全 文 ：第 35 卷 第 2 期 青 海 医 学 院 学 报 Vol． 35 No． 2
2014 年 JOUＲNAL OF QINGHAI MEDICAL COLLEGE 2014
* :国家自然科学基金地区基金资助项目(81060369)) ;青海省应用基础研究项目资助课题(2010 － Z － 722)
吉立宾(1985 ～) ，男，汉族，河北籍，青海大学医学院 2011级病理与病理生理学专业研究生．△:通讯作者，Tel:13519706280，E － mail:wang-
gang@163． com
雪灵芝水提取物对人胃腺癌 MGC － 803 细胞
Bcl － 2，Bax基因表达的影响*
吉立宾，王 刚△，杨歆睿，王海燕
(青海大学医学院)
摘 要 目的 研究雪灵芝水提取物对人胃腺癌 MGC － 803 细胞 Bcl － 2 和 Bax 基因表达的
影响。方法 不同浓度的雪灵芝水提取物处理体外培养的 MGC － 803 细胞，采用四甲基偶氮噻唑
蓝( MTT) 法检测细胞存活水平; 应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡水平;采用逆转录聚合
酶链反应( ＲT － PCＲ) 和蛋白印迹法( Western Blot) 测定人胃腺癌 MGC － 803 细胞的 Bcl － 2 和 Bax
基因表达情况。结果 雪灵芝水提取物作用于人胃腺癌 MGC － 803 细胞后，0． 1 ～ 0． 8 mg /mL浓度
组细胞存活水平随药物浓度的增大而减小( P ＜ 0． 05) ; 0． 8 mg /mL浓度组 MGC － 803 细胞 G1 期比
例为( 61． 23 ± 6． 45) %、S期细胞比例为( 26． 86 ± 3． 38) %、细胞凋亡率为( 0． 07 ± 0． 01) %，与对照
组相比，P ＜ 0． 05;与对照组相比，0． 8 mg /mL浓度组 Bcl － 2 mＲNA表达降低、Bax mＲNA表达增加
( P ＜ 0． 05) ; 0． 2 ～ 0． 8 mg /mL浓度组 Bcl － 2 蛋白表达降低、Bax 蛋白表达增加。结论 雪灵芝水
提取物在一定浓度范围内可降低 MGC －803 细胞的存活水平，使细胞发生凋亡，其机制可能为通过
下调 Bcl － 2 基因、上调 Bax基因表达，促进细胞凋亡发生。
关键词 雪灵芝 肿瘤 MGC －803 Bcl － 2 Bax
中图分类号 Ｒ735． 2 文献标识码 A
DIO:10． 13452 / j． cnki． jqmc． 2014． 02． 009
INFLUENCE OF AＲENAＲIA KANSUENSIS AQUEOUS EXTＲACT
ON EXPＲESSIONS OF BCL － 2 AND BAX GENE IN
HUMAN STOMACH CAＲCINOMA CELL LINE MGC － 803
Ji Libin，Wang Gang，Yang Xinrui，Wang Haiyan
(Medical college of Qinghai University)
Abstract Objective To study the effect of Arenaria Kansuensis Aqueous Extract (AKAE)on the expressions
of Bcl － 2 and Bax gene in human gastric cancer cell line MGC － 803． Methods MGC － 803 cells were incubated
with AKAE at different concentration ，cellular survival level was tested by MTT ;Cell cycle and apoptosis were de-
tected by flow cytometer (FCM);ＲT － PCＲ and Western Blot were used to detect the gene expression level of the
Bcl － 2 and Bax． Ｒesults After treatment with AKAE，MGC －803 cellular survival level gradually decreased at dose
of 0． 1 ～ 0． 8mg /mL(P ＜ 0． 05) ;The percentage of MGC － 803 G1 phase was(61． 23 ± 6． 45)%，S phase was
411
(26． 86 ± 3． 38)% and the apoptotic level was(0． 07 ± 0． 01)% at dose of 0 ． 8mg /mL，compared with control
