全 文 ：书ｄｏｉ：１０．３９７１／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－８５７８．２０１３．０９．００１ ·基础研究·
收稿日期：２０１３－０１－０３；修回日期：２０１３－０６－１８
基金项目：国 家 自 然 科 学 基 金 地 区 基 金 资 助 项 目
（８１０６０３６９）；青海省应用基础研究项目资助课题（２０１０－Ｚ－
７２２）
作者单位：１．８１０００１西宁，青海大学医学院病理学教研
室；２．黄石市第二医院功能科
作者简介：王刚（１９６６－），男，博士，副教授，主要从事肿
瘤病理学研究
雪灵芝水提物对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞增殖
及细胞周期的影响
王　刚１，张　华１，杨歆睿２，王海燕１，贺菊香１，吉利宾１
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａｒｅｎａｒｉａ　Ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｎ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ
Ｇａｓｔｒｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌ　Ｌｉｎｅ　ＭＧＣ－８０３
ＷＡＮＧ　Ｇａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ　Ｈｕａ１，ＹＡＮＧ　Ｘｉｎｒｕｉ　２，ＷＡＮＧ　Ｈａｉｙａｎ１，ＨＥ　Ｊｕｘｉａｎｇ１，ＪＩ　Ｌｉｂｉｎ１
１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｉｎｇ８１０００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅ－
ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　 Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ（ＡＫＡＥ）ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆ－
ｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ＭＧＣ－８０３．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ
ｗｉｔｈ　ＡＫＡＥ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ
ＭＴＴ　ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍＲ－
ＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１，ｐ１６ａｎｄ　ｐ２１ｉｎ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎｄ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ
ＰＣＲ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ＡＫＡＥ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ＩＣ５０ ｗａｓ（０．１３４±０．００５）ｍｇ／ｍｌ．Ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
ＡＫＡＥ　ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　０．８ｍｇ／ｍｌ　ｆｏｒ　１２ｈ，ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　Ｇ１ｐｈａｓｅ　ｉｎ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ
ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｉｎ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ
ｏｆ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１ｉｎ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｂｌｏｃｋｅｄ　ｂｙ　ＡＫＡＥ　ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ（０．２－０．８）ｍｇ／ｍｌ（Ｐ＜
