Department of Educational Key Lab of
Minority Traditional Medicine,Minzu University of China,Beijing100081,China;2 College of
Chinese Traditional Medicine,Xinjiang Medicine University,Urumqi 830011,China)
Abstract:Objective To observe the effects of Shikonin extract(SE)with different dosages on the inhibi-
tion action of division of MGC-80cel strain culture.Methods Using the methods of cel culture,MTT,
 第35卷 第4期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.35 NO.4
 2012年4月 Journal of Xinjiang Medical University Apr.2012
FACS,and scratch test to research the effect of SE on cel′s cycle and apoptosis of MGC-80cel strain.Re-
sults The results showed that it can enhance the effects of SE(≥3mg/mL)in increasing G1period(the
content=3mg/mL,G1=70.2%,the content=4mg/mL,G1=63.9%,the content=5mg/mL,G1=
80.3%)and decreasing S period(the content=3mg/mL,S=21.0%,the content=4mg/mL,S=12.2%,
the content=5mg/mL,S=13.8%)of cancer cels remarkably,and decrease the survival proportion of
MGC-80cels under different content of SE[24h:(100.00±2.12),(98.15±6.20),(97.62±2.16),
(85.11±2.30),(72.40±3.52),(63.17±2.49);48h:(100.00±2.21),(95.02±1.62),(92.20±
1.70),(63.18±2.51),(30.28±2.17),(22.19±2.26);72h:(100.00±1.11),(92.12±2.71),(92.81
±2.33),(56.30±1.82),(22.01±1.52),(19.85±2.29);96h:(100.00±1.59),(93.70±2.26),
(91.26±3.17),(53.72±2.09),(19.49±2.11),(13.62±1.73);120h:(100.00±1.29),(95.17±
1.18),(92.74±1.98),(74.05±3.40),(18.12±3.03),(8.09±0.78);140h:(100.00±2.27),(96.21±
2.26),(93.31±2.12),(73.45±3.06),(22.66±1.49),(12.36±1.25);168h:(100.00±1.35),(98.60±
2.17),(96.27±1.80),(75.30±1.72),(24.13±1.70),(11.89±2.12)].Conclusion SE may enhance obvi-
ously the inhibition efects of chemotherapy on MGC-80tumor cel division and inducing apoptosis.
Key words:shikonin extract;MGC-80;cel apoptosis;IC50
    紫 草 为 紫 草 科 植 物 新 疆 紫 草 (Arnebia
euchroma(Royle)Johnst.)或内蒙紫草(Arnebia
guttata Bunge)的干燥根,主要分布于新疆,其具有
凉血活血、解毒透疹等功效[1-2]。传统中医认为,紫
草有凉血、活血、解毒透疹功效,可用于治疗血热毒
盛、麻疹不透、湿疹[3]。现代医学研究发现,紫草具
有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗艾滋病毒、解热、止血、降
血糖等广泛药理作用[4-5]。本实验研究的目的主要
是观察不同浓度的紫草提取物(SE)对人胃癌细胞
MGC-80的作用及毒性,为临床上选择用药剂量的
合理范围提供依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及分组 人胃癌细胞 MGC-80细胞
