全 文 ：文章编号:1005-8486(2007)01-0013-03
·论著·
小叶黑柴胡诱导人胃腺癌 MGC-803细胞凋亡的实验研究
胡淑婷1 , 　奥海航2 , 　王英华3 , 　白　洁1
(1.宁夏医学院生理学教研室 ,银川　750004;　2.宁夏医学院附属医院急诊科 , 银川　750004;
3.宁夏回族自治区药品检验所 , 银川　750004)
摘要:目的　研究小叶黑柴胡诱导人胃腺癌 MGC-803细胞的凋亡效应。方法　实验分 6 组 , 对照组(MGC-
803 细胞培养于基础培养基中), 实验 1 ～ 5 组(MGC-803 细胞培养于基础培养基中加小叶黑柴胡的乙醚提取
物 ,小叶黑柴胡终浓度分别为 4 、8 、16、32、64μg/μL/3mL培养液)。计算各组细胞死亡率 、细胞生长抑制率 、克
隆形成率并观察形态学变化 ,应用凝胶电泳 、激光扫描共聚焦显微镜观察分析小叶黑柴胡作用MGC-803细胞
后的细胞 DNA 含量的改变。结果　小叶黑柴胡作用后细胞死亡率 、细胞生长抑制率升高 ,克隆形成率降低 ,
与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);细胞 DNA 含量荧光值测定 , 对照组(2265.92±225.00), 实验组
(1653.60±236.78), 差异有统计学意义(P<0.01)。细胞 DNA凝胶电泳实验组显示清晰的“阶梯状”条带。结
论　小叶黑柴胡可诱导人胃腺癌MGC-803 细胞凋亡。
关键词:小叶黑柴胡;人胃腺癌;MGC-803 细胞;细胞凋亡
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A
收稿日期:2006-09-11
基金项目:宁夏医学院面上科研项目
作者简介:胡淑婷(1973-)女 ,上海人 ,硕士 , 从事生理学教学和科
研工作。
　　柴胡分为北柴胡 、南柴胡以及小叶黑柴胡 ,小叶黑柴胡
也称为黑柴胡 ,具有抗炎 、保肝 、增强免疫的作用[ 1] , 其诱导
癌细胞凋亡的实验研究未见报道。为充分开发利用小叶黑
柴胡的丰富资源 ,拓宽药用范围 , 本实验选择小叶黑柴胡的
乙醚提取物 ,作用于体外培养的人胃腺癌MGC-803 细胞 ,
观察小叶黑柴胡诱导人胃腺癌 MGC-803 细胞(以下简称
MGC-803 细胞)的凋亡效应。
1　材料和方法
1.1　细胞株　人胃腺癌 MGC-803 细胞由北京肿瘤研究
所提供。
1.2 药品与主要试剂
1.2.1　小叶黑柴胡的乙醚提取物:宁夏回族自治区药品检
验所提供 ,用前用 1640 液稀释至所需浓度。
1.2.2　细胞培养基:RPMI 1640 干粉(Life Technologies Inc,
美国)10.4g/L 三蒸水配制 , 15%小牛血清 ,HEPES 5.6g/ L,
NaHCO3 2g/ L, 青霉素 100U/ mL、链霉素 100μg/mL , 抽滤除
菌 ,即完全 1640 液(C-1640), 4℃保存备用。
1.2.3　主要试剂:10% Giemsa染液(上海试剂三厂生产)、
0.02%EDTA、细胞裂解液 、蛋白酶K、RNA酶等(华美公司生
产)。
1.3　仪器　CO2 培养箱 、超净工作台 、 Olympus 倒置光显微
镜 、荧光显微镜 、ACAS575UV 共聚焦激光扫描显微镜(美国
Meriden 公司生产)、紫外透射仪 、高速低温离心机。
1.4　实验方法
1.4.1　细胞培养:取指数生长期 MGC-803 细胞 , 培养于
C-1640液中 , pH7.2 ,置 5%CO2、37℃培养。
1.4.2　分组:实验共分 6 组。对照组:MGC-803 细胞培养
于基础培养基即 C-1640液中;实验 1～ 5 组:MGC-803 细
胞培养于 C-1640 液中 , 24h 后加入小叶黑柴胡的乙醚提取
物 , 终浓度分别为 4、8、16、32、64μg/μL/ 3mL培养液。
1.5　观察指标
1.5.1　量效关系:取指数生长期细胞 , 消化后 5×104/ mL
接种于培养瓶中 , 3mL/瓶 , 24h 后 , 随机分组 ,按上述分组条
