全 文 ：收稿日期:2009-10-20
基金项目:“重大新药创制”科技重大专项课题(2009ZX09103-352);江西省科技支撑计划项目[赣科发计字(2007)189 号] ;
国家“十一五”支撑计划课题(2006BAI06A01-01)
作者简介:魏惠珍(1965-), 女 ,本科 , 副主任药师 ,主要从事中药质量控制研究。
通信作者:饶毅 , 博士 ,教授 , E-mail:rao yi99@126.com。
单一内标多控法同步测定杏香兔耳风中
绿原酸和 3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸的含量
魏惠珍1 ,杜艳龙1 ,饶　毅1 ,王跃生1 ,罗晓健1 ,邱伟华2
(1.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心;2 .江西中医学院研究生部 2007级 ,南昌 330006)
摘要:目的　建立杏香兔耳风中绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的一标多控含量测定方法。方法　采用 H PLC
单一内标多控法进行测定 ,以绿原酸为 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的参照内标 , 在 328 nm 处测定 3 , 5-二咖啡酰基奎宁
酸相对于绿原酸校正因子 ,利用校正因子和绿原酸同时测定绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的含量。 结果　绿原
酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸分别在 0.20 ～ 2.00 μg 和 0.08 ～ 0.80 μg 范围内与峰面积线性关系良好 ,平均加样回
收率绿原酸为 99.07%(RSD=0.77%), 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸为 99.26%(RSD=0.98%)。 结论　该方法准确 、
操作简单 、专属性和重现性良好 , 可实现只用绿原酸一种对照品同时测绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的含量。
关键词:单一内标多控法;杏香兔耳风;绿原酸;3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸;高效液相色谱法
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-2294(2009)11-0014-04
Determination of Chlorogenic Acid and
3 , 5-dicaffeoylquinic Acid in Ainsliaea Fragrans Champ
by Single Internal Standard Multi-control Method
WEI Hui-zhen1 ,DU Yan-long1 ,RAO Yi1 ,WANG Yue-sheng1 ,LUO Xiao-jian1 ,QIUWei-hua2
(1.The N at ional P harmaceutical Engineering Center f or Solid
P reparation in Chinese Herbal Medicine ;2.2007 Grade ,Department o f Graduate ,
J iangx i Universi ty of Tradit ional Chinese Med icine , N anchang 330006 , China)
ABSTRACT:Objective　To establish an sing le inte rnal standard mult i-control method fo r dete r-
mination of chloro genic acid and 3 ,5-dicaffeoylquinic acid in ainsliaea f ragrans champ.Methods　
With chlo ro genic acid as internal standard , the rela tive co rrection facto r (RCF)of 3 , 5-dicaf-
feoylquinic acid w as de termined by HPLC-DAD at 328 nm;3 , 5-dicaffeoylquinic acid and chloro-
genic acid we re simultaneously determined by multi-components w ith single marker.Results　Fo r
chloro genic acid and 3 , 5-dicaf feoy lquinic acid , the linear ranges w ere 0.20 ～ 2.00 μg and 0.08 ～
0.80 μg respectively , the average recoveries w ere 99.07%, 99.26% respectively and the RSD
were 0.77%,0.98% respectively.Conclusion　The me thod is acura te , simple , speciali zed and re-
producible.The method can be used for dectecting chlorog enic acid and 3 ,5-dicaf feoy lquinic acid s
content in ainsliaea frag rans champ ,w ith chlo ro genic acid as single marker.