株(购自协和医科大学细胞中心),用含100g/L小
牛血清的RPM I-1640培养基培养,加入100U/mL
青霉素。100mg/mL链霉素,在37℃、体积分数为
5%的CO2 培养箱培养,取细胞呈对数生长期时进
行实验。按SE的浓度0、1、2、3、4、5mg/mL分为
正常组和不同浓度组。
1.2 方法
1.2.1 凋亡细胞形态观察 不同浓度的SE处理后
24h,磷酸缓冲液漂洗3次;加入体积分数为75%的
冰乙醇固定15min;PBS漂洗3次;细胞重悬于 Ho-
echst 3342荧光染液(5g/mL PBS配制)中,避光染
色15min;PBS漂洗3次,加入少许PBS,荧光显微镜
(紫外激发)观察细胞核的形态。凋亡细胞呈蓝色且
荧光强度增强,核染色质凝集、边缘化。
1.2.2 细胞生长活性检测 调整细胞浓度后,每孔
200μL细胞悬液接种于96孔板中,加入不同浓度
的SE,同时设有空白及阴性对照组,于37℃、体积
分数为5%的CO2 培养箱中培养24h,磷酸缓冲液
(PBS)洗3遍,每孔加入无血清培养液180μL、
MTT(5mg/L,pH 7.4,PBS配制)20μL继续培养
4h后,取出,10 000r/min离心5min,弃上清,每孔
加入DMSO150μL振荡器振荡10min,充分溶解蓝
紫色结晶,用空白孔调零,在酶标仪上用570nm波
长测定各孔的OD值。未受非聚焦超声辐照正常培
养的细胞生长活性为100%,以此为标准换算各组
细胞的存活率,根据7d的数据描绘不同浓度SE作
用后细胞生长曲线。按公式计算:存活率(%)=
(OD实验孔÷OD阴性对照)×100%。
1.2.3 不同浓度的SE对细胞迁移力的影响 将
MGC-80细胞接种于24孔板内培养,在细胞层中纵
向划痕,造成培养细胞缺损区域带,划痕后PBS洗3
次,加入不同浓度的SE继续培养。以此时作为划
痕后零时,镜下观察不同时间段划痕处细胞的覆盖
484 新 疆 医 科 大 学 学 报 第35卷 
情况。随机测量8点垂直于划痕方向的宽度,计算
8点的均值作为实验的初始划痕宽度值。按公式计
算该划痕不同时间点的愈合速率:愈合速率=(初始
划痕宽度值-相应点划痕宽度值)/初始划痕宽度值
×100%。
1.2.4 MGC-80细胞凋亡周期检测 流式细胞仪
(美国Beckman)检测数据由仪器自带软件分析细
胞凋亡率,Multicycle软件分析细胞周期。
1.3 统计学处理 应用SPSS10.0软件 One-way
ANOVA分析SE处理后多个样本存活率均数的多
重比较,分析SE作用的半数抑制剂量(IC50)。多个
样本R×C表资料的χ
2 检验。
2 结果
2.1 凋亡细胞形态观察 不同浓度的SE培养
24h后,可见正常的活细胞呈均匀弥散的蓝色;细胞
核大小、结构比较均匀一致,表明其对正常细胞在0
~5mg/mL剂量范围内没有毒性作用。随着SE浓
度的增加凋亡细胞数量逐渐增多,尤其是4mg/mL
和5mg/mL组较多的细胞呈边界不清,体积缩小,
核固缩,染色质凝集、边缘化,甚至细胞破碎,凋亡小
体形成。
2.2 细胞生长活性检测 与正常组比较,不同浓度
SE处理的不同时间点之间细胞的存活率差异有显
著性 (P<0.01)。随着SE浓度的增加细胞的存活
率明显降低;SE浓度分组和不同时间组之间存在交
互效应 (F=16.15,P<0.01)(表1)。不同时间点
SE致 MGC-80细胞增殖的IC50在24h时最高,为
5.711mg/mL(表2)。
表1 SE不同浓度下不同时间点细胞存活率比较(n=3)
处理时间/h
SE浓度/(mg·mL-1)
0  1  2  3  4  5
F值 P
24  100.00±2.12  98.15±6.20  97.62±2.16  85.11±2.30  72.40±3.52  63.17±2.49  21.52 <0.01
48  100.00±2.21  95.02±1.62  92.20±1.70  63.18±2.51  30.28±2.17  22.19±2.26  130.80 <0.01
72  100.00±1.11  92.12±2.71  92.81±2.33  56.30±1.82  22.01±1.52  19.85±2.29  166.09 <0.01
96  100.00±1.59  93.70±2.26  91.26±3.17  53.72±2.09  19.49±2.11  13.62±1.73  189.13 <0.01
12  100.00±1.29  95.17±1.18  92.74±1.98  74.05±3.40  18.12±3.03  8.09±0.78  554.16 <0.01
140  100.00±2.27  96.21±2.26  93.31±2.12  73.45±3.06  22.66±1.49  12.36±1.25  526.03 <0.01
168  100.00±1.35  98.60±2.17  96.27±1.80  75.30±1.72  24.13±1.70  11.89±2.12  480.58 <0.01
