全 文 ：中药新药与临床药理 2013年 9月第 24卷第 5期
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（编辑：邓响潮）
收稿日期：2013- 06- 06
作者简介：刘晓，女，硕士研究生，研究方向：中药活性成分研究。 Email：sunllxiao@outlook.com。通讯作者：冯育林，副教授，硕士生导师，研
究方向：中药活性成分研究。 Email：fengyulin2003@hotmail.com。
基金项目：国家自然青年科学基金项目（81102787）；国家“十一五”科技支撑计划（2006BAI06A01- 01）；国家“重大新药创制”科技重大专项
（2009ZX09103- 352）；江西省卫生厅中医药科研计划（2012A158）；江西省自然科学基金重点项目（20133ACB21005）。
杏香兔耳风总酚酸耐药突变选择窗的体外研究
刘 晓 1，苏 丹 1，2，谢 斌 1，张武岗 1，2，冯育林 1，2，杨世林 1，2（1. 江西中医药大学，江西 南昌 330006；
2. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006）
摘要：目的 测定杏香兔耳风总酚酸和对照药绿原酸对金黄色葡萄球菌 ATCC26003和大肠埃希菌 ATCC44102
的防耐药变异浓度（MPC）。方法 采用琼脂平板二倍稀释法，测定杏香兔耳风总酚酸和绿原酸对金黄色葡萄球
菌和大肠埃希菌的最小抑菌浓度（MIC）、99 %抑菌浓度（MIC99）、初测 MPC（MPCpr）和 MPC。结果 杏香兔耳
风总酚酸、绿原酸对金黄色葡萄球菌的MIC、MPC和细菌耐药选择指数（MPC/MIC99）分别为 0.4，6.0 mg·mL-1；
10.8，8.4 mg·mL-1；34.0，1.6。对大肠埃希菌的 MIC、MPC和 MPC/MIC99分别为 12.0，6.0 mg·mL-1；16.8，9.6
mg·mL-1；1.4， 1.7。结论 杏香兔耳风总酚酸限制金黄色葡萄球菌耐药突变菌株作用强于绿原酸，限制大肠
埃希菌耐药突变菌株作用弱于绿原酸。
关键词：杏香兔耳风总酚酸；金黄色葡萄球菌；大肠埃希菌；防耐药变异浓度
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1003- 9783（2013）05- 0465- 04
doi：10.3969/j.issn.1003- 9783.2013.05.009
In-vitro Studies on Mutant Selection Window of Total Phenolic Acids from Ainsliaea fragrans Champ.
LIU Xiao1， SU Dan1，2，XIE Bin1， ZHANG Wugang1， FENG Yulin1，2，YANG Shilin1，2（1. Jiangxi University of
Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006 Jiangxi，China；2. National Pharmaceutical Engineering Center for
Solid Preparation of Chinese Mateia Medica，Nanchang 330006 Jiangxi，China）
Abstract：Objective To measure the mutation preventing concentration（MPC）of total phenolic acids from Ainsliaea
fragrans Champ. and control drug of chlorogenic acid for Staphylococcus aureus ATCC26003 and Escherichia coli
ATCC44102. Methods The minimal inhibitory concentration（MIC）， MIC for 99 % of input cells（MIC99），
provisional MPC（MPCpr） and MPC of total phenolic acids from Ainsliaea fragrans and chlorogenic acid for
Staphylococcus aureus and Escherichia coli were determined by agar plate doubling dilution method. Results The
MIC，MPC and MPC/MIC99 of total phenolic acids from Ainsliaea fragrans for Staphylococcus aureus strain ATCC26003
were 0.34 mg·mL-1，10.8 mg·mL-1，34.0， and those of chlorogenic acid were 6.0 mg·mL-1， 8.4 mg·mL-1， 1.6，
respectively. The MIC，MPC and MPC/MIC99 of total phenolic acids for Escherichia coli strain ATCC44102 were 12.0
mg·mL-1，16.8 mg·mL-1，1.43，and those of chlorogenic acid were 6.0 mg·mL-1，9.6 mg·mL-1，1.7， respectively.