件处理后每日每组取 3 瓶 , 计数细胞 ,连续 3d ,绘制细胞生
长曲线 , 观察不同浓度小叶黑柴胡对细胞的抑制作用 , 选择
实验用最佳终浓度。
1.5.2　细胞死亡百分率:在上述实验同时 , 用台盼兰 2∶1
(V/V)染色 ,计数 200 个细胞中死亡的细胞数 , 连续 3d , 计
算各组细胞死亡百分率。
1.5.3　生长抑制百分率:于上述实验 72h , 按下列公式计算
细胞生长抑制百分率。
细胞生长
抑制百分率(%)=对照组细胞数-实验组细胞数对照组细胞数 ×100%
在上述实验结束后 ,选择最佳实验条件进行以下实验
观察。
1.5.4　克隆形成率测定:取指数生长期细胞 , 消化后接种
于 24 孔板中 , 200 个细胞/孔/mL , 培养 24h 后随机分 2 组 ,
对照组同以上条件 , 实验组选择上述实验最佳小叶黑柴胡
浓度 , 12 个孔/组。 接种 10d 后 , 甲醇∶丙酮(1∶1)固定 ,
pH6.8 、10%Giemsa染色后观察。每 40 个细胞为一个克隆 ,
计数 200 个细胞中所形成的克隆数 , 按下列公式求出克隆
形成率(%)[ 2] 。
克隆形成率(%)=形成克隆数接种细胞数×100%
·13·
第 29卷　1期　
2007年 2月
宁夏医学院学报
Journal of Ningxia Medical College
1.5.5　形态学观察指标:
1)倒置显微镜观察:取各组 MGC-803 细胞 , 于倒置显
微镜下观察其形态。
2)荧光显微镜观察:取各组 MGC-803 细胞 , 涂片后即
入95%冷酒精固定 , 1%HAC 酸化后 , 0.01%AO 染色 , 0.1M
CaCl2分化。荧光显微镜 340nm 紫外光下观察照相。
1.5.6　共聚焦激光扫描显微镜观察:取对照组和实验组
MGC-803 细胞 , 涂片后即入 95%冷酒精固定 , 1%HAC 酸
化后 , 0.01%AO 染色 , 0.1M CaCl2 分化。处理后的细胞涂
片置于共聚焦激光扫描显微镜 ,以观察 DNA 荧光强度分布
立体图 ,同时定量测定对照组 、实验组癌细胞的 DNA 含量
荧光值。
1.5.7　细胞 DNA提取及凝胶电泳分析:取各组 MGC-803
细胞 ,细胞数>5×106 , 冷 PBS 洗 2 次 , 加裂解液置冰浴中
裂解 ,再加入蛋白酶 K , 37℃过夜后 , 1∶1 饱和酚/氯仿混匀 ,
10000rpm , 4℃离心 20min , 弃上清液 , 加入 1/10 体积的 3M
NaAc和 2 倍体积的冷纯酒精 ,充分混匀后 10000rpm 4℃离
心 20min , 弃上清液 , 70%冷酒精洗沉淀 2次 , 真空抽干加入
RNAase 37℃5h , 1%琼脂糖 、80V电泳 90min ,紫外线下观察
摄影。
1.6　统计学方法　采用SPSS 11.0软件对结果进行χ2 检验。
2　结果
2.1　细胞生长曲线绘制　对照组细胞 3d 后进入指数增生
期 ,曲线呈快速上升趋势;各实验组细胞的生长受到不同程
度的抑制 , 生长速度减缓 , 曲线呈缓慢上升或下降趋势 , 其
中实验 3组为最佳剂量组 , 见图 1。
2.2　细胞死亡率　MGC-803 细胞经小叶黑柴胡作用后 ,
死亡细胞增多 , 与对照组比较差异有统计学意义(P <
0.01), 见表 1。
2.3　细胞生长抑制率　于实验 72h 后 , 实验组细胞的生长
受到明显抑制 ,实验 4 、5组达 100%,即产生细胞死亡效应 ,
实验 3组抑制达 96.28%,死亡细胞达 83.61%, 与对照组比
较差异均有统计学意义(P<0.01),见表 1。
表 1　实验 72h后小叶黑柴胡各剂量组作用比较
组别 存活细胞数(×104 个/ 3mL)
细胞死亡
率(%)
细胞生长抑制
率(%)
对照组 26.88 4.00 —
实验 1组 10.50 21.52＊ 60.94＊
实验 2组 4.125 45.69＊ 84.65＊
实验 3组 1.00 83.61＊ 96.28＊
实验 4组 0 98.85＊ 100＊
实验 5组 0 98.88＊ 100＊
　与对照组比较＊P<0.01