group(P ＜ 0． 05);At the dose of 0． 8mg /mL，the Bcl － 2 mＲNA expression decreased and the Bax mＲNA expres-
sion increased，respectively compared with control group(P ＜ 0． 05) ;At the dose of 0． 2 ～ 0． 8mg /mL，protein ex-
pression of Bcl － 2 was decreased while protein expression of Bax was increased． Conclusion AKAE can decrease
the Bcl － 2 mＲNA and protein expression and increase the Bax mＲNA and protein expression in MGC －803 cells，
so that it plays a role in inducing cell apoptosis．
Keywords Arenaria Kansuensis Tumor MGC －803 Bcl － 2 Bax
雪灵芝抗肿瘤的作用研究，在报道中较少。赵
鹏等［1］通过大鼠体内抑瘤实验发现，雪灵芝对二乙
基亚硝胺诱发的大鼠肝癌具有预防作用，但具体作
用机制不明。本研究通过观察雪灵芝水提取物对体
外培养的 MGC － 803 细胞因子 Bcl － 2 和 Bax 基因
表达的影响，了解其对肿瘤细胞凋亡的可能作用机
制，为进一步研究打下基础。
1 材料与方法
1． 1 材料选择
人胃腺癌细胞株 MGC －803 采购于中国科学院
上海细胞库;雪灵芝水提取物冻干粉剂由本实验室
制备，配制浓度为 0． 1 mg /mL;ＲPMI1640 培养基为
美国 Gibco公司产品;胎牛血清购自 Hyclone 公司;
Bcl － 2 兔抗人单克隆抗体、Bax 小鼠抗人单克隆抗
体购于 Santa Crus 公司;辣根过氧化物酶标记山羊
抗小鼠 IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 均
购于北京中杉金桥生物技术有限公司(进口分装);
碘化丙啶(PI)、BCA 蛋白试剂盒、ECL 化学发光试
剂盒均为碧云天生物研究所产品;Trizol 购自 In －
vitrogen公司;AMV反转录酶、Taq DNA 聚合酶购自
Promega公司。细胞培养箱(HF － 90 型)为美国
Forma公司产品;酶标仪(Ｒayto ＲT － 6000 型)为深
圳雷杜生命科学股份有限公司产品;流式细胞仪
(FACS calibur)为 BD公司产品;PCＲ仪(TC － XP －
G型)为杭州博日科技有限公司产品;电泳仪(DYY
－8C型)为北京市六一仪器厂产品。
1． 2 细胞培养
MGC －803 细胞常规培养于含 10%胎牛血清的
ＲPMI1640 培养液中，于 5% CO2、37 ℃、饱和湿度条
件下培养，每 2 d传代 1 次，取对数生长期细胞用于
实验。
1． 3 MGC －803 细胞存活的检测
应用 MTT法。取对数生长良好的细胞，配制浓
度为 2 × 104 /mL的悬液，100 μL /孔接种于 96 孔板，
培养 6 h 后，加入浓度为 0． 05、0． 10、0． 20、0． 40、
0． 80 mg /mL的雪灵芝水提取物 100 μL /孔。以
0 mg /mL为对照组，加入 100 μL /孔的培养液。各组
设 5 个复孔。24、48、72 h 后终止培养，加入
20 μL /孔的 MTT，继续孵育 4 h，弃上清液，加入
150 μL /孔的 DMSO震荡溶解 10 min，酶标仪测定波
长 490 nm处吸光度(OD值)。
1． 4 细胞周期和凋亡水平的检测
应用流式细胞术。将配制浓度为 4 × 104 /mL
的 MGC － 803 细胞悬液，按 1 mL /孔接种于 6 孔板
内，待细胞贴壁 6 h 后，加入药物浓度为 0． 0、0． 2、
0． 4、0． 8 mg /mL的雪灵芝提取物，每个药物浓度设
置 3 个复孔。48 h 后终止培养、消化细胞，离心
(1200r /min)10 min，弃上清液收集细胞，计数 1． 5 ×
106 个细胞。用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered
solution PBS)漂洗细胞 2 次，离心(1200r /min)
10 min，弃上清液，加入 75%预冷乙醇 1 mL 振荡混
匀固定，4 ℃保存。检测时，离心弃上清液，用 PBS
漂洗 2 次，加含有 ＲNaseA 的 PI(50 ×)避光染色
30 min。用流式细胞仪进行检测，采用计算机软件
Modfit进行周期分析。
1． 5 Bcl － 2 和 Bax mＲNA 的表达检测
应用 ＲT － PCＲ 法。将对数生长期的 MGC －
