全 文 ：·52· Chinese Journal of Information on TCM Jan.2016 Vol.23 No.1

五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞氧化损伤的影响
杨杰 1，2，卫东锋 3，王文潇 2，程卫东 1
1.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；2.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；
3.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700
摘要：目的 观察五指毛桃药物血清对老龄小鼠衰老所致脾淋巴细胞氧化损伤的影响，探讨其作用机制。
方法 将 40只老龄小鼠随机分为空白对照组和五指毛桃高、中、低剂量组，分别给予 0.9%氯化钠溶液和 6.6、
4.4、2.2 g/kg五指毛桃水提物灌胃，测定脾脏指数，确定五指毛桃水提物的最佳剂量，采用MTT法确定最佳
剂量药物血清干预老龄小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳稀释浓度及最佳作用时间。使用最佳稀释浓度药物血清作用
老龄小鼠脾淋巴细胞 48 h后观察衰老细胞阳性率，检测细胞内总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）
和活性氧（ROS）含量。结果 与空白对照组比较，药物组老龄小鼠脾脏指数均明显提高（P＜0.05，P＜0.01)，
以中剂量组效果最佳；五指毛桃药物血清促进老龄小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳浓度为 20%，最佳作用时间为
48 h。20%五指毛桃药物血清明显降低衰老细胞阳性率（P＜0.01)，提高老龄小鼠 T-SOD活性，降低MDA和
ROS 含量（P＜0.05，P＜0.01）。结论 五指毛桃药物血清能够提高老龄小鼠脾淋巴细胞增殖活性，其机制与
降低衰老细胞阳性率、增强细胞抗氧化能力有关。
关键词：五指毛桃；药物血清；脾淋巴细胞；衰老；氧化损伤；老龄小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2016)01-0052-04
Effects of Drug-containing Serum of Ficus Hirta on Oxidative Damage of Spleen Lymphocyte
in Aged Mice YANG Jie1,2, WEI Dong-feng3, WANG Wen-xiao2, CHENG Wei-dong1 (1. Institute of Traditional
Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2. School of Basic Medical Science of
Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of
Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)
Abstract: Objective To study the effects of drug-containing serum of Ficus Hirta on oxidative damage of spleen
lymphocyte due to aging in aged mice; To discuss its mechanism of action. Methods Forty aged mice were randomly
divided into control group and high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups. Control group was given 0.9%
sodium chloride solution for gavage, while high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups were given 6.6, 4.4, and
2.2 g/kg aqueous extract of Ficus Hirta for gavage. The spleen index was observed for optimum dose in aged mice.
The optimum time and dilution of drug-containing serum of Ficus Hirta were confirmed by MTT method in
lymphocyte proliferation test. The positive rate of senescent cells, the activity of T-SOD and the contents of MDA and
ROS were determined in cellular antioxidant experiment after treated by optimal drug-containing serum for 48 h.
Results Compared with the control group, the spleen index was significantly improved in high-, medium- and
low-dose Ficus Hirta groups (P<0.05, P<0.01). 20% drug-containing serum of Ficus Hirta cultivated for 48 h had the
best effects on lymphocyte proliferation in aged mice. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta could significantly
decrease the positive rate of senescent cells (P<0.01), improve T-SOD activity and decrease the contents of MDA and
ROS (P<0.05, P<0.01). Conclusion The drug-containing serum of Ficus Hirta can improve the proliferative activity
of spleen lymphocyte in aged mice and the mechanism of action may be involved in decreasing the positive rate of
senescent cells and increasing antioxidant ability of lymphocyte.