2.4　细胞克隆形成率　对照组克隆形成率为 2%, 实验 3
组克隆形成率明显降低至 0 , 与对照组比较差异有统计学
意义(P <0.01), 见表 2。
表 2　MGC-803细胞克隆形成率的比较
组别 接种细胞数 形成克隆数 克隆形成率(%)
对照组 200 4 2
实验 3组 200 0 0＊
　与对照组比较＊P<0.01
2.5　形态学观察
2.5.1　倒置光学显微镜下形态学特征:对照组细胞数量
多 , 贴壁生长 ,细胞呈圆形 , 胞质清亮 , 胞核大且清晰可见 ,
呈均质状 , 染色质无凝集;实验组细胞数量减少 ,胞体变小 ,
胞核染色质由均质状态固缩成高凝集的点状结构 , 并可见
凋亡小体。
2.5.2　荧光显微镜下形态学特征:荧光显微镜下可见对照
组细胞密集 , 胞核内 DNA 黄绿色荧光 , 胞质内 RNA 火红色
荧光 , 较多分裂相。实验 3 组癌细胞明显减少 , DNA、RNA
荧光强度减弱 ,多见高凝集的点状结构 ,(图 2、3 , 见封2)。
2.6　诱导癌细胞凋亡的三维重建立体图象　对照组癌细
胞荧光强度分布立体图 ,似一完整彩色分层“蛋糕形” , 顶部
荧光强 , 即相当于癌细胞核中央 , 底部弱 ,即相当于核周边 ,
以右侧颜色标尺示荧光强度变化;实验 3组细胞则显示不
规则“蛋糕形” , 荧光强度变弱。DNA含量荧光值测定对照
组为(2265.92±225.00), 实验组为(1653.60±236.78),差异
有统计学意义(P<0.01),(图4 、5、6、7 , 见封 2)。
2.7　细胞 DNA凝胶电泳分析　对照组细胞 DNA在电泳上
显示分子量很大的一条带。实验 3 组则 DNA降解, 电泳显
示清晰的“阶梯状” ,提示 DNA在核小体连接处断裂 ,见图 8。
1.Marker　2.对照组　3.实验 3组　4.实验 3组
图 8　DNA凝胶电泳图
3　讨论
机体细胞死亡有两种方式 , 即坏死(necrosis)和凋亡
(apoptosis), 二者存在着本质区别。坏死是外界因素造成细
胞急速死亡 ,是一种被动死亡方式;细胞凋亡又称细胞程序
性死亡 ,是自然发生的细胞死亡过程 ,受基因调控 , 在多细
胞动物的发育过程中起重要作用[ 3] 。肿瘤的本质是肿瘤细
胞的增殖与凋亡的失衡 , 诱导细胞凋亡已成为肿瘤治疗的
新模式[ 4] 。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下遵
循自身程序 ,激动内部机制 , 通过激活内源性核酸内切酶引
起 DNA规律降解而引起的细胞死亡。细胞凋亡的形态学
观察是判断细胞凋亡的基本方法之一[ 5] 。凋亡过程中 , 细
胞不断解离成细胞质小块 ,被称为凋亡小体 , 该小体是细胞
凋亡的主要形态学特征之一。分子水平的 DNA凝胶电泳
则可见特征性的 DNA“阶梯状”改变[ 6] 。
胃癌是世界范围内威胁人类健康的一种常见的消化道
·14· 宁夏医学院学报 29 卷
肿瘤 ,是我国主要恶性肿瘤之一。传统的化疗药物治疗方
法由于缺乏靶向性 , 效果并不理想[ 7] 。全国商品柴胡状况
表明商品柴胡主要有北柴胡 、南柴胡和小叶黑柴胡。其化
学成分分析 ,小叶黑柴胡与北柴胡的主要区别为小叶黑柴
胡中木脂素成分的含量较高 ,小叶黑柴胡乙醚提取物中木
脂素占 73%[ 8] ,即其含有甚高的 kaerophyllin 和小叶黑柴胡
素 ,而北柴胡中甚微[ 9] 。木脂素具有抗癌作用[ 10] 。
本实验采用小叶黑柴胡的乙醚提取物 ,选择 5个剂量分
别作用于人胃腺癌 MGC-803 细胞 ,选用的细胞生长曲线 、
细胞死亡率、细胞生长抑制率及细胞克隆形成率等实验指
标, 结果均显示小叶黑柴胡对MGC-803细胞的增殖有抑制
作用 ,且当剂量小于 16μg/μL/ 3mL 培养液时 , 肿瘤细胞仍较
旺盛生长 ,达不到抑制生长并诱导其凋亡的效果 ,当剂量大
于16μg/μL/3mL培养液时 , 细胞死亡率达 98%以上 , 细胞生
长抑制率达 100%, 提示剂量过大时可能会因细胞毒作用 ,杀
死细胞 ,选择剂量为 16μg/μL/ 3mL 培养液 , 生长曲线趋于下
