全 文 ：微生物学通报 NOV 20, 2012, 39(11): 16221628
Microbiology China © 2012 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：云南省应用基础研究项目(No. 2008CD193); 国家自然科学基金项目(No. 31060271); 农业科技成果转化
资金项目(No. 2011GB2F300004)
*通讯作者：Tel: 86-691-2120331; : jkpcnlc@126.com
收稿日期：2012-02-17; 接受日期：2012-03-30
研究报告
覆土层中细菌对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的影响
刘静 王文兵 纪开萍* 张春霞 何明霞
(云南省热带作物科学研究所 云南 景洪 666100)


摘 要: 【目的】筛选对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体生长有促进作用的细菌单菌株, 并
对其进行鉴定。【方法】将 3株细菌菌株 C1、T24、T34及引进 4株细菌菌株 1B00263、
1A0081、1A03263、1A01082单菌株添加到覆土层, 定期测覆土层菌丝生长长度、原基形
成时间、原基数目、子实体成熟数及子实体重。选出对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体生
长有促进作用的菌株, 并采用分子生物学方法对其进行鉴定。【结果】添加 T34菌株的处
理在暗褐网柄牛肝菌子实体整个形成过程中起着重要的作用, 不仅对覆土层暗褐网柄牛
肝菌菌丝生长有显著促进作用, 对子实体形成、平均单菇重也有显著促进作用; 添加 C1、
T24、1A01082、1B00263、1A03263 单菌株的处理对覆土层暗褐网柄牛肝菌菌丝的生长
有显著的促进作用; 添加 1A00081、1B00263、C1、1A03263单菌株的处理, 原基形成时
间(19.86−24.14 d)比对照(27.00 d)提前 7−3 d, 对暗褐网柄牛肝菌原基的形成也有促进作
用。C1、T24、T34对暗褐网柄牛肝菌菌丝、子实体的生长起着不同程度的促进作用, 这
3株细菌经分子生物学鉴定, 结果为: C1为短杆菌属(Brevibacterium sp.), T34为芽孢杆
菌属(Bacillus sp.), T24的种属关系还有待进一步确定。【结论】7株细菌单菌株添加到覆
土层, 研究其对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体生长的影响。最终筛选到一株细菌菌株 T34
(芽孢杆菌属 Bacillus sp.), 对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体的生长均有显著的促进作用。
关键词: 暗褐网柄牛肝菌, 覆土, 细菌菌株




DOI:10.13344/j.microbiol.china.2012.11.012
刘静等: 覆土层中细菌对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的影响 1623