０．０５）．ＡＫＡＥ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｃｏｕｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐ１６ａｎｄ　ｐ２１ｉｎ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ．Ｃｏｍ－
ｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　ｐ１６ａｎｄ　ｐ２１ｍＲＮＡ　ｉｎ　０．２ｍｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ
２．３０ａｎｄ　１７．５ｔｉｍｅｓ　ｈｉｇｈｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＡＫＡＥ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３
ｃｅｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｉｓ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｇ１－ｐｈａｓｅ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｇ１－ｐｈａｓｅ
ｒｅｌａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ；ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ；Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ
摘　要：目的　探讨雪灵芝水溶性提取物（ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ，ＡＫＡＥ）对人胃癌细胞株
ＭＧＣ－８０３细胞增殖及细胞周期的影响。方法　体外培养的 ＭＧＣ－８０３细胞经不同浓度 ＡＫＡＥ处理，采
用 ＭＴＴ法检测受试细胞增殖水平；应用流式细胞术检测 ＡＫＡＥ处理１２ｈ后各组细胞的细胞周期；
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测不同浓度、不同时间ＡＫＡＥ处理组 ＭＧＣ－８０３细胞中ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１蛋白表达水平；实时定
量ＰＣＲ检测各组 ＭＧＣ－８０３细胞中ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ｐ１６和ｐ２１基因的ｍＲＮＡ相对表达量。结果　ＡＫＡＥ对
体外培养的 ＭＧＣ－８０３细胞增殖具有浓度依赖性抑制作用（Ｐ＜０．０５），ＩＣ５０为（０．１３４±０．００５）ｍｇ／ｍｌ；经
ＡＫＡＥ处理１２ｈ，０．８ｍｇ／ｍｌ组 ＭＧＣ－８０３细胞的 Ｇ１期细胞比例高于对照组、Ｓ期细胞比例低于对照组
（Ｐ＜０．０５）；（０．２～０．８）ｍｇ／ｍｌ浓度的ＡＫＡＥ处理，对 ＭＧＣ－８０３细胞中ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１的蛋白及 ｍＲＮＡ表
达具有明显抑制作用（Ｐ＜０．０５）；ＡＫＡＥ促进 ＭＧＣ－８０３细胞中ｐ１６、ｐ２１基因 ｍＲＮＡ 表达，０．２ｍｇ／ｍｌ
处理组ｐ１６、ｐ２１ｍＲＮＡ相对表达量分别为对照组的３．３倍和１８．５倍。结论　雪灵芝水提物（ＡＫＡＥ）对
ＭＧＣ－８０３细胞增殖具有抑制作用，其机制与Ｇ１期阻滞和对Ｇ１期相关因子表达的影响有关。
关键词：雪灵芝；ＭＧＣ－８０３细胞；增殖；细胞周期
中图分类号：Ｒ７３５．２　　文献标识码：Ａ
０　引言
雪灵芝（ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ）是生长于海拔
４　０００米以上高山草甸及砾石中的石竹科蚤缀属草
本植物，藏医典籍记载其具有 “治疗胃肠溃疡、膨
胀、癌症、瘰疬及健胃助消”的功效［１］。近年来，国内
研究者对雪灵芝抗炎、抗氧化、促消化及肝脏保护等
·１２８·肿瘤防治研究２０１３年第４０卷第９期
药理作用进行了研究报道［２－６］。赵鹏等［７］进行的雪
灵芝提取物体内抗肿瘤研究显示，雪灵芝对二乙基
亚硝胺诱发的大鼠肝癌具有预防和抑制作用，雪灵
芝可显著提高受试大鼠存活率和体重。本实验前期
初步研究显示，雪灵芝提取物对体外培养的人胃癌
细胞株ＢＧＣ８２３和人肝癌细胞株Ｓｍｍｃ７７２１具有增
殖抑制作用，而对正常组织来源细胞（人羊膜 ＷＩＳＨ
细胞、人肝细胞株 ＨＬ７７０２）的增殖不仅无抑制，而