Key words: Ficus Hirta; drug-containing serum; spleen lymphocytes; aging; oxidative damage; aged mice

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81373806)；甘肃省中医药管理局普通课题(GZK-2012-43)
通讯作者：程卫东，E-mail：chengweidong888@sina.com
2016 年 1 月第 23 卷第 1期 中国中医药信息杂志 ·53·

五指毛桃以桑科榕属植物粗叶榕 Ficus hirta
Vahl.的干燥根入药，其味甘、辛，性平，具有补气健
脾、利湿舒筋等功效，常用于治疗肺脾气虚、风湿痹
痛、肺痨咳嗽等。因其与黄芪作用相当，且主要产于
我国岭南地区，故又称“南芪”。以往研究发现，南
芪、北芪均有增强小鼠细胞免疫力的作用，但南芪作
用效果较为显著[1]。五指毛桃中活性成分如黄酮、多
糖、多酚、氨基酸均有较强清除自由基的作用，且其
中黄酮、氨基酸和多酚相对于其他植物抗氧化活性更
强[2]，对机体氧化损伤具有明显的保护作用。本实验
采用血清药理学方法，观察五指毛桃药物血清对老龄
小鼠脾淋巴细胞氧化损伤的影响，为五指毛桃的临床
应用及药物研发提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级昆明种青龄小鼠 50 只，6 月龄，雌雄各半，
体质量（20±2）g；清洁级昆明种老龄小鼠 60 只，
18 月龄，体质量（20±2）g，雌雄各半。均由兰州大
学医学动物实验中心提供，许可证号 SCXK（甘）
2009-0004。饲养温度为（20±2）℃，12 h 昼夜交替
动物房中，自由进食。
1.2 药物
五指毛桃由南方医科大学中医药学院程卫东教
授提供并鉴定。五指毛桃水提物制备：将药材加入适
量水中浸泡 0.5～1 h，煎煮 3 次，第 1 次 1.5 h，第 2
次 1 h，第 3 次 0.5 h，合并 3 次滤液，将所得滤液浓
缩至 1 g 原药材/mL，4 ℃保存备用。
1.3 主要试剂与仪器
四甲基偶氮唑盐（MTT）、刀豆蛋白 A（ConA）、
脂多糖，美国 Sigma 公司；RPMI-1640 培养基，恒生
生物工程有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS），天津
化学试剂一厂；EZ-SepTM小鼠淋巴细胞分离液，深圳
达科为生物技术有限公司；胎牛血清，杭州四季青生
物制品公司；Bradford 蛋白浓度测定试剂盒、细胞衰
老 β-半乳糖苷酶染色试剂盒，碧云天生物技术研究
所；总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、
细胞内活性氧（ROS）试剂盒，南京建成生物工程研
究所。CO2 培养箱（日本 SANYO 公司），680 型酶标
仪（美国 Bio-Rad 公司），XL 型流式细胞仪（美国贝
克曼 COULTER 公司），JY92-2D 超声细胞粉碎机（宁
波新芝公司）。
2 实验方法
2.1 动物分组及药物血清和脾淋巴细胞悬液制备
将 40 只老龄小鼠随机分为空白对照组和五指毛
桃高、中、低剂量组，每组 10 只。空白对照组给予
0.9%氯化钠溶液灌胃，药物组按体质量分别给予高、
中、低剂量（6.6、4.4、2.2 g/kg）五指毛桃水提物灌
胃，1 次/d，连续 15 d。末次给药后，摘取脾脏，计
算脾脏指数。根据脾脏指数选择五指毛桃水提物最佳
剂量（4.4 g/kg）作用于青龄小鼠，1 次/d，连续 15 d，
末次给药 2 h 后，制备药物血清[3]。
将青龄小鼠和老龄小鼠脱颈处死，无菌取脾脏，
严格按照 EZ-SepTM 小鼠淋巴细胞分离物说明书操作
提取脾淋巴细胞，各加入适量含 10%胎牛血清的
RPMI-1640 培养液，分别调整为所需浓度，制备青龄
小鼠和老龄小鼠的脾淋巴细胞悬液。
2.2 检测指标
2.2.1 五指毛桃药物血清与脾淋巴细胞增殖时效和
量效关系测定 将上述制备的老龄小鼠脾淋巴细胞
悬液，加入 96 孔板中，每孔 100 μL。将“2.1”项中
制备的各组药物血清用完全 RPMI-1640 培养液稀释
为 2.5%、5%、10%、20%、40% 5 个浓度。每个浓度
设 8 个复孔，同时设不加药物血清的老龄组和青龄组