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Effect of bacteria in the casing soil for fruit of
Phlebopus portentosus
LIU Jing WANG Wen-Bing JI Kai-Ping* ZHANG Chun-Xia HE Ming-Xia
(Yunnan Tropical Crops Research Institute, Jinghong, Yunnan 666100, China)
Abstract: [Objective] Screened bacterial strains which had a significant effect on mycelia and
fruit body growth, and further made species identification. [Methods] Added the single strain
of three bacterial strains C1, T24, T34 and four introduced bacterial strains 1B00263, 1A0081,
1A03263, 1A01082 to the casing layer, and then regular survey was mad, including the length
of mycelia growth, time for primodia to emerge, number of primodia, and number and weight
of mature fruit bodies. After the bacterial strains that had a significant effect on mycelia and
fruit body growth were screened, molecular biology identification was further made. [Results]
Adding T34 strain had a great effect on the fruit body. T34 strain not only could promote the
growth of fruit bodies, but also played an important role in promoting fruit body formation and
increasing the weight of individuals, indicating T34 was an ideal bacterial strain. Adding C1,
T24, 1A01082, 1B00263 and 1A03263 had significant effects on fruit body growth. Meantime,
adding 1A00081, 1B00263, C1 and 1A03263 could shorten the time for primodia to emerge
(treatment 19.86−24.14 d and control 27.00 d). C1, T24 and T34, which had different effect
degrees of on the growth of mycelia and fruit body, were further made molecular biology
identification. The identification results were as follows: C1 belongs to Brevibacterium, T34
belongs to Bacillus, and T24 needs to be further determined. [Conclusion] By adding seven
bacterial strains to the casing soil, we studied their effects on the growth of mycelia and
fruiting body of casing soil Phlebopus portentosus. In result T34 (Bacillus sp.) was screened as
the one bacterial strain that had a significant promotional effect on both mycelia and fruit body
growth.
Keywords: Phlebopus portentosus, Casing soil, Bacterial strains
暗褐网柄牛肝菌 [Phlebopus portentosus
(Berk. & Broome) Boedijn], 又名巨型牛肝菌, 属
于牛肝菌目小牛肝菌科脉柄牛肝菌属[1]。分布于
斯里兰卡、越南、印度尼西亚、泰国、巴西、墨
西哥、澳大利亚, 新西兰等地区, 国内广西、海
南、云南都有分布[2−7]。其子实体味道鲜美, 富含
蛋白质和钾、钙、镁、铁、锌等多种人体所需的
矿质元素[8−10], 具有很高的经济价值。目前市场
上供应的暗褐网柄牛肝菌以野生为主, 因此实现
其人工栽培具有重要意义。覆土是双孢蘑菇、平
菇、鸡腿菇等许多食用真菌人工栽培过程中的必
要环节, 在暗褐网柄牛肝菌栽培过程中, 覆土也
旸是其子实体形成的必要条件。曹 等[11]的研究表
明, 暗褐网柄牛肝菌瓶栽条件下出菇必须经过覆
土, 覆土中的微生物能抵抗外界微生物的污染,
并对暗褐网柄牛肝菌子实体的形成有促进作用。
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刘静等[12]的研究表明, 经液体发酵和平板试验筛
选出的 3株细菌 C1、T24、T34, 对暗褐网柄牛肝
菌的菌丝生长有促进作用。本文进一步研究这 3
株细菌及引进菌株[13]对暗褐网柄牛肝菌原基形
成时间、原基数目、子实体成熟数目及平均单菇
重的影响, 并对 3株细菌进行了分子鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种: 暗褐网柄牛肝菌菌种(菌株编
号: B-01-3-1)由云南省热带作物科学研究所植物
保护与微生物利用研究室提供。
1.1.2 供试菌株: 细菌菌株(菌株编号: C1、T24、
T34, 暗褐网柄牛肝菌人工栽培所使用覆土材料
中分离得到)由云南省热带作物科学研究所植物
保护与微生物利用研究室提供。
引入已报道对双孢菇(Agaricus bisporus)生长
有促进作用的菌株 : 巨大芽孢杆菌 Bacillus
megaterium (编号 : 1B00263)、粪产碱杆菌
Alcaligenes faecalis (编号: 1A00081)、环状假单孢
杆菌 Bacillus circulans (编号: 1A03263)和恶臭假
单孢菌 Pseudomonas putida (编号: 1A01082), 4株
菌均由中国海洋微生物菌种保藏管理中心提供。
1.1.3 培养基: 细菌培养基(g/L): 牛肉膏 3, 蛋
白胨 10, 氯化钠 5, 琼脂 18, pH 7.4−7.6。液体培
养基(g/L): 去皮马铃薯 200, 葡萄糖 20, 酵母膏
1, KH2PO4 1, MgSO4·7H2O 1, pH自然。
1.1.4 覆土层土壤: 果园土采自云南省景洪市柚
子树下表土(10 cm−20 cm), 草炭由呈贡园林栽培
基质公司提供。果园土和草炭等体积混合后制成
覆土层土壤, pH为 4−5, 含水量为 60%。
1.2 方法
1.2.1 细菌对覆土层菌丝生长及子实体生长的
影响: 细菌菌株(菌株编号: C1、T24、T34)及引进
菌株(菌株编号: 1A01082、1B00263、1A00081、
1A03263)进行活化培养, 将各菌株活化菌液接种
于装有 150 mL液体培养液的 250 mL三角瓶中
(每瓶接种 2环), 28 °C摇床培养 48 h, 无菌条件
下定量取菌液添加于灭菌的覆土材料中并与之
混匀 , 以平板菌落计数法计数细菌浓度
(CFU/mL), 再换算成覆土层土壤中含菌浓度
(104−106 CFU/g 土), 以覆纯灭菌土(CK)为对照,
每个处理 8 次重复(每个重复 8 瓶)。覆土后的菌
瓶放于菇房中培养菌丝生长及出菇。当菌丝长满
覆土层后, 揭去瓶口覆盖的薄膜, 喷无菌水保湿
覆土层湿润培养出菇。定期测覆土层菌丝生长长
度、原基形成时间、原基数目、子实体成熟数目
及子实体重, 筛选促进暗褐网柄牛肝菌菌丝生长
及子实体生长的细菌单菌株。
1.2.2 有益细菌种类鉴定: 利用氯苯法[14]提取 3
株有益细菌菌株总 DNA。16S rDNA序列的扩增
采用细菌通用引物 27F: 5-AGAGTTTGATCCTG
GCTCAG-3; 1492R: 5-GGCTACCTTGTTACGA
CTT-3, 由云南农业大学植物病理实验室细菌组
完成。测序得到的 16S rDNA序列在 GenBank中
分别进行同源序列搜索(BLAST search), 并下载
相关类群微生物模式菌株的 16S rDNA 序列, 用
ClustalX 软件[15]对各相关菌株编码序列进行比对
之后 用 MEGA 4.0 软件 [16], 进行邻接法
(Neighbor-Joining)分析, 1 000次重复[17] , 构建系
统发育树。
2 结果
2.1 对覆土层暗褐网柄牛肝菌菌丝生长、原基形
成时间的影响
由表 1 可以看出, 覆土层中添加各细菌菌株
覆土 10 d 后, 细菌菌株 1A01082、C1、T24、
1B00263、1A03263、T34处理的覆土层暗褐网柄
牛肝菌菌丝的生长长度(4.88 cm−3.00 cm)均显著
高于对照(2.38 cm), 说明这几株细菌在覆土培养
刘静等: 覆土层中细菌对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的影响 1625

