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点柄粘盖牛肝菌菌种分子鉴定与最适培养条件研究



全 文 :食用菌学报2013.20(4):6~10
收稿日期:2013-04-11原稿;2013-07-03修改稿
基金项目:北京市教委科技成果转化和产业化———林下经济关键技术示范与转化(编号:PXM2013 014207
000077)、北京市财政项目2013山区林下野生品种人工扩繁试验示范(编号:PXM2013154208000008)的
部分研究内容
作者简介:牛玉蓉(1985-),女,在读硕士,主要从事野生食用菌的生理生化研究工作。
*本文通讯作者 E-mail:cqj3305@126.com
文章编号:1005-9873(2013)04-0006-05
点柄粘盖牛肝菌菌种分子鉴定与最适培养条件研究
牛玉蓉1,王明花1,张国庆1,陈青君1*,刘 松2,蒋 玮2
(1北京农学院植物科学技术学院,北京102206;2北京市园林绿化局防沙治沙办公室,北京100029)
摘 要:点柄粘盖牛肝菌(Suilus granulatus)是一种菌根性食用菌,在对其菌种进行分子鉴定的基础上进行了
最适培养条件研究,结果表明:由孢子分离得到的菌种为点柄粘盖牛肝菌纯菌种;菌丝生长最佳的营养元素为葡
萄糖、氯化铵与硝酸铵,最适温度为25℃,31℃时菌丝不萌发,最适pH值为4.5,喜偏酸性的环境。
关键词:点柄粘盖牛肝菌;分离;转录间隔区;生长条件
  点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus),又名
栗壳牛肝菌,属担子菌纲(Basidiomycetes)、伞菌
目(Agaricales)、牛肝菌科(Boletaceae)、粘盖牛肝
菌属(Suillus)[1]。它是一种外生菌根食用菌,常
见于夏秋季节的松林及混交林地[2],是北京油松
林地的优势菌根性食用菌之一[3],同时,也是北
京地区野生食用菌中的珍品[4]。点柄粘盖牛肝
菌味道鲜美,富含多种营养成分,同时可用于大
骨节病的治疗[5],子实体中的活性提取物对多种
肿瘤细胞有较强的抑制作用[6],具有较高的经济
价值及药用价值;由于其与松树形成外生菌根并
促进松树生长,在森林生态系统中也发挥重要作
用,是一类重要的菌根菌资源[7,8]。
由于点柄粘盖牛肝菌目前还无法进行人工栽
培,获得真实的菌株并明确其培养条件是下一步驯
化栽培的基础之一。利用rDNA ITS区段的DNA
序列对菌种进行分子鉴定,是一种精确的对未知菌
种进行鉴定的方法[9],近几年该技术也较多运用于
外生菌根真菌的鉴定[10,11]及亲缘关系的研究。笔
者对北京山区野生点柄粘盖牛肝菌进行分子鉴定,
并对其菌丝体生长适宜条件进行研究,以期为点柄
粘盖牛肝菌的人工驯化栽培提供参考。
1 材料与方法
1.1材料
  野生点柄粘盖牛肝菌(S.granulatus)子
实体于2010年7月下旬至9月份两次采集于
北京市延庆四海镇油松林地,样本经中国科学
院微生物研究所卯晓岚先生进行形态学分类
鉴定为点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus)。
菌种由野生点柄粘盖牛肝菌子实体孢子分离
得到。
1.2基于rDNA ITS序列分析的分子鉴定
1.2.1样品DNA的提取
  采用“Bio TeKe”新型快速植物基因组DNA
提取试剂盒(离心柱型,北京百泰克生物技术有
限公司)对点柄粘盖牛肝菌子实体、孢子分离菌
丝体DNA进行提取。
1.2.2样品rDNA ITS区段的PCR扩增、测序及
分析比对
    试 验 所 选 用 引 物 为 ITS1
(5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3)与 ITS4
(5TCCTCCGCTTATTGATATGC3),由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩
增反 应 使 用 “TIAN GEN”2× Taq PCR
Mastermix(天根生化科技北京有限公司)(体系
组成为:2×Taq PCR MasterMix 25.0μL,模板
DNA2.0μL,引物(10μmol/L)ITS1、ITS4分别
1.5μL,ddH2O20.0μL),在BIO-RAD C1000
Thermal Cycler PCR仪上进行。
PCR扩增程序:94℃预变性5 min;34个循
环(94℃变性40 s;56℃退火40 s;72℃延伸
第4期 牛玉蓉,等:点柄粘盖牛肝菌菌种分子鉴定与最适培养条件研究
80 s);最后72℃延伸10 min,4℃保存。
PCR产物检测:取PCR扩增产物5μL,经