KEYWORDS:sigle internal standard multi-control method;ainsl iaea fragrans champ;
chlorogenic acid;3 ,5-dicaffeoylquinic acid;HPLC
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　　杏香兔耳风为菊科兔耳风属植物杏香兔耳风
(ainsliaea f rg rans champ)的干燥全草 ,具有清热 、利
湿 、凉血 、解毒的功效 ,用于治疗肺结核咳血 、慢性宫
颈炎等[ 1] 。绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸为杏
香兔耳风中主要的活性成分[ 2-3] ,目前有关杏香兔耳
风活性成分测定报道较少 , 3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸
对照品较难获得且不稳定 ,这就直接限制了采用常
规外标法同时控制绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁
酸含量的设想。
在对照品紧缺的情况下 ,通过建立成分之间的
校正因子 ,实现仅用一个对照品对中药中多个成分
进行同时测定 ,即“单一内标”多控。目前“单一内
标”多控法已应用于中药多成分质量控制[ 4-5] ,研究
表明在特定的色谱条件下同一化合物的校正因子
(f)可以在不同的仪器上重现 ,利用 f 可以直接计算
组分的含量。笔者关于采用校正因子实现多成分间
的“单一内标”多控法的研究思路已在中药复方四逆
散中得到运用[ 6] 。为更全面考察药材的质量 ,降低
药物质量控制成本 ,本研究建立了 HPLC-单一内标
多控法同时测定杏香兔耳风中绿原酸和 3 , 5-二咖
啡酰基奎宁酸的含量测定方法 ,对中药“单一内标”
多控法质量控制模式在中药多成分同时检测的运用
做进一步的探讨和论证 ,同时也可为杏香兔耳风药
材的质量评价提供科学依据。
1　仪器与试药
1.1　仪器
Waters 2695 型高效液相色谱仪 、Waters 2996
型二极管阵列检测器 、中文版 Empow er 色谱工作
站(美国 Waters 公司);AB104-N 型电子分析天平
[梅特勒-托利多(上海)有限公司] ;AUW-220D 型
电子分析天平(日本岛津公司);KQ-250DB 型超声
清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2　试药
杏香兔耳风药材(批号:20070625 、20070908 、
20070924)购于江西省婺源 ,经江西中医学院付晓梅
副教授鉴定为菊科兔耳风属植物杏香兔耳风的干燥
全草;绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所 ,批
号:110753-200413),3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸对照品
(购自中山康之源生物科技有限公司 ,纯度≥98%,
批号:20060802);甲醇(上海振兴化工一厂 ,色谱
纯),乙腈(山东禹王实业有限公司化工分公司 ,色谱
纯),其他试剂均为分析纯 ,水为超纯水 。
2　方法与结果
2.1　“单一内标”多控法基本原理
在一定的范围内(线性范围内)成分的量(质量
或浓度)与检测器响应成正比 ,即:f=W/A(W 表示
浓度 ,A 表示响应值)[ 5-6] 。以药材中某一典型成分
为内标物 ,测定该成分与其他成分间的相对校正因
子 ,如公式 f =(Ci/A i)/(Cr/ Ar)所示 ,然后通过校
正因子计算其他组分的含量 。式中 f 为校正因子 ,
Ci和 Ai 为内标成分的质量(或浓度)和峰面积 ,C r
和 A r为待测成分的质量(或浓度)和峰面积 。
2.2　内标物的选择
3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸对照品价格昂贵 ,较难
获得且性质不稳定;而绿原酸对照品相对容易获得 ,
且价格便宜 ,易于检测 。为节省杏香兔耳风质量控
制成本 ,且综合其他因素考虑 ,本研究选择绿原酸为
内标成分 。
2.3　色谱条件与专属性试验
色谱柱为 Waters 柱 Symmetry? C18(4.6 mm×
150 mm ,5μm);流动相为乙腈-0.2%磷酸梯度洗脱
(0 min:15 ∶85 , 10 min:18∶82 , 25 min:18∶82 ,
26 min:20 ∶80);流速为 1 mL/min;检测波长为
328 nm;色谱柱温度为 30 ℃。在上述色谱条件下 ,
分别精密吸取对照品溶液 、杏香兔耳风药材供试品
溶液 10μL ,注入色谱仪 ,记录色谱图。结果见图 1 ,
结果表明绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸两色谱
峰分离效果良好。
A:对照品;B:供试品溶液;1:绿原酸;2:3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸
图 1　杏香兔耳风 HPLC 图
2.4　对照品溶液的制备
精密称取绿原酸 、3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸对照
品适量 , 加 50%乙醇制成每 1 mL 含绿原酸