803 细胞接种于培养瓶内，加入药物浓度为 0． 0、
0． 2、0． 4、0． 8 mg /mL的雪灵芝水提取物。培养 24 h
后，Trizol法提取总 ＲNA，反转录合成 cDNA。引物
序列:Bcl － 2 基因(上游 5 － GAGGATTGTGGCCT-
TCTT － 3，下游 5 － TGAGCAGAGTCTTCAGAGA －
3)，Bax基因(上游 5 － GATGCGTCCACCAAGAA －
3，下游 5 － GCGGAGGAAGTCCAATGTC － 3)。
PCＲ 反应体系:20 μL － ddH2O 16 μL，10 × PCＲ
Buffer 2 μL，dNTP 0． 5 μL，cDNA 0． 5 μL，上、下游引
物各 0． 5 μL(20μmol /L)，Hot Taq 酶 0． 2 μL。反应
条件:变性 94 ℃ 5 min，扩增 33 个循环(94℃ 30s，
57℃ 35s，72℃ 30s)，延伸 72 ℃ 5 min。扩增产物用
1． 5%琼脂糖进行电泳，UVP 凝胶成像系统观察结
511
果并拍照，实验重复三次，采用 Adobe Photoshop CS5
软件进行灰度值分析。
1． 6 Bcl － 2 和 Bax蛋白表达的测定
应用 Western Blot 法。将对数生长期 MGC －
803 细胞接种于培养瓶内，加入药物浓度为 0． 0、
0． 2、0． 4、0． 8 mg /mL的雪灵芝水提取物。培养 24 h
后，弃培养液，加入预冷 PBS 3mL 漂洗细胞，置冰上
加入含 1% PMSF的蛋白裂解液作用 20 min，收集上
清液。试剂盒测定蛋白浓度。经 10% SDS － PAGE
凝胶电泳，转移蛋白样品至硝酸纤维素膜上，5%脱
脂奶粉封闭 90 min，加入一抗溶液(1:1000)4 ℃过
夜。用 TBST(含 0． 1%吐温 － 20 的 Tris 缓冲液)洗
膜。加入 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HＲP)二 抗 溶 液
(1:500)，室温孵育 1 h。洗膜后加入 ECL化学发光
液，暗室内曝光胶片。
1． 7 统计学处理
应用 SPSS 17． 0 统计学软件，实验数据以均数
士标准差(珋x ± S)表示，组间比较采用单因素方差分
析，两两比较采用 Scheffe法，检验水准 α = 0． 05。
2 结果
2． 1 雪灵芝水提取物对 MGC803 细胞存活的影响
MTT结果显示，AKAE 作用 24、48、72 h，在 0． 1
～ 0． 8 mg /mL 药物浓度范围，MGC － 803 细胞存活
水平随药物浓度增大而降低(P ＜ 0． 05)，见表 1。
表 1 雪灵芝水提取物对 MGC －803 细胞存活水平的影响(珋x ± S，n = 5)
Table 1 Effect of AKAE on cellular survival level of MGC － 803 cells(珔x ± S，n = 5)
药物浓度(mg /mL)
OD值
24 h 48 h 72 h
0 0． 10 ± 0． 03 0． 30 ± 0． 03 0． 52 ± 0． 05
0． 05 0． 08 ± 0． 02 0． 28 ± 0． 03 0． 51 ± 0． 01
0． 1 0． 06 ± 0． 02★ 0． 20 ± 0． 03★ 0． 37 ± 0． 01★
0． 2 0． 02 ± 0． 03★ 0． 04 ± 0． 01★ 0． 07 ± 0． 01★
0． 4 0． 01 ± 0． 01★ 0． 01 ± 0． 01★ 0． 01 ± 0． 01★
0． 8 0． 01 ± 0． 01★ 0． 01 ± 0． 01★ 0． 01 ± 0． 01★
note:★，compared with 0mg /mL group P ＜ 0． 05．
2． 2 雪灵芝水提取物对 MGC － 803 细胞周期和凋
亡的影响
流式细胞术结果显示，MGC － 803 细胞 G1 比例
随着药物浓度的增大逐渐增大，0． 8 mg /mL 浓度组
G1 期比例高于对照组(P ＜ 0． 05)，0． 8 mg /mL 浓度
组 S期比例低于对照组(P ＜ 0． 05)，细胞凋亡水平
随药物浓度的增高而增加，与对照组相比，
0． 8 mg /mL浓度组差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)，
见表 2。
表 2 雪灵芝水提取物对 MGC －803 细胞周期和凋亡的影响(%，珋x ± S，n = 3)
Table 2 Effect of AKAE on cell cycle and apoptosis of MGC － 803 cells(%，珔x ± S，n = 3)
Concentration(mg /mL) G1 S apoptosis