1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外凝胶成
像仪下检测 PCR 扩增产物的分子量大小并
拍照。
PCR产物测序:将扩增产物直接交由上海生
工生物工程技术服务有限公司进行测序。
序列分析比对:样品rDNA ITS区段 DNA
序列用 DNAMAN(Version 6.0.3)软件进行分
析,并运用 GenBank中的BLAST工具在 DNA
序列数据库中对所获序列同源性进行分析比较,
判断所测样品的物种。
1.3最适营养元素筛选
  第一组:分别使用20g果糖、甘露醇、蔗糖、
乳糖、麦芽糖、淀粉替换PDA培养基中的葡萄
糖,以PDA培养基为对照,每处理3个重复。
使用直径为5mm的打孔器,在PDA培养基上
培养20d的点柄粘盖牛肝菌菌落边缘打孔取
块,分别接种于供试培养基中央,每皿1块,置
于25℃恒温培养箱中暗培养。接种6d后每
5d测量菌落直径,以最先满皿的培养时间为记
录截止日期,记录菌丝生长情况,计算菌丝生长
速度等[13]。
第二组:分别向PDA培养基中添加0.5%氯
化铵、硝酸铵、硝酸钾、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸
膏、尿素,并以PDA培养基为对照,每处理3个
重复。接种培养及观测方法同第一组。
1.4最适培养温度筛选
  采用 PDA 培养基进行试验,接种方法同
1.3。将接种后的培养基分别置于15、17、19、21、
23、25、27、29、31℃的恒温培养箱中进行暗培养,
每处理3个重复,接种后25d测量菌落直径,并
将培养基融化后水洗,过滤收集菌丝体,于100℃
烘干称取菌丝体干重。
1.5最适pH值筛选
  用1mol/L NaOH和1mol/L HCl,分别将
PD培养液pH值调节为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、
7.5、8.5、9.5、10.5,每处理3个重复。
使用无菌研钵将PD培养液中培养15d的
点柄粘盖牛肝菌菌球研碎,并吸取3mL菌液加
入不同pH值供试培养液中。置于25℃恒温振
荡培养箱中125r/min进行暗培养,19d后过滤
收集培养液中菌球并于100℃烘干称取菌丝体
干重。
2 结果与分析
2.1点柄粘盖牛肝菌分子鉴定
2.1.1样品rDNA ITS区段的PCR扩增结果
  使用引物ITS1与ITS4对点柄粘盖牛肝菌
不同样品DNA的ITS序列进行PCR扩增,获得
大约650bp产物(图1为不同样品rDNA ITS区
段PCR产物电泳结果)。条带S1、S2对应的样
品分别是点柄粘盖牛肝菌子实体S1、孢子分离菌
丝体S2。
泳道 M:分子量标记;泳道S1,S2:子实体、孢子分离菌丝体
Lanes:M,Markers;S1and S2,the wild fruiting body and
mycelia isolated fromS.granulatus spore
图1 样品rDNA ITS区段PCR产物电泳结果
Fig.1 S.granulatus rDNA ITS amplification patterns
2.1.2样品rDNA ITS区段的序列分析比对
  供试点柄粘盖牛肝菌子实体与菌丝体的
rDNA ITS序列S1、S2长度均为653bp,并且二
者碱基排列一致。将样品的rDNA ITS序列与
GenBank核酸序列数据库进行序列相似性检索
(BLAST),二者皆与 GenBank中点柄粘盖牛肝
菌ITS序列(AJ272409.1)相似程度达到99%,说
明供试样品均为点柄粘盖牛肝菌组织,与形态学
分类鉴定结果相一致,证实由孢子分离得到的菌
丝体为点柄粘盖牛肝菌纯培养菌种。
2.2点柄粘盖牛肝菌培养条件的优化
2.2.1最适营养元素的筛选
  第一组中,不同营养元素对点柄粘盖牛肝菌
菌丝生长的影响如表1所示。菌丝在接种后3~
5d开始萌发,其中以在葡萄糖上生长最快,日均
生长量达到3.33mm,显著高于其它处理,菌丝
在葡萄糖培养基上生长浓密,颜色洁白,点柄粘
盖牛肝菌菌丝体生长最佳营养元素为葡萄糖。

食 用 菌 学 报 第20卷
表1 第一组营养元素对点柄粘盖牛肝菌菌丝生长的影响
Table1 Growth of S.granulatus mycelium on different carbon sources
营养元素
Carbon source
萌发天数
Days of germination(d)
菌丝长速
Mycelial growth rate(mm/d)
菌丝长势
Mycelial growth vigor*
葡萄糖 Glucose  3  3.33±0.06a +++
果糖Fructose  3  2.88±0.04b ++
麦芽糖 Maltose  4  1.83±0.11c ++
甘露醇 Mannitol  5  1.64±0.17d +++