作为对照，分别培养 24、48、72 h 后，加入浓度 5 g/mL
MTT 10 μL，于 CO2 培养箱中继续培养 4 h 后，每孔
加入 100 μL 10%SDS，37 ℃过夜后摇匀，于酶标仪
570 nm 处测定 OD 值。根据 MTT 结果选择药物血清
的最佳稀释浓度和培养时间。
2.2.2 衰老脾淋巴细胞增殖活性测定 取各组脾淋
巴细胞按照细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明
书进行操作。镜下随机选择 5 个视野，按公式计算衰
老细胞阳性率。衰老细胞阳性率（%）＝衰老细胞数÷
总细胞数×100%。
2.2.3 脾淋巴细胞总超氧化物歧化酶、丙二醛水平
测定 将“2.1”项中收集的老龄小鼠脾淋巴细胞与最
佳稀释浓度的药物血清培养“2.2.1”项中确定的最佳
培养时间后，收集细胞，用超声波细胞破碎仪在冰上
破碎细胞，严格按照 T-SOD 和 MDA 试剂盒说明书进
行操作。
2.2.4 脾淋巴细胞活性氧水平测定 将“2.1”项收
集的老龄小鼠脾淋巴细胞与各组药物血清共同培养。
收集的细胞严格按照 ROS 试剂盒说明书处理后，用
流式细胞仪于 488 nm 激发波长、525 nm 发射波长处
检测其荧光强度。
3 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。实验数据以
—x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析，并做方差
齐性检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。
·54· Chinese Journal of Information on TCM Jan.2016 Vol.23 No.1

4 结果
4.1 五指毛桃水提物对老龄小鼠脾脏指数的影响
与空白对照组比较，五指毛桃高、中剂量组老龄
小鼠脾脏指数明显提高，且中剂量组效果显著（P＜
0.01），见表 1。故选用中剂量五指毛桃水提物给予青
龄小鼠灌胃制备药物血清。
表 1 各组老龄小鼠脾脏指数比较（—x±s）
组别 只数 剂量/（g/kg） 脾脏指数/（mg/g）
空白对照组 10 2.74±0.73
五指毛桃高剂量组 10 6.6 3.28±0.63*
五指毛桃中剂量组 10 4.4 3.49±0.58**
五指毛桃低剂量组 10 2.2 2.79±0.61
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
4.2 五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞增殖
活性的影响
与老龄组比较，稀释浓度为 10%、20%、40%五
指毛桃药物血清均能明显提高老龄小鼠脾淋巴细胞增
殖活性（P＜0.05，P＜0.01），并呈现一定的时-效和
量-效关系。随着细胞培养时间的延长，脾淋巴细胞的
增殖活性呈现先升后降的现象；空白血清稀释浓度为
20%和 40%时，也可提高老龄小鼠脾淋巴细胞细胞增
殖活性，但仍比五指毛桃药物血清组水平低。与空白
血清组比较，培养 48 h，稀释浓度为 20%五指毛桃药
物血清对脾淋巴细胞增殖的刺激效果最佳（P＜0.01），
见表 2。因此，将稀释浓度为 20%、培养时间为 48 h
的五指毛桃药物血清作为后续实验研究的条件。
4.3 五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾衰老细胞的
影响
老龄组衰老细胞阳性率为 23.80%，青龄组衰老
细胞阳性率为 2.31%。与青龄组比较，老龄组脾衰老
细胞显著升高（P＜0.01）；与空白血清组比较，五指
毛桃药物血清作用后老龄小鼠脾淋巴细胞衰老细胞
阳性率显著降低（P＜0.01）；老龄组与空白血清组比
较差异无统计学意义。结果见表 3。
4.4 五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞总超
氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的影响
与青龄组比较，老龄组小鼠脾淋巴细胞 T-SOD
活性显著降低（P＜0.01），MDA 含量显著升高（P＜
0.01）；与空白血清组比较，五指毛桃药物血清组老龄