F值 0.000  2.16  4.89  16.15  33.20  26.40 (F=16.15,
P >0.05 >0.05 <0.01 <0.001 <0.001 <0.001 P<0.01)*
  注:*交互效应的F值和P 值,各时间组相比,P<0.05。
表2 SE对细胞的半数抑制剂量
培养时间/h  IC50/(mg·mL-1)
24  5.711
48  4.479
72  3.823
96  3.490
120  3.861
144  3.979
168  3.998
2.3 不同浓度的SE对细胞迁移力的影响 与阴
性对照组比较,在同一时间段随着SE浓度的增高
MGC-80细胞向划痕区的迁移速度不断减慢,96h
时0~4mg/mL组划痕区均出现不同程度的变窄,
而5mg/mL组细胞划痕区反而增宽,镜下可见部
分细胞坏死脱落(表3)。
表3 不同浓度的SE对细胞迁移力的影响(n=8)
处理时间/h
SE浓度/(mg·mL-1)
0  1  2  3  4  5
F值 P
24  35.23±2.01  20.17±2.03  17.40±2.01  10.31±2.10  7.20±1.80  4.18±2.08  62.17 <0.01
48  55.10±2.12  30.21±2.30  23.68±1.89  12.01±2.11  4.88±2.15  1.20±1.79  128.88 <0.01
72  64.01±2.43  41.02±2.30  30.11±2.26  19.30±1.61  3.54±1.06  0.81±0.60  140.38 <0.01
96  73.28±2.71  60.11±2.58  43.90±2.05  18.01±2.12  8.71±1.35  0.65±0.71  158.25 <0.01
F值 361.11  103.47  42.19  23.22  3.18  3.30 (F=38.08,
P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01  P<0.01)*
  注:*交互效应的F值和P 值,各时间组相比,P<0.05。
584 第4期 裴凌鹏等:新疆紫草粗提物对 MGC-80人胃癌细胞的体外作用研究
2.4 细胞周期分布及凋亡率检测 各组细胞周期
的变化差异有统计学意义 (P<0.01),当SE浓度
≥3mg/mL时,G1比例的上升并伴随着S期比例
的下降;同时可见当SE的浓度<3mg/mL时对
MGC-80细胞凋亡率的影响不大,而SE的浓度为
4、5mg/mL 时细胞的凋亡率明显升高,分别为
25.1%和32.3%(表4)。
表4 不同浓度SE作用 MGC-80细胞后24h的流式
细胞检测结果
浓度/mg·mL-1 凋亡率/%
周期/%
G1 G2 S
0  1.6  55.7  11.2  26.1
1  2.2  47.3  9.4  41.3
2  2.9  50.7  8.9  33.4
3  2.7  70.2  6.8  21.0
4  25.1  63.9  20.9  12.2
5  32.3  80.3  5.9  13.8
3 结论
近年来SE已被广泛运用于临床治疗各种疾
病,尤其是对肿瘤的使用,但对于SE的用药剂量安
全说法不一[6-7]。以往抗肿瘤药物的治疗窗口较
窄,药物剂量对正常组织有不同程度的毒性,主要临
床毒副作用为胃肠道的不良反应及对肝脏的毒性
[8]。
紫草作为一种天然植物药,其成分为多种萘醌
类色素,如紫草素、去氧紫草素、消旋乙酰紫草素、
1-甲氧基乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯紫草素、2,3-
二甲基戊烯酰紫草素等,不同临床用药剂量报道说
法不一,安全剂量范围不定[9-10]。
本实结果初步表明:SE对 MGC-80细胞的生
长和愈合抑制作用明显。随着SE浓度的增加细胞
存活率和愈合速度逐渐下降,1、2、3mg/mL组在
SE作用96h时细胞的存活率降至最低,120h细胞
的存活率开始回升;4、5mg/mL组则在SE作用
120h时细胞的存活率降至最低,144h开始回升。
这可能是由于随着时间的延长SE逐渐被受试细胞
所分解外排,从而导致溶液中药物浓度降低,受试细
胞逐渐恢复增殖能力所致。此外用药后24hIC50较
其他时间高,表明该阶段SE对细胞的抑制作用较
弱,毒性较小。进一步分析SE作用24h时细胞周
期及凋亡率的变化,发现当SE浓度≥3mg/mL时
细胞的周期均发生明显的变化,即G1期的比例明
显升高而S期的比例下降。综上所述,新疆紫草提
取物可在体外有效抑制人 MGC-80胃癌细胞的增
殖,并在一定浓度范围内呈现量效关系,但就其抑制
肿瘤的作用机制还需深入研究。
参考文献:
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684 新 疆 医 科 大 学 学 报 第35卷