且具有一定的促进作用。为探索雪灵芝对胃癌细胞
的增殖抑制效应与机制，本研究通过体外途径，观察
雪灵芝水提物 （ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘ－
ｔｒａｃｔ，ＡＫＡＥ）对人胃癌细胞株 ＭＧＣ－８０３的增殖水
平、细胞周期及其相关因子表达水平的影响，为进一
步开展相关研究打下基础。
１　材料和方法
１．１　材料
人胃癌细胞株 ＭＧＣ－８０３购于中国科学院上海
细胞库；雪灵芝水提物冻干粉剂由本实验室制备，用
ＰＢＳ溶解，浓度１ｍｇ／ｍｌ；四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）、
胰蛋白酶、ＲＰＭＩ１６４０培养液均购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎
牛血清购自 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购
自Ｓｉｇｍａ公司；鼠抗人ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１单克隆抗体购于
Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司；辣根酶标记山羊抗小鼠ＩｇＧ 购于
北京中杉金桥生物技术有限公司；碘化丙啶（ＰＩ）、蛋
白裂解液、ＢＣＡ蛋白浓度试剂盒、ＥＣＬ化学发光试
剂盒均购自碧云天生物技术研究所；Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎ－
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＡＭＶ反转录酶、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶购
自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ 试剂盒购自
ＱＩＡＧＥＮ公司；流式细胞仪（ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ公
司）；荧光定量ＰＣＲ仪（ＦＱＤ－４８Ａ型，杭州博日科技
有限公司）；酶标仪（Ｒａｙｔｏ　ＲＴ－６０００型，深圳雷杜生
命科学股份有限公司）。
１．２　方法
１．２．１　ＭＴＴ法检测 ＡＫＡＥ对人胃癌细胞 ＭＧＣ－
８０３增殖的影响　取对数生长期 ＭＧＣ－８０３细胞，用
含１０％小牛血清的培养液配成２×１０４／ｍｌ的细胞
悬液，按１００微升／孔接种于９６孔培养板。培养
２４ｈ后，各处理组细胞分别加入含不同浓度 ＡＫＡＥ
的培养液（１００微升／孔），以０ｍｇ／ｍｌ组为对照组，
加入等体积培养液。每组设５个复孔，分别于药物
作用２４、４８及７２ｈ时终止培养，加入 ＭＴＴ溶液（５
ｍｇ／ｍｌ）２０μｌ，孵育４ｈ后吸弃上清液，加入ＤＭＳＯ
溶液（５ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ，振荡溶解１０ｍｉｎ，酶标仪
４９０ｎｍ波长处测吸光度（Ａ）值。细胞增殖抑制率
（％）＝（１－实验孔Ａ值／对照孔Ａ值）×１００％。
１．２．２　流式细胞仪检测 ＡＫＡＥ对人胃癌 ＭＧＣ－
８０３细胞周期的影响　ＭＧＣ－８０３细胞经不同浓度
ＡＫＡＥ处理１２ｈ，收集细胞，ＰＢＳ洗涤２次，以７０％
冷乙醇置４℃固定保存；上机检测前离心沉淀细胞，
ＰＢＳ洗涤２次后调整细胞密度至１×１０４ｃｅｌｓ／ｍｌ，
加入含ＲＮａｓｅＡ的５０×ＰＩ染色液，４℃避光染色３０
ｍｉｎ，流式细胞仪（激发波长４８８ｎｍ）测定荧光强度，
以 Ｍｏｄｆｉｔ软件进行细胞周期分析。
１．２．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１蛋白表达　人
胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞经不同浓度 ＡＫＡＥ处理８、２４
和４８ｈ，预冷ＰＢＳ漂洗细胞，置冰上加入细胞裂解
液，裂解２０ｍｉｎ，收集上清液。ＢＣＡ蛋白浓度试剂
盒测蛋白质浓度。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳后，转移
样品至硝酸纤维素膜，经５％脱脂奶粉（ＴＢＳ－Ｔ配
制）４℃封闭过夜，加入１∶２００稀释的鼠抗人ｃｙｃｌｉｎ
Ｄ１单抗（一抗），４℃孵育过夜。ＴＢＳ漂洗后加入
１∶１０００稀释的辣根酶标记山羊抗小鼠ＩｇＧ（二抗），
室温孵育１ｈ，ＴＢＳ漂洗后滴加ＥＣＬ化学发光液，
暗室内曝光Ｘ胶片。
１．２．４　ＲＴ－ＰＣＲ及荧光定量ＰＣＲ检测ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、