0.103 mg 、3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸 0.042 mg 的混
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合对照品溶液 ,即得 。
2.5　供试品溶液的制备
取药材粉末约 0.5g(过四号筛),精密称定 ,置
具塞锥形瓶中 ,精密加入 50%乙醇 25 mL ,称定重
量 ,超声处理 30 min ,放冷 ,再称定重量 ,用 50%乙
醇补足减失重量 ,摇匀 、滤过 ,取续滤液 ,即得[ 7] 。
2.6　标准曲线的考察及校正因子的计算
取混合对照品溶液分别进样 2 、5 、8 、10 、15 、
20 μL。按上述的色谱条件进行测定 ,分别以绿原
酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸进样量(μg)为横坐标 ,
峰面积值为纵坐标 ,求得绿原酸回归方程:Y=3×
10
6
X-211302(r=0.999 9);3 , 5-二咖啡酰基奎宁
酸回归方程:Y =2×106X-100232(r=0.999 9)。
结果表明:绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸进样量
分别在 0.20 ～ 2.00μg 和 0.08 ～ 0.80 μg 范围内与
峰面积值呈良好线性关系 ,同时计算不同进样量时
以绿原酸为内标 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的相对校
正因子 ,见表 1。
表 1　3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸校正因子
进样量(μL) 校正因子 平均值 RSD(%)
2 1.28
5 1.30
8 1.37
1.32 2.69
10 1.32
15 1.35
20 1.29
2.7　精密度试验
取同一供试品溶液 ,连续进样 6 针 ,测得绿原酸
和 3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸峰面积值的 RSD 分别为
1.41%和 1.31%(n=6),实验结果表明 ,仪器的精
密度良好 。
2.8　重复性试验
取同一批号(20070908)样品 ,共 6 份 ,研细 ,取
约0.5 g ,精密称定 ,按“2.5”项下方法平行制备供试
品溶液 ,进样 ,记录色谱图 ,测定每份样品中绿原酸
和 3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸含量。结果测得 ,绿原酸
平均含量为 4.503 mg/g , RSD 为 2.33%(n =6);
3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸平均含量为 6.988 mg/g ,
RSD 为 1.99%(n=6),实验结果表明 ,该方法重复
性良好。
2.9　稳定性试验
取同一批号(20070908)供试品溶液 ,分别在 0 、
2 、4 、6 、8 、12 、18 h 进样 ,记录色谱峰 ,测得绿原酸和
3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸峰面积值的 RSD 分别为
0.83%和 1.21%(n=7),实验结果表明 ,样品溶液
稳定性良好。
2.10　加样回收率试验
取已知含量的样品 0.25 g(6 份),精密称定 ,按
100%的比例各精密加入对照品一定量 ,按照“2.5”
项下方法分别制得供试品溶夜 ,进样 ,记录色谱图 ,
并计算回收率 。结果绿原酸平均回收率为99.07%,
RSD 为 0.77%(n=6);3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸平均
回收率为 99.26%, RSD 为 0.98%(n=6)。结果见
表 2-3。
表 2　绿原酸回收率试验结果
序号 样品取样量(g)
样品含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
平均
回收率(%)
RSD
(%)
1 0.252 8 1.138 1.126 2.241 97.96
2 0.250 7 1.130 1.126 2.250 99.48
3 0.251 8 1.134 1.126 2.249 99.02
99.07 0.77
4 0.250 2 1.127 1.126 2.255 100.18
5 0.251 1 1.131 1.126 2.248 99.20
6 0.251 5 1.133 1.126 2.243 98.58
表 3　3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸加样回收试验结果
序号 样品取样量(g)
样品含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
平均
回收率(%)
RSD
(%)
1 0.252 8 1.767 1.747 3.471 97.54
2 0.250 7 1.752 1.747 3.490 99.48
3 0.251 8 1.760 1.747 3.512 100.29
99.26 0.98
4 0.250 2 1.748 1.747 3.485 99.43
5 0.251 1 1.755 1.747 3.480 98.74