乳糖 Lactose  5  1.55±0.06d +
淀粉Starch  5  1.29±0.08e +
蔗糖Sucrose  5 — —
*+++菌丝生长浓密,++菌丝生长密,+菌丝生长稀疏,—未检测到;数据为3次重复的平均值±标准误;不同小写字母表示在
0.01<0.05水平上差异显著
+++luxuriant,++dense,+relatively sparse mycelium,—no growth;Values are the means(n=3)±SD ;Different lower case
letters indicate a significant at P0.05
  第二组对点柄粘盖牛肝菌菌丝体生长的影
响如表3所示。菌丝体在含不同氮源的培养基
中生长情况有较大差异。除添加尿素的培养基
菌丝体不能萌发,其它均可在接种后2~3d开始
萌发。在以氯化铵、硝酸铵、牛肉浸膏为氮源的
培养基上,菌丝体生长最快,日均生长量均达到
4mm左右,显著高于其它处理;菌丝体在含牛
肉浸膏、蛋白胨与酵母浸膏的培养基上生长,中
心出现褐色老化现象,而添加氯化铵、硝酸铵的
培养基上菌丝体浓密洁白。因此,点柄粘盖牛
肝菌菌丝体生长适宜的营养元素为氯化铵与硝
酸铵。
表2 第二组营养元素对点柄粘盖牛肝菌菌丝生长的影响
Table 2 Growth of S.granulatus mycelium on different nitrogen sources
营养元素
Nitrogen source
萌发天数
Days of germination(d)
菌丝长速
Mycelial growth rate(mm/d)
菌丝长势
Mycelial growth vigor
氯化铵
Ammonium chloride
2  4.27±0.03a +++
硝酸铵
Ammonium nitrate
2  4.09±0.11a +++
牛肉浸膏
Beef extract
3  3.99±0.17a ++
蛋白胨
Peptone
3  3.41±0.34b +++
酵母浸膏
Yeast extract
3  1.97±0.26c +++
硝酸钾
Potassium nitrate
3  1.94±0.19c ++
尿素 Urea — — —
对照 Control  3  3.33±0.06b +++
注释同表1 Footnote as in table 1
2.2.2最适培养温度的筛选
  由表3可知,点柄粘盖牛肝菌菌丝体在15~
29℃均可萌发生长,31℃时不萌发,且菌落形态
和菌丝生长情况不同。
从点柄粘盖牛肝菌接种后萌发天数、日均
生长量、菌丝体干重以及菌丝的生长情况综合
分析,适宜点柄粘盖牛肝菌菌丝生长适宜温度
范围是23~25 ℃,最适温度为25 ℃;低于
23℃时,菌丝生长缓慢;低于17℃,在接种块
表面出现深褐色液滴;高于25℃时,菌丝正常
生长受阻,菌落形态出现畸形;温度31℃菌丝
不萌发。

第4期 牛玉蓉,等:点柄粘盖牛肝菌菌种分子鉴定与最适培养条件研究
表3 不同温度对点柄粘盖牛肝菌菌丝体生长的影响
Table 3 Effect of temperature on the growth
of S.granulatus mycelium
温度
Temp.(℃)
萌发天数 (d)
Days of
germination
菌丝长速
Mycelial growth
rate(mm/d)
15  4  1.37±0.10e
17  4  1.70±0.60d
19  3  2.33±0.33c
21  3  2.49±0.10c
23  3  3.09±0.15b
25  3  3.84±0.11a
27  3  2.48±0.13c
29  3  1.44±0.12de
31 — —
注释同表1 Footnote as in table 1
2.2.3最适pH值的筛选
  由表4可知,不同pH环境对点柄粘盖牛肝菌
菌丝体生长有较大影响。pH为3.5~9.5时,菌丝
体可在接种后3~5d萌发并开始形成菌球,pH为
2.5与10.5时,菌丝不能萌发。经过液体振荡培养
19d后形成的菌丝体干重存在差异,pH 3.5~5.5
时,形成菌丝体干重间无显著性差异,但三者均显
著高于pH 6.5~9.5时形成的菌丝体干重,其中
pH 4.5时菌丝体干重最高为1178.7mg。不同pH
条件下形成菌球的大小及数量不同。pH 4.5~5.5
时,形成菌球体积大且数量多。因此,点柄粘盖牛
肝菌菌丝生长适宜的pH值为4.5,喜偏酸性的
环境。
表4 不同pH值对菌丝体生长的影响
Table 4 Effect of pH on the growth of S.granulatus mycelium
pH
菌丝体干重
Mycelial dry weight
(mg)
菌球长势
Mycelial