小鼠体外脾淋巴细胞总 T-SOD 活性显著升高（P＜
0.01），脾淋巴细胞内 MDA 含量显著降低（P＜0.05）；
与老龄组比较，空白血清组脾淋巴细胞内 MDA 含量
明显降低（P＜0.05），但仍比五指毛桃药物血清组水
平高。结果见表 4。
表 2 各组小鼠脾淋巴细胞增殖活性比较（—x±s）
组别 n 24 h 48 h 72 h
青龄组 8 1.01±0.19** 1.23±0.28** 1.08±0.16**
老龄组 8 0.59±0.14 0.65±0.06 0.57±0.05
2.5%空白血清组 8 0.57±0.07 0.69±0.04 0.60±0.03
5%空白血清组 8 0.58±0.04 0.63±0.06 0.57±0.05
10%空白血清组 8 0.60±0.05 0.68±0.05 0.61±0.04
20%空白血清组 8 0.68±0.09 0.83±0.09** 0.62±0.08
40%空白血清组 8 0.65±0.04 0.78±0.08* 0.64±0.04*
2.5%五指毛桃药物血清组 8 0.62±0.09 0.65±0.05 0.65±0.09
5%五指毛桃药物血清组 8 0.66±0.14 0.72±0.09 0.67±0.10
10%五指毛桃药物血清组 8 0.72±0.07## 0.79±0.06# 0.71±0.05#
20%五指毛桃药物血清组 8 0.79±0.02## 1.19±0.13## 0.98±0.15##
40%五指毛桃药物血清组 8 0.74±0.07## 0.90±0.21# 0.79±0.08#
注：与同一时点老龄组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与同一浓度
空白血清组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
表 3 各组小鼠脾衰老细胞阳性率比较（—x±s）
组别 n 剂量/（g/kg） 阳性率/%
青龄组 8 2.31±0.45
老龄组 8 23.80±1.59**
空白血清组 8 22.95±1.02
五指毛桃药物血清组 8 6 15.73±0.81##
注：与青龄组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白血清组比较，
#P＜0.05，##P＜0.01（下同）
表 4 各组小鼠脾淋巴细胞 T-SOD活性和MDA含量比较（—x±s）
组别 n
剂量/
（g/kg）
T-SOD/
（U/mg）
MDA/
（nmol/mg）
青龄组 8 7.51±1.02 1.21±0.46
老龄组 8 2.52±0.53** 2.65±1.05**
空白血清组 8 2.46±0.51 2.35±0.79*
五指毛桃药物血清组 8 6 5.65±0.84## 1.19±0.67#
4.5 五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞活性
氧水平的影响
与青龄组比较，老龄组脾淋巴细胞中 ROS 含量
显著升高（P＜0.01）；与空白血清组比较，五指毛桃
药物血清组老龄小鼠脾淋巴细胞中 ROS 含量明显降
低（P＜0.05）；空白血清组与老龄组比较差异无统计
学意义。结果见表 5。
表 5 各组小鼠脾淋巴细胞 ROS含量比较（—x±s）
组别 n 剂量/（g/kg） ROS/荧光强度值
青龄组 8 6.73±0.45
老龄组 8 12.20±1.69**
空白血清组 8 11.72±1.76
五指毛桃药物血清组 8 6 9.74±0.61#
2016 年 1 月第 23 卷第 1期 中国中医药信息杂志 ·55·

5 讨论
五指毛桃始载于清代何克谏《生草药性备要》“五
爪龙，根治热咳痰火。”因性喜温暖湿润的环境，主
要生长于我国热带和亚热带地区，是一种药食两用的
植物，其根除用来煲汤还被开发成多种药膳及保健
品，在广东、广西等地广泛使用。研究表明，五指毛
桃可增加大黄所致脾虚模型小鼠的免疫器官胸腺、脾
脏的质量[4]，且其有效成分补骨脂素具有免疫调节、
抗菌、抗病毒、抗凝血及抑制肿瘤等作用[5]。免疫系
统参与机体正常的老化过程，是机体衰老的主要调节
系统之一。而 T 淋巴细胞是机体重要的免疫效应细
胞，除具有清除外源性病原微生物的作用外还可清除
体内衰老或畸变细胞，其与衰老之间关系研究近年来