ｐ１６和ｐ２１基因 ｍＲＮＡ的表达　ＭＧＣ－８０３细胞经
不同浓度ＡＫＡＥ处理６ｈ，Ｔｒｉｚｏｌ法抽提总ＲＮＡ，
合成ｃＤＮＡ第一链；引物序列：ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１（上游５′－
ＧＡＡＣＡＧＡＡＧＴＧＣＧＡＧＧ－３′，下 游 ５′－ＧＣＧＧ－
ＴＡＧＴＡＧＧＡＣＡ－３′）；ｐ１６ （上 游 ５′－ＡＣＧＣＡＣ－
ＣＧＡＡＴＡＧＴＴＡ－３′，下 游 ５′－ＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣ－
ＣＴＣＴ－３′）；ｐ２１ （上 游 ５′－ＣＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧ－
ＧＡＡＣＴ－３′，下 游 ５′－ＡＡＴＣＴＧＴＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣ－
３′）；配制２５μｌ　ＰＣＲ反应体系：ｄｄＨ２Ｏ　１５．５μｌ，１０
×ＰＣＲ缓冲２．５μｌ，ｄＮＴＰ混合液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２
μｌ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１．５μｌ，Ｔａｑ酶（５ｕ／μｌ）０．５
μｌ，ｃＤＮＡ　１．０μｌ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１．０
μｌ；ＰＣＲ 反应条件：９４℃变性５ｍｉｎ，９４℃ ３０ｓ，
５５℃４５ｓ，７２℃４５ｓ扩增３３个循环，７２℃延伸５
ｍｉｎ。扩增产物进行２％琼脂糖凝胶电泳；２０μｌ荧
光定量 ＰＣＲ 体系：ｄｄＨ２Ｏ　７μｌ，２×ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ
ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ预混液１０μｌ，ｃＤＮＡ　１μｌ，上、下
游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１．０μｌ。扩增条件：９５℃变性
５ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，６０℃４５ｓ（测荧光１次）进行４０
个循环；之后从６０℃至９５℃，以０．２℃台阶升温，进
行熔解曲线分析。各组样品设３复孔，以管家基因
Ｇ３ＰＤＨ为内参照，以０ｍｇ／ｍｌ组为标准对照比较，
计算ΔＣｔ值及ΔΔＣｔ值：ΔＣｔ＝Ｃｔ（目的基因）－Ｃｔ
（管家基因）、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ（处理组）－ΔＣｔ（对照组），
以ΔΔＣｔ均值进行组间比较，以２－ΔΔＣｔ表示基因
ｍＲＮＡ相对表达量。
·２２８· 肿瘤防治研究２０１３年第４０卷第９期
１．３　统计学方法
　　采用ＳＰＳＳ　１９．０软件进行统计学处理，多组间
均数比较采用单因素方差分析，以Ｓｃｈｅｆｆｅ法进行
显著性检验，检验水准为α＝０．０５。
２　结果
２．１　ＡＫＡＥ对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞增殖的影响
在相同作用时间下，各 ＡＫＡＥ处理组人胃癌
ＭＧＣ－８０３细胞增殖抑制率呈浓度依赖性升高（Ｐ＜
０．０５），半数抑制浓度（ＩＣ５０）＝（０．１３４±０．００５）
ｍｇ／ｍｌ；而比较相同 ＡＫＡＥ浓度组、不同作用时间
下的 ＭＧＣ－８０３细胞增殖抑制率，差异无统计学意
义（Ｐ＞０．０５），见图１。
２．２　ＡＫＡＥ对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞周期的影响
经不同浓度 ＡＫＡＥ处理１２ｈ，人胃癌细胞株
ＭＧＣ－８０３细胞周期中Ｇ１期细胞比例随ＡＫＡＥ浓度
增加而呈逐渐上升的趋势，０．８ｍｇ／ｍｌ组Ｇ１期细胞比
例明显高于０ｍｇ／ｍｌ组Ｇ１期细胞比例（Ｐ＜０．０５）；而
细胞周期中Ｓ期细胞比例随ＡＫＡＥ浓度增加而呈逐
渐下降的趋势，０．８ｍｇ／ｍｌ组Ｓ期细胞比率明显低于
０ｍｇ／ｍｌ组Ｓ期细胞比例 （Ｐ＜０．０５），见图２、表１。
ＡＫＡＥ：ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ；▲，◆，★：Ｐ＜
０．０５，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　０ｍｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ
图１　雪灵芝水溶性提取物对 ＭＧＣ－８０３细胞增殖的影响
Ｆｉｇｕｒｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＡＫＡＥ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＧＣ－
８０３ｃｅｌｓ
２．３　ＡＫＡＥ对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１蛋
白表达的影响
经ＡＫＡＥ作用８ｈ，不同浓度ＡＫＡＥ组 ＭＧＣ－
８０３细胞中ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１蛋白表达水平接近；经ＡＫＡＥ
作用２４与４８ｈ，不同浓度处理组 ＭＧＣ－８０３细胞中
ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１蛋白表达水平呈浓度－时间依赖性下降，
见图３。
表１　不同浓度雪灵芝水溶性提取物对 ＭＧＣ－８０３细胞周期
的影响（％，ｎ＝３）
Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＡＫＡＥ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－
ｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ（％，ｎ＝３）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｇ／ｍｌ）
Ｇ１ Ｓ　 Ｇ２
０　 ４９．２２±４．８７　 ３５．５５±２．１３　 １５．２３±１．５６
０．２　 ４９．３５±５．４６　 ３５．０６±２．０６　 １５．５８±０．８７
０．４　 ４９．８１±３．８９　 ３３．４０±３．０７　 １６．７９±２．０９
０．８　 ５４．５９±４．４３★ ３０．５４±２．８５★ １４．８６±１．４１
Ｎｏｔｅ：★：Ｐ＜０．０５，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　０ｍｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ
图３　雪灵芝水溶性提取物对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞ｃｙｃ－
ｌｉｎ　Ｄ１蛋白表达的影响
Ｆｉｇｕｒｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＡＫＡＥ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　ｉｎ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ
２．４　ＡＫＡＥ对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、
ｐ１６和ｐ２１ｍＲＮＡ表达的影响
ＭＧＣ－８０３细胞经ＡＫＡＥ作用６ｈ，Ｔｒｉｚｏｌ法抽
提总ＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ扩增出４７７ｂｐ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１条带、
３１１ｂｐ　ｐ１６条带及３１３ｂｐ　ｐ２１条带。ＳＹＢＲ荧光定
量ＰＣＲ检测结果显示，在０ｍｇ／ｍｌ（对照）组、０．１、
０．２及０．４ｍｇ／ｍｌ处理组中，ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１基因 ｍＲＮＡ
相对表达量分别为１、０．６３、０．４５和０．２６，ｐ１６基因
ｍＲＮＡ相对表达量分别为１、１．７９、３．３０和１．４０，
ｐ　２１基因ｍＲＮＡ相对表达量分别为１、１０．５６、１８．５
Ａ：０ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ；Ｂ：０．２ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ；Ｃ：０．４ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ；Ｄ：０．８ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ
图２　不同浓度雪灵芝水溶性提取物对 ＭＧＣ－８０３细胞周期的影响
Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＡＫＡＥ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ
·３２８·肿瘤防治研究２０１３年第４０卷第９期