0 42． 61 ± 1． 05 43． 47 ± 6． 15 0． 01 ± 0． 01
0． 2 50． 91 ± 1． 98 33． 47 ± 2． 17 0． 03 ± 0． 02
0． 4 56． 75 ± 3． 26 32． 90 ± 3． 10 0． 06 ± 0． 03
0． 8 61． 23 ± 6． 45★ 26． 86 ± 3． 38★ 0． 07 ± 0． 01★
note:★，compared with 0mg /mL group P ＜ 0． 05．
2． 3 雪灵芝水提取物对 Bcl － 2 和 Bax mＲNA 表达
的影响
ＲT － PCＲ 结果显示，各浓度组均有 Bax 和
Bcl － 2 mＲNA的表达。Bax mＲNA表达随浓度增大
而上调，Bcl － 2 的表达随浓度的增大而下调，
0． 8 mg /mL浓度组 Bcl － 2 mＲNA表达下调，Bax mＲ-
611
NA表达上调，与对照组相比，P ＜ 0． 05，见表 3、图 1。
表 3 ＲT － PCＲ测定 MGC －803 细胞中 Bcl － 2 和 Bax mＲNA相对灰度值(珋x ± S，n = 3)
Table 3 ＲT － PCＲ detect the mＲNA relative gray value of the Bcl －2 and Bax of MGC －803 cells(珔x ± S，n =3)
药物浓度(mg /mL)
0 0． 2 0． 4 0． 8
Bcl － 2 2． 72 ± 0． 08 3． 02 ± 0． 28 2． 77 ± 0． 14 1． 30 ± 0． 23★
Bax 0． 41 ± 0． 02 0． 65 ± 0． 03★ 0． 70 ± 0． 02★ 0． 86 ± 0． 05★
note:★，compared with 0 mg /mL group P ＜ 0． 05．
图 1 MGC － 803 细胞 Bcl － 2 和 Bax mＲNA电泳图
Figure 1 Electropherograms of the mＲNA expression level of the Bcl － 2 and Bax of MGC － 803
cells detected by ＲT － PCＲ
2． 4 雪灵芝水提取物对 Bcl － 2、Bax 蛋白表达的影
响
Western Blot 结果显示，MGC － 803 细胞中
Bcl － 2蛋白表达水平随着药物浓度的增大而逐渐降
低，而 Bax蛋白在 0． 2 ～ 0． 8 mg /mL 浓度之间表达
水平随着药物浓度的增大而逐渐增高，见图 2。
图 2 雪灵芝水提取物对 Bcl － 2 和 Bax蛋白表达的影响
Figure 2 Effect of AKAE on expression of Bax and Bcl － 2 protein in MGC － 803 cells
3 讨论
国内学者对雪灵芝进行的研究结果表明雪灵芝
具有抗炎、调节免疫、促消化等［2 － 4］效用。本研究采
用 MTT法检测细胞存活的水平，结果显示，雪灵芝
水提取物对 MGC －803 细胞的生长具有浓度依赖性
抑制作用。
细胞的存活水平受细胞增殖影响，还受到细胞
凋亡改变的影响。实验室前期研究表明［5］，雪灵芝
水提取物可以降低 MGC － 803 细胞周期蛋白 Cy-
clinD1 的表达水平，促进 P16 与 P21 蛋白的表达，发
挥 G1 期阻滞作用。本研究通过流式细胞术检测
MGC －803 细胞周期和凋亡水平，结果显示药物作
用 48 h 后，细胞周期构成发生变化，G1 期细胞随着
浓度的增大而增加，而 S期细胞则减小，与前期研究
结果一致。同时结果还显示细胞凋亡水平随药物浓
度的增高而增高，与对照组相比，0． 8 mg /mL浓度组
差异有统计学意义。提示雪灵芝水提取物可以通过
对 MGC －803 G1 期的阻滞作用，发挥诱导细胞凋亡
的作用。
国内外研究表明［6 － 7］，Bcl － 2 基因家族与细胞
凋亡密切相关，Bax 和 Bcl － 2 比例的改变关系着凋
亡的发生与否。本研究采用 ＲT － PCＲ 和 Western
Blot检测 MGC － 803 细胞 mＲNA 和蛋白的表达情
况，结果显示，与对照组相比，0． 8 mg /mL浓度组 Bcl
－ 2 mＲNA表达下调，Bax mＲNA 表达上调，Bcl － 2
蛋白表达水平随着药物浓度的增大而逐渐降低，Bax
蛋白在 0． 2 mg /mL 到 0． 8 mg /mL 浓度之间表达水
平随着药物浓度的增大而逐渐增高。提示雪灵芝水
711
提取物可以下调 Bcl － 2 mＲNA和蛋白的表达水平，
而上调 Bax mＲNA 和蛋白的表达水平，从而形成同
源二聚体而发挥诱导细胞凋亡的作用。
综上所述，雪灵芝水提取物在一定浓度范围内
可降低 MGC －803 细胞 Bcl － 2 mＲNA和蛋白表达，
增加 Bax mＲNA 和蛋白表达，发挥诱导细胞凋亡的
作用。
参考文献