备受关注[6]。脾脏是人体重要的免疫器官，能产生大
量 T 淋巴细胞，为周围淋巴器官正常发育和参与机体
免疫所必需，而脾脏指数是直接反映机体免疫状态的
重要参数。本实验使用高、中、低剂量五指毛桃水提
物给予老龄小鼠灌胃，测定小鼠脾脏指数，旨在确定
五指毛桃抗细胞衰老的有效性。并通过组间比较，确
定五指毛桃水提物中剂量为最佳剂量组，再采用中剂
量五指毛桃水提物给予青龄小鼠灌胃，制备药物血
清，为后续细胞实验做准备。
衰老是一种复杂的生理、病理变化过程，此过程
包括器官、细胞和分子等功能的整体衰退。机体在氧
化代谢过程中会产生各种自由基。自由基一旦过量，
超过机体自身的清除能力，就会引起脂质、蛋白质、
RNA 和 DNA 的氧化损伤，而这些损伤会导致突变、
癌变和衰老的发生[7]。SOD 是一种自由基防御酶，有
助于清除人体因代谢失衡产生过多的氧自由基，常作
为器官氧化损伤程度评价的重要指标。MDA 是自由
基作用于脂质发生过氧化反应的产物且具有细胞毒
性，其含量可间接反映机体内细胞氧化损伤程度。
有研究表明，老龄鼠与青龄鼠比较，SOD 活性明显
下降而 MDA 含量明显升高[8]。本实验结果显示，老
龄小鼠脾淋巴细胞中 SOD 活性较青龄小鼠低，MDA
含量较青龄小鼠高，与以往研究相符。经五指毛桃
药物血清作用后，SOD 活性显著升高，且 MDA 含
量明显降低，表明五指毛桃具有明显抗氧化损伤的
作用。
ROS 是生物有氧代谢过程中的产物，过高的 ROS
水平会对细胞和基因结构造成损害。有研究表明，
ROS 可造成线粒体损伤并引起不可逆性的生长抑制，
最终导致细胞衰老、死亡[9]。本实验采用流式细胞仪
检测发现，老龄小鼠脾淋巴细胞中 ROS 荧光强度值
明显比青龄小鼠高，五指毛桃药物血清作用后可明显
降低老龄小鼠体内 ROS 水平，说明其能发挥良好的
抗氧化作用。
综上所述，本实验研究表明，五指毛桃药物血清
对老龄小鼠因衰老导致的脾淋巴细胞氧化损伤具有
明显保护作用，其机制与减少衰老细胞数量、提高
SOD 活性、降低细胞内 ROS 和 MDA 含量有关。但
其能否在人体内更好地发挥抗氧化作用及发挥该作
用的有效剂量范围仍需要进一步研究。
参考文献：
[1] 周添浓,王艳,唐立海,等.南芪北芪抗应激与免疫调节作用的研究[J].
中药新药与临床药理,2008,19(1)：15-18.
[2] 李南薇,黄燕珍.五指毛桃功能性成分抗氧化活性研究[J].食品工业,
2013,34(6)：127-130.
[3] 邢文婷,张李锋,程卫东,等.含红芪和含黄芪的补中益气汤药物血清
对老龄小鼠脾淋巴细胞抗氧化损伤作用的比较[J].中药材,2014,37(2)：
299-302.
[4] 罗骞,苏芬丽,王姿媛,等.五指毛桃对大黄型脾虚模型小鼠补益作用
研究[J].新中医,2013,45(9)：152-154.
[5] 段菊屏.中药复方及单味五指毛桃根中补骨脂素大鼠体内药动学研究[J].
中国医药导报,2011,8(4)：29-31.
[6] 刘玉华,邱玉华.免疫老化与T淋巴细胞功能性分子的改变[J].细胞与
分子免疫学杂志,2009,25(7)：668-670.
[7] BENAMEUR L, CHARIF N, LI Y, et al. Toward an understanding of
mechanism of aging-induced oxidative stress in human mesenchymal
stem cells[J]. Biomed Mater Eng,2015,25(1)：41-46.
[8] UZUN D, KORKMAZ G G, SITAR M E, et al. Oxidative damage parameters
in renal tissues of aged and young rats based on gender[J].
Clinical Interventions in Aging,2013,8：809-815.
[9] ZIEGLER D V, WILEY C D, VELARDE M C. Mitochondrial effectors
of cellular senescence ： beyond the free radical theory of
aging[J]. Aging Cell,2015,14(1)：1-7.
（收稿日期：2015-04-12）
（修回日期：2015-10-23；编辑：华强）