＊：Ｐ＜０．０５，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　０ｍｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ；Ａ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１；Ｂ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐ１６；
Ｃ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐ２１
图４　雪灵芝水溶性提取物对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ｐ１６和ｐ２１ｍＲＮＡ表达的影响
Ｆｉｇｕｒｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＡＫＡＥ　ｏｎ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１，ｐ１６ａｎｄ　ｐ２１ｉｎ　ＭＧＣ－８０３ｃｅｌｓ
和８．２６。上述三种扩增产物熔解曲线峰值单一，表
明无非特异性ＤＮＡ扩增产物，见图４。
３　讨论
雪灵芝在藏族民间又称“阿仲尕保”，是青藏高原
特有的野生藏药药材，根据近年来相关植化研究报
道，雪灵芝含有皂甙、多糖、黄酮、生物碱及环肽等潜
在的抗肿瘤成分［８－９］。雪灵芝对肝癌细胞增殖影响方
面的药理研究，也见诸于报道［１０］。本研究采用 ＭＴＴ
法检测细胞增殖水平，结果显示，在０．１～０．８ｍｇ／ｍｌ
·４２８· 肿瘤防治研究２０１３年第４０卷第９期
浓度范围，ＡＫＡＥ对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞增殖具有
明显的浓度依赖性抑制作用，药物浓度梯度与抑制率
之间呈良好的线性关系；比较相同ＡＫＡＥ浓度、不同
作用时间下的 ＭＧＣ－８０３细胞增殖抑制率，结果显示
差异无统计学意义，提示ＡＫＡＥ对 ＭＧＣ－８０３细胞增
殖的影响不具有时间依赖性。
国内外研究表明，细胞周期调控紊乱是导致肿
瘤细胞失控性增殖的主要因素。对肿瘤细胞的细胞
周期进行干预，是抗肿瘤药物实现抑制肿瘤细胞增
殖效应的途径之一。本研究通过流式细胞术检测细
胞周期的结果显示，经不同浓度 ＡＫＡＥ作用１２ｈ，
ＭＧＣ－８０３细胞的细胞周期构成比例出现变化，０．８
ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ处理组 Ｇ１期细胞比例较对照组 Ｇ１
期细胞比例升高，而０．８ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ处理组Ｓ期
细胞比例低于对照组Ｓ期细胞比例，Ｇ２期细胞比例
也略有下降，提示ＡＫＡＥ对 ＭＧＣ－８０３细胞增殖具
有一定的Ｇ１期阻滞作用。
细胞增殖过程中，细胞从Ｇ１期进入Ｓ期是细胞
分裂的关键环节。细胞周期素Ｄ１（ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１）、ｐ１６
蛋白及ｐ２１蛋白是Ｇ１期重要的调控因子［１１－１２］。ｃｙ－
ｃｌｉｎ　Ｄ１作为Ｇ１期重要的正性调控因子，可与ＣＤＫ４
或ＣＤＫ６结合并激活后者，继而使Ｒｂ蛋白磷酸化
而释放出转录因子Ｅ２Ｆ，从而启动Ｓ期ＤＮＡ复制，
促使细胞从Ｇ１期进入Ｓ期；ｐ１６蛋白是Ｇ１期负性调
节因子，它通过抑制ＣＤＫ４的活性，阻止细胞进入Ｓ
期，ｐ１６蛋白表达降低或表达缺失可导致细胞发生
恶性增殖。此外，ｐ２１蛋白是近年来发现的细胞周
期蛋白依靠性激酶抑制物家族成员，它与ｐ５３蛋白
共同构成细胞周期Ｇ１检查点，当细胞ＤＮＡ受损并
未经修复情况下，则不能通过此检查点。因此，细胞
内保持一定水平的ｐ２１蛋白对防止ＤＮＡ受损细胞
进入增殖周期具有重要意义。本研究显示，ＡＫＡＥ
对人胃癌 ＭＧＣ－８０３细胞中ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１的蛋白及
ｍＲＮＡ表达均有明显抑制作用：经蛋白印迹检测，
０．４～０．８ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ处理对 ＭＧＣ－８０３细胞中
ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１的蛋白表达具有浓度－时间依赖性抑制作
用；实时定量ＰＣＲ结果显示，０．４ｍｇ／ｍｌ　ＡＫＡＥ处
理组 ＭＧＣ－８０３细胞的ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１ｍＲＮＡ相对表达
量仅为对照组ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１ｍＲＮＡ表达量的２６％ 。