6 0.251 5 1.757 1.747 3.475 98.34
2.11　校正因子耐用性考察
2.11.1　色谱柱对校正因子的影响
使用同一台高效液相色谱仪 ,分别使用不同品
牌色谱柱检测绿原酸和 3.5-二咖啡酰基奎宁酸混
合对照品 , 计算 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的校正因
子 ,结果见表 4。结果表明不同色谱柱对 3 , 5-二咖
啡酰基奎宁酸相对与绿原酸内标物的校正因子影响
不显著 ,校正因子是相对稳定的值 。
　　　表 4　不同色谱柱对 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸
校正因子的影响
色谱柱 校正因子 平均值 RSD(%)
Waters 1.35
H ypersil 1.30
Diamon si l 1.27 1.32 3.72
VP-ODS 1.38
2.11.2　仪器对校正因子的影响
用同一根色谱柱考察 Wate rs 、Agilent 和 Shi-
madzu 色谱仪对 3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸相对于绿原
酸内标物的校正因子影响 ,结果见表 5。结果表明
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不同的仪器对 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸相对于绿原
酸内标物的校正因子影响不大 。
　　　表 5　不同色谱仪器对 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸
校正因子的影响
仪器 校正因子 平均值 RSD(%)
Waters 1.30
Agilent 1.27 1.29 1.61
Shimadzu 1.31
2.12　样品含量测定
取 3 批(20070625 、20070908 、20070924)杏香兔
耳风药材 ,每批提取 3 份样品 ,按照“2.5”项下方法
分别制得供试品溶夜 ,进样 ,记录色谱图 ,测定样品
中绿原酸和 3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸含量及二者总
含量 ,并比较外标法和“内标”多控法对 3 , 5-二咖啡
酰基奎宁酸含量的影响 ,结果见表 6。
表 6　3 批样品含量测定结果(mg/ g)
批号 绿原酸 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸外标法 单一内标多控法
总量
外标法 单一内标多控法
20070625 2.129 3.860 3.815 5.989 5.944
20070908 4.372 7.022 6.883 11.394 11.255
20070924 1.941 5.574 5.521 7.515 7.462
3　讨论
本次实验对绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸
进行紫外全波长扫描 ,绿原酸 、3 , 5-二咖啡酰基奎宁
酸均为酚酸类物质 ,在 328 nm 处都有最大吸收 ,且
二者紫外扫描图形状相似 ,选择 328 nm 进行检测 ,
样品主峰分离度较好 , 且阴性样品无干扰 ,故选择
328 nm作为检测波长。
在实验过程中 ,本研究分别考察了甲醇-0.2%
磷酸水溶液体系和乙腈-0.2%磷酸水溶液体系 。在
甲醇-0.2%磷酸水溶液体系中 ,杏香兔耳风药材供
试品中绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸峰分离度
和峰型均不理想 ,且出峰时间长;而采用乙腈-0.2%
磷酸水溶液体系作为流动相时 ,出峰时间快 ,峰形较
好 ,且分离度好。故本研究采用乙腈-0.2%磷酸水
溶液体系作为流动相体系 。
在实验过程中 ,笔者分别考察以水 、甲醇 、50%
甲醇 、50%乙醇为提取溶剂对绿原酸和 3 , 5-二咖啡
酰基奎宁酸的提取效率 ,研究发现不同溶剂的提取
效率高低依次为 50%乙醇=50%甲醇>甲醇>水 ,
再则 ,出于实验安全的角度考虑 ,所以本研究选择
50%乙醇作为杏香兔耳风样品提取溶剂 。
此外 ,实验证明不同色谱柱 、不同仪器对 3 , 5-
二咖啡酰基奎宁酸相对于绿原酸内标物质的校正因
子没有显著影响 ,且使用外标法和“单一内标”多控
法测定杏香兔耳风中的 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的
含量较为接近 ,说明在 3 ,5-二咖啡酰基奎宁酸对照
品紧缺的情况下 ,可通过“单一内标”多控法实现只
用价格便宜的绿原酸对照品同时测定杏香兔耳风中
绿原酸和 3 , 5-二咖啡酰基奎宁酸的含量 。本实验
同时也证明“单一内标”多控法在紫外特征相似的同
类化合物间的研究是可行的 。
由本研究 3批杏香兔耳风药材含量测定结果可
知 ,不同批号的杏香兔耳风药材中绿原酸和 3 ,5-二
咖啡酰基奎宁酸的含量具有较大的差异 ,所以为保
证杏香兔耳风药材的质量稳定 ,进行杏香兔耳风药
材规范化种植研究实属必要 ,有利于规范杏香兔耳
风药材市场。
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(责任编辑:况荣华)
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