［1］赵鹏，姚思宇． 雪灵芝对二乙基亚硝胺诱导大鼠肝
癌组织细胞的抑制作用［J］．中国组织工程研究与临床康复，
2007 年第 38 卷第 11 期:7553 － 7555．
［2］彭宝珠，冯伟力． 藏药雪灵芝对炎症和免疫功能的
影响［J］．中国中药杂志，1991，16(6):363．
［3］姚思宇，．西藏雪灵芝促进消化作用实验研究［J］．
中国应用生理学杂志，2007 年第 23 卷第 3 期:332 － 334．
［4］李凤文，赵鹏． 雪灵芝调节小鼠免疫功能作用的实
验研究［J］．中国热带医学杂志，2007 年第 7 卷第 11 期:1999
－ 2002．
［5］王刚．雪灵芝水提物对人胃癌 MGC － 803 细胞增殖
及细胞周期的影响［J］．肿瘤防治研究，2013 年第 40 卷第 9
期:821 － 825．
［6］Dodurga Y，Gundog G etc． Expression of UＲG4 /
UＲGCP，CyclinD1，Bcl － 2，and Bax genes in retinoic acid trea-
ted SH － SY5Y human neuroblastoma cells［J］． Contemporary
oncology，2013;17(4):346 － 349．
［7］EL Touny Lara H，Vieira Anthony etc． Combined SFK /
MEK inhibition prevents metastatic outgrowth of dormant tumor
cells［J］． The Journal of Clinical Investigation，2013;124(1) :
156 － 168．
收稿日期
欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂欂
2014 － 03 － 03
( 上接第 113 页)
MMP －2 位于肿瘤细胞质膜上，是 MMPs 激活
过程中的关键酶之一，参与 MMPs激活的调节过程，
降解基质膜成分 IV型胶原，在癌细胞浸润转移过程
中起重要作用。本研究通过 Transwell 迁移实验，发
现对照组 Hela 细胞透膜较多;而 HO － 1 高表达的
Hela细胞，其穿透的细胞数目明显减少。Western
blot结果显示，HO －1 明显抑制 MMP －2 的表达，结
果具有统计学差异。该结果提示，HO － 1 抑制 Hela
细胞的侵袭能力部分是通过调节 MMP － 2 表达实
现的。
综上所述，本实验通过研究 HO － 1 对人宫颈癌
细胞株 Hela增殖及侵袭的调节作用，为宫颈癌的临
床诊断和治疗提供新的思路。
参考文献
［1］Hanselmann C，Mauch C，Werner S． Heme oxygenase －
1:a novel player in cutaneous wound repair and psoriasis［J］．
Biochem J，2001，353:459 － 466．
［2］Clark JE，Green CJ，Motterlini Ｒ． Involvement of the
heme oxygenase － carbon monoxide pathway in keratinocyte pro-
liferation［J］． Biochem Biophys Ｒes Commun，1997，241:215 －
220．
［3］Jozkowicz A，Huk I，Nigisch A，et al． Heme oxygenase
and angiogenic activity of endothelial cells:stimulation by carbon
monoxide and inhibition by tinprotoporphyrin － IX［J］． Antioxid
Ｒedox Signal，2003，5:155 － 162．
［4］Sunamura M，Duda DG，Ghattas MH，et al． Heme oxy-
genase － 1 accelerates tumor angiogenesis of human pancreatic
cancer［J］． Angiogenesis，2003，6:15 － 24．
［5］Hoye AT，Davoren JE，Wipf P，et al． Targeting mito-
chondria［J］． Acc Chem Ｒes，2008，41(1):87 － 97．
［6］Zou C，Zhang H，Li Q，et al． Heme oxygenase － 1:a
molecular brake on hepatocellular carcinoma cell migrations［J］．
Carcinogenesis，2011，32(12) :1840 － 8．
收稿日期 2014 － 03 － 03
811