此外，实时定量ＰＣＲ检测结果还显示，ＡＫＡＥ可促
进 ＭＧＣ－８０３细胞中ｐ１６及ｐ２１基因的 ｍＲＮＡ表
达。经ＡＫＡＥ作用６ｈ，０．２ｍｇ／ｍｌ浓度组人胃癌
ＭＧＣ－８０３细胞的ｐ１６与ｐ２１的ｍＲＮＡ相对表达量
分别为对照组表达量的３．３倍和１８．５倍。以上结果
提示，ＡＫＡＥ通过降低ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１的表达水平而抑
制其Ｇ１期正性调控作用，同时通过促进ｐ１６与ｐ２１
蛋白的表达而增强它们的Ｇ１期负性调节作用。对
上述Ｇ１期相关的正性、负性调节因子表达水平同时
发挥干预效应，可能是 ＡＫＡＥ对人胃癌 ＭＧＣ－８０３
细胞发挥Ｇ１期阻滞、影响 ＭＧＣ－８０３细胞增殖的分
子机制之一。
参考文献：
［１］　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅａｕ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｔｉｂｅｔａｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｍ］．Ｘｉ′ｎｉｎｇ：Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｐｅｏｐｌｅ′ｓ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｈｏｕｓｅ，１９９１：４４９．［中国科学院西北高原生物研
究所．藏药志［Ｍ］．西宁：青海人民出版社，１９９１：４４９．］
［２］　Ｐｅｎｇ　ＢＺ，Ｆｅｎｇ　ＷＬ，Ｗａｎｇ　ＬＹ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔｉｂｅｔａｎ　ｄｒｕｇ
Ａｒｅｎａｖｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　Ｍａｘｉｍ．ｖａｒ．ｏｖａｔｉｐｅｔａｌａ　Ｔｓｕｉ　ｏｎ　ｉｎｆｌａｍ－
ｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｈｏｎｇ　Ｙａｏ
Ｚａ　Ｚｈｉ，１９９１，１６（６）：３６３－６，３８３．［彭宝珠，冯伟力，王利彦，
等．藏药雪灵芝对炎症和免疫功能的影响［Ｊ］．中国中药杂
志，１９９１，１６（６）：３６３－６，３８３．］
［３］　Ｆｕ　Ｘ，Ｃｈｅｎ　Ｗ，Ｄｕａｎ　ＸＱ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ａｎｄ
ａｎｔｉｌｉｐｏｐｅｒｏｘｉｄａｎｔ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ｅｘｔｒａｃｔｓ
［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｈｏｎｇ　Ｙｉ　Ｙａｏ　Ｘｉｎ　Ｘｉ　Ｚａ　Ｚｈｉ，２０１０，１７（７）：３５－
６．［付翔，陈薇，段小群，等．雪灵芝提取物清除羟自由基和抑
制脂质过氧化作用［Ｊ］．中国中医药信息杂志，２０１０，１７（７）：
３５－６．］
［４］　Ｚｈａｎｇ　Ｌ，Ｌｉ　Ｘ，Ｈｕａｎｇ　ＹＭ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｅｓ　ｏｆ　Ｘｕｅｌｉｎｇｚｈｉ
（ｈｅｒｂ　ａｒｅｎａｒｉａｅ）ｏｎ　ｂｒａｉｎ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｉ－
ｃｈｕａｎ　Ｓｈｉ　Ｆａｎ　Ｄａ　Ｘｕｅ　Ｘｕｅ　Ｂａｏ（Ｚｉ　Ｒａｎ　Ｋｅ　Ｘｕｅ　Ｂａｎ），２００７，３０
（３）：３９５－７．［张丽，黎霞，黄叶梅．雪灵芝对大鼠脑缺血再灌
注损伤的保护作用［Ｊ］．四川师范大学学报（自然科学版），
２００７，３０（３）：３９５－７．］
［５］　Ｔａｎｇ　ＱＮ，Ｆｅｎｇ　Ｍ，Ｇｏｎｇ　ＳＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ
ｆｒｏｍ　Ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＨＢｓＡｇ　ａｎｄ　ＨＢｅＡｇ
ｉｎ　ＨｅｐＧ２．２．１５ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇ　Ｙａｏ　Ｃａｉ，２００８，３１（８）：１２１２－
６．［唐庆年，冯梅，龚受基，等．雪灵芝提取物对ＨｅｐＧ２．２．１５
细胞株 ＨＢｓＡｇ与 ＨＢｅＡｇ表达的影响［Ｊ］．中药材，２００８，３１
（８）：１２１２－６．］
［６］　Ｙａｏ　ＳＹ，Ｚｈａｏ　Ｐ，Ｌｉｕ　ＲＺ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ
Ｔｉｂｅｔａｎ　Ａ．ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ
Ｙｉｎｇ　Ｙｏｎｇ　Ｓｈｅｎｇ　Ｌｉ　Ｘｕｅ　Ｚａ　Ｚｈｉ，２００７，２３（３）：３３２－３，３６４．［姚
思宇，赵鹏，刘荣珍，等．西藏雪灵芝促进消化作用实验研究
［Ｊ］．中国应用生理学杂志，２００７，２３（３）：３３２－３，３６４．］
［７］　Ｚｈａｏ　Ｐ，Ｙａｏ　ＳＹ，Ｗａｎｇ　ＹＷ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａ．ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ
ｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ
［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｕ　Ｚｈｉ　Ｇｏｎｇ　Ｃｈｅｎｇ　Ｙａｎ　Ｊｉｕ　Ｙｕ　Ｌｉｎ　Ｃｈｕａｎｇ
Ｋａｎｇ　Ｆｕ，２００７，１１（３８）：７５５３－５．［赵鹏，姚思宇，王彦武，等．
雪灵芝对二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌组织细胞的抑制作用
［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（３８）：７５５３－５．］
［８］　Ｃｈｅｎｇ　Ｌ，Ｗｕ　ＸＸ，Ｈｕａｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ
Ａｒｅｎａｒｉａ　Ｌ．ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇ　Ｃａｏ　Ｙａｏ，２００４，３５（９）：１０７６－９．
［成丽，伍贤学，黄浩，等．蚤缀属植物中的三萜皂苷化学成分
［Ｊ］．中草药，２００４，３５（９）：１０７６－９．］
［９］　Ｌｅｉ　Ｎ，Ｄｕ　ＳＳ，Ｌｉ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｔｉｂｅｔａｎ
ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓⅠ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｈｏｎｇ　Ｙａｏ　Ｚａ
Ｚｈｉ，２００７，３２（１０）：９１８－２０．［雷宁，杜树山，李林，等．藏药甘
肃蚤缀的化学成分研究Ⅰ［Ｊ］．中国中药杂志，２００７，３２（１０）：
９１８－２０．
［１０］Ｌｉｕ　ＸＸ，Ｗａｎ　ＺＪ，Ｄｅｎｇ　ＸＢ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　Ａｒｅｎａｒｉａ　ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ　ｍａｘｉｍ［Ｊ］．Ｙｉｎｇ
Ｙｏｎｇ　Ｙｕ　Ｈｕａｎ　Ｊｉｎｇ　Ｓｈｅｎｇ　Ｗｕ　Ｘｕｅ　Ｂａｏ，２０１０，１６（５）：６４２－５．
［刘笑笑，万振江，邓小波，等．雪灵芝不同提取物的生物活性
［Ｊ］．应用与环境生物学报，２０１０，１６（５）：６４２－５．］
［１１］Ｆｅａｋｉｎｓ　ＲＭ，Ｎｉｃｋｏｌｓ　ＣＤ，Ｂｉｄｄ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌ　ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐＲｂ，ｐ１６，ａｎｄ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ
ｉｔｓ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａ－
ｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｐａｔｈｏｌ，２００３，３４（１２）：１２７６－８２．
［１２］Ｓｈｉｏｚａｋｉ　Ａ，Ｏｔｓｕｊｉ　Ｅ，Ｍａｒｕｎａｋａ　Ｙ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｒｅｇ－
ｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　Ｇ（１）／Ｓ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ
［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ　Ｏｎｃｏｌ，２０１１，３（８）：１１９－２２．
［编辑：周永红；校对：刘红武］
·５２８·肿瘤防治研究２０１３年第４０卷第９期