降, 而且细胞死亡率和细胞生长抑制率均低于高剂量组。故
在确定 MGC-803 细胞作用最佳剂量后 ,进一步观察 DNA变
化, 对照组只有大片段DNA ,无梯状带纹 ,而经小叶黑柴胡诱
导后的实验组细胞 ,有较多量的小片段 DNA 形式 ,呈现梯状
带纹外观。因为当细胞凋亡时, 细胞内核酸内切酶被激活 ,
将DNA链的核小体连接点切断, 一个核小体相当于 180 ～
200bp 碱基长度 ,故电泳可见到 DNA 梯状带谱 , 提示小叶黑
柴胡能明显诱导MGC-803细胞凋亡 ,通过此途径达到抗肿
瘤的目的。
参考文献:
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(责任编辑:路锦绣)
A Experimental Study of Bupleurum Smithii Wolff Var
Parvifolium shan et Li on Inducing Apoptosis in
Human Gastric Adenocarcinoma MGC-803 Cells
HU Shu-ting , AO Hai-hang , WANG Ying-hua , et al
(The Physiology Department of Ningxia Medical College , Yinchuan 750004)
Abstract:Objective　To study effects of apoptosis of Bupleurum smithii wolff Var Parvifolium shan et Li on
human gastric adenocarcinoma MGC-803 cells.Methods　Bupleurum smithii wolff Var Parvifolium shan et
Liin different concentration (4 、8 、16 、32 、64μg/μL/3mL culture fluid)was administered to the MGC-803 cells
in 6 groups.The changes of morphology 、death rate 、the inhibition rate of cell growth 、 cloning efficiency were
observed.DNA content of MGC-803 were measured with the laser scanning confocal microtechnic.Results　
Bupleurum smithii wolff Var Parvifolium shan et Li could significantly increase the death rate 、the inhibition rate
of cell growth.The cloning efficiency was reduced significantly(P <0.01).DNA content of MGC-803 in ex-
perimental group was significantly higher than that in controls.DNA gel eletrophoresis showed that a clear DNA
ladder could be observed in experimental groups.Conclusion　Bupleurum smithii wolff Var Parvifolium shan et
Li could induce apoptosis in human gastric adenocarcinoma MGC-803 cells.
Key words:bupleurum smithii wolff Var Parvifolium shan et Li;human gastric adenocarcinoma;MGC-803
cells;apoptpsis
·15·1 期 胡淑婷 ,等.小叶黑柴胡诱导人胃腺癌 MGC-803 细胞凋亡的实验研究