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菌丝生长过程中有极显著促进暗褐网柄牛肝菌
菌丝生长的作用, 是较好的菌株。
1A00081、1B00263、C1、T34、1A03263原
基形成时间(19.86−24.14 d)比对照(27.00 d)提前
7−3 d, 说明这几株细菌对暗褐网柄牛肝菌原基
的形成有促进作用。
由表 2 可以看出, T24 菌株处理的原基(图
1)数目(0.14)与对照(1.86)相比有显著差异 , 可
能是覆土层被青霉污染 , 从而影响原基的形
成; 其余菌株与对照相比均没有显著差异。说
明添加细菌菌株对原基的形成没有明显的促进
作用。
在子实体成熟数目上, T34 菌株的处理子实
体(图 2)成熟数目(0.71)高于对照(0.14), 与对照相
比达到显著差异水平, 说明 T34 菌株对子实体的
形成有显著的促进作用。

表 1 细菌单菌株对覆土层暗褐网柄牛肝菌菌丝生长、原基形成时间的影响
Table 1 Effect of different bacterial strains on the mycelial growth and time for primodia to emerge P. portentosus
细菌菌株
Bacterial strain
菌丝长度
Mycelia growth in
casing for 10 d (cm)
细菌菌株
Bacterial strain
原基形成的时间
Time for primodia
to emerge (d)
1A01082 4.88Aa T24 34.57Aa
C1 4.44ABab 1A01082 27.00ABab
T24 3.88ABCbc CK 27.00ABab
1B00263 3.69ABCbc 1A03263 24.14ABb
1A03263 3.44BCDc T34 22.29Bb
T34 3.38BCDc C1 22.00Bb
1A00081 3.00CDcd 1B00263 20.86Bb
CK 2.38Dd 1A00081 19.86Bb
注: 表中数据为 8个重复的平均值; 不同大小写字母代表在 0.01和 0.05水平差异显著.
Note: Values shown are the means ± SD of eight determinations. Different higher and lower case represent significance at 0.01 and
0.05 levels, respectively.

表 2 细菌单菌株对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响
Table 2 Effect of different bacterial strains for vegetative and fruiting characteristics P. portentosus
细菌菌株
Bacterial
strain
原基数目
Number of primodia
细菌菌株
Bacterial
strain
子实体成熟数目
Number of mature
fruit bodies
细菌菌株
Bacterial
strain
平均单菇重
Weight of individual
fruit bodies (g)
CK 1.86Aa T34 0.71Aa T34 37.43Aa
1B00263 1.57ABa 1A03263 0.57ABab 1A03263 21.29ABab
C1 1.43ABa 1A00081 0.57ABab 1A00081 19.71ABab
1A00081 1.29ABab C1 0.43ABabc 1A01082 18.14ABab
T34 1.14ABab 1A01082 0.43ABabc C1 18.14ABab
1A01082 1.00ABab 1B00263 0.14ABbc 1B00263 5.71ABb
1A03263 0.71ABab CK 0.14ABbc CK 4.29Bb
T24 0.14Bb T24 0.00Bc T24 0.00Bb
注: 表中数据为 8个重复的平均值; 不同大小写字母代表在 0.01和 0.05水平差异显著.
Note: Values shown are the means ± SD of eight determinations. Different higher and lower case represent significance at 0.01 and
0.05 levels, respectively.
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图 1 暗褐网柄牛肝菌原基形态
Fig. 1 The primodia morphology of the Phlebopus por-
tentosus