growthvigor
2.5  211.8±21.9f —
3.5  1080.3±51.5ab ++
4.5  1178.7±124.6a +++
5.5  1003.7±62.0ab +++
6.5  921.8±56.8b ++
7.5  874.1±101.2c ++
8.5  700.5±126.3d +
9.5  398.2±37.4e +
10.5  190.1±51.1f —
+++体积大且数量多,++体积中等数量居中,+菌球体积小
且数量少;其它注释同表1
+++bulk and more,++ moderate,+smal and less;Others
footnote as in table 1
3 小结
  真实菌种是进行菌根食用菌研究的前提,但
由于菌根食用菌的菌种分离存在难度而且难以在
人工培养条件下形成子实体,因此对其菌种真伪
的鉴定无法依靠传统栽培实验来实现。目前主要
通过对菌根食用菌菌种rDNA ITS区段进行分析
比对来验证菌种的真伪,例如,张灵等[14]对松茸
(Tricholoma matsutake)子实体与分离出的菌丝
体采用rDNA ITS序列进行分析比对;付立忠
等[15]针对四个红菇科(Russulaceae)菌株采用
rDNA ITS序列分析并进行系统发育的研究。在
本实验中对采集的野生点柄粘盖牛肝菌子实体及
其孢子分离产生的菌丝体进行分子鉴定,其结果
表明,二者与GenBank中记录的点柄粘盖牛肝菌
ITS序列有99%的相似度,说明经孢子分离得到
点柄粘盖牛肝菌纯菌种。笔者还发现,同一个区
域内的粘盖牛肝菌在菌柄长短、盖的大小、颜色上
存在差异,有关油松林地牛肝菌的种类以及点柄
粘盖牛肝菌种群结构和遗传多样性还有待于深入
研究。
点柄粘盖牛肝菌培养条件的研究是进行人
工驯化栽培的前提条件,也是菌种扩繁、菌剂制
备等研究的基础,目前人们在多种菌根食用菌中
开展了相关研究[16-21],但对于点柄粘盖牛肝菌培
养条件的研究报道很少。本实验中,点柄粘盖牛
肝菌菌丝体生长的最佳营养元素为:葡萄糖,氯
化铵与硝酸铵,适宜的温度范围是23~25℃,最
适温度为25℃,最适pH值为4.5,这与他人研
究报道中点柄粘盖牛肝菌最适pH 为7~8不
同[7],这种结果的差异可能与菌种原生地生境不
同有关。
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ITS Sequence Analysis of Strain Obtained from
Wild Suillus granulatus Fruit Bodies and
Opitimization of Selected Parameters
NIU Yurong1,WANG Minghua1,ZHANG Guoqing1,
CHEN Qingjun1*,LIU Song2,JIANG Wei 2
(1 Department of Plant Science and Technology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China;
2 Beijing Municipal Bureau of Landscape and Forestry,Beijing 100029,China)
Abstract:Suilus granulatus is a kind of edible mycorrhizal fungi,obtained from wild Suilus granulatus fruit
bodies in Chinese pine forest in Sihai County,Yanqing,Beijing,isolated from the spore of S.granulatus,
exhibited a high genetic similarity(99.25%)with S.granulatus(AJ272409.1).The optimum nutritional
parameters for mycelial growth were glucose,ammonium chloride and ammonium nitrate.the optimum
temperature was 25℃,when it was 31℃,mycelium could not germinate.The optimum pH value was 4.5.
Key words:Suilus granulatus;isolated;internal transcribed spacers(ITS);growth condition
[本文编辑] 王瑞霞
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