图 2 暗褐网柄牛肝菌子实体形态
Fig. 2 The fruit body morphology of the Phlebopus
portentosus

在平均单菇重上, T34 菌株的处理平均单个
子实体的重(37.43 g)极显著高于对照(4.29 g), 与
对照相比达到极显著差异水平, 说明 T34菌株对
子实体的平均单菇重有极显著的促进作用。
2.2 有益细菌菌株的系统发育分析
细菌 C1、T34、T24与 GenBank数据库中其
他细菌的 16S rDNA 序列进行比较, 系统发育树
见图 3, 发现与菌株 C1 基因序列最相似的 4 条
序列皆为短杆菌属菌株的基因序列, 相似性为
99%, 进化树分析表明 : C1 与表皮短杆菌
Brevibacterium epidermidis (GU576981)、黄金短
杆菌 Brevibacterium aureum (AY299093)、碘短杆
菌 Brevibacterium iodinum (FJ652620)、速生短杆
菌 Brevibacterium celere (NR025727)等 4株菌自
然类聚在一大分支上, 属于同一类群, 初步确定
C1为短杆菌属的一种; 与菌株T34基因序列最相
似的 3 条序列皆为芽孢杆菌属菌株的基因序列,
相似性为 96%, 进化树分析表明: T34 与地衣芽
孢杆菌 Bacillus licheniformis (AY 947531)、枯草
芽孢杆菌 Bacillus subtilis (HQ 202549)、淀粉芽孢
杆菌 Bacillus amyloliquefaciens (FJ 222551)等 3株
菌自然类聚在一大分支上, 可能属于同一类群;
菌株 T24 基因序列与最相似的食苯芽孢杆菌
Bacillus benzoevorans (AY 043085)、环状芽孢杆
菌 Bacillus circulans (JN 644554)等两株菌相似性
仅为 93%, 进化树分析表明: T24 虽然与这两株
菌自然类聚在一大分支上, 但其种属关系有待进
一步确定。
3 结论与讨论
3.1 结论
本文的研究表明, 从覆土层分离筛选到的 3
株细菌菌株(C1、T24、T34)及引进 3株细菌菌株
(1A01082、1B00263、1A03263)对覆土层暗褐网
柄牛肝菌菌丝的生长有显著的促进作用 ;
1A00081、1B00263、C1、T34、1A03263细菌菌
株对暗褐网柄牛肝菌原基的形成也有促进作用;
其中T34细菌菌株在暗褐网柄牛肝菌子实体的整
个形成过程中起着重要的作用, 不仅对覆土层暗
褐网柄牛肝菌菌丝生长有显著促进作用, 对子实
体形成、平均单菇重也有显著促进作用, 是较好
的细菌菌株。
从覆土层分离筛选到的 3 株细菌菌株(C1、
T24、T34)对暗褐网柄牛肝菌菌丝、子实体的生
长起着不同程度的促进作用, 因此将这 3 株细菌
进行分子生物学鉴定, 鉴定结果为: C1为短杆菌
属、T34 为芽孢杆菌属、T24 的种属关系还有待
进一步确定。
刘静等: 覆土层中细菌对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的影响 1627

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图 3 细菌 C1、T34、T24的 16S rDNA序列与其他细菌亲源关系及进化树
Fig. 3 Genetic relationship and evolutionary trees of 16S rDNA sequence of bacteria C1,
T34, T24 and other bacteria
Note: Numbers in parentheses represent the sequences’ accession number in GenBank. Numbers at the nodes indicate the bootstrap
values on Neighbor-Joining analysis of 1 000 resampled data sets. Bar: 0.01 represent sequence divergence. The number in brackets
was the accession number of each strain.

3.2 讨论
覆土微生物中细菌对子实体形成的影响研究
较多, 最著名的是 Hayes 等[18]从覆土层中分离出
臭味假单孢杆菌(Pseudomonas putida)并在洋菜培
养基上诱导出了双孢蘑菇子实体; Rainey[19]研究
认为, 臭味假单孢杆菌(Pseudomonas putida)能促
进双孢蘑菇菌丝体生长的速度。因此, 研究覆土
层中的细菌及其作用在蘑菇生产上有重要意义。
T34菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.), 对暗褐网柄
牛肝菌菌丝、子实体的整个形成过程都有促进作
用, 引进菌株巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium
(编号: 1B00263)对覆土层暗褐网柄牛肝菌菌丝的
生长、原基的形成也有促进作用, 这一研究结果
与 Ahlawat 等[13]、杜爱玲等[20]得出的结论基本
一致。
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标准误用英文小写 xs , 不用 SE。t 检验用英文小写 t。F 检验用英文大写 F。卡方检验用希文小写
2。相关系数用英文小写 r。样本数用英文小写 n。概率用英文大写 P。