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 September，Vol． 24 No． 5
杏香兔耳风（Ainsliaea fragrans Champ.），又名金
边兔耳、兔耳一支箭等，全草入药，性寒，味苦，归
肺、肝经，具有凉血止血、利湿解毒等功效，主治虚
劳骨蒸、妇女崩漏、湿热黄疸、瘰痢结核等症[1]，化
学成分主要有酚酸类、黄酮类、萜类等[2]。近年来研
究表明杏香兔耳风对盆腔炎、慢性宫颈炎等病症有显
著治疗效果[3]，现已有复方杏香兔耳风软胶囊等一系
列抗宫颈炎的药物。前期研究发现杏香兔耳风总酚酸
是治疗宫颈炎的有效部位，本实验进一步探讨杏香兔
耳风总酚酸对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体外抑
菌和抑制耐药效果，为该药材作为耐药抑制型药剂的
开发应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验菌株 大肠埃希菌 ATCC44102 和金黄色葡
萄球菌 ATCC26003，均购自中国医学菌种保存中心。
1.2 药品及试剂 杏香兔耳风干燥药材，购于江西婺
源，批号：201001，经江西中医药大学中药鉴定教研
室刘庆华教授鉴定为菊科植物杏香兔耳风（Ainsliaea
fragrans Champ.）的干燥全草；杏香兔耳风总酚酸，本
实验室自制，经高效液相色谱仪测定，其中绿原酸
（GCA），3，4- 二咖啡酰基奎宁酸（3，4- DCQA），3，5-
二咖啡酰基奎宁酸（3，5- DCQA），4，5- 二咖啡酰基
奎宁酸（4，5- DCQA）含量之和大于 50 %；绿原酸对
照品，本实验室自制，质量分数大于 98 %；二甲基
亚砜（DMSO）、氯化钠，分析纯，西陇化工股份有限
公司。
1.3 培养基 牛肉膏、琼脂粉和蛋白胨，购于北京奥
博星生物技术有限责任公司，批号：分别为2010513、
20091102和 20091112。
1.4 仪器 超净工作台及 CO2恒温箱，日本 SANYO
公司；立式蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。
1.5 方法
1.5.1 培养基制备 牛肉蛋白胨培养液：牛肉膏 3 g，
蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，超纯水 1 L，以 4 mol·mL-1
的氢氧化钠调 pH 7.0～7.2，经 121 ℃灭菌 30 min，
冷藏备用。牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏 3 g，蛋白胨
10 g，氯化钠 5 g，琼脂 15～20 g，超纯水 1 L，调
pH7.0～7.2，经 121 ℃灭菌 30 min，冷藏备用。
1.5.2 最小抑菌浓度（MIC）测定 采用琼脂二倍稀释
法[4]：分别配制初始浓度为 24 mg·mL-1的杏香兔耳风
总酚酸和绿原酸药液，二倍稀释 10个浓度，稀释倍
数分别为 1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶
32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512。取单个菌落
（cfu）放入 50 mL牛肉蛋白胨培养液中，37 ℃ 过夜培
养，先将菌液浓度调整为 0.5 麦氏单位（约 1.5×108
cfu·mL-1），然后再将菌液浓度稀释到 1.5×106 cfu·mL-1。
分别取 1.5×106 cfu·mL-1菌液 10 μL接种于不同浓度
的含药琼脂平板上，每浓度重复 3个平板，37 ℃培
养 18 h后观察结果，以平板上无菌生长的最低药物
浓度定为MIC。
1.5.3 99 %抑菌浓度（MIC99）测定 （1）琼脂平板稀释
法：参照 Dong等[5]报道的方法，以各药 MIC为基准，
线性递减（10 %）抗菌药物浓度至 1/2MIC 配制含药
的琼脂平板。（2）过夜培养菌液比浊法：将菌液浓度
先调整为 3.0×108 cfu·mL-1，再用肉汤 10 倍倍比稀
释至 3.0×103 cfu·mL-1。用微量加样器在每个含药平
板及无药平板分别接种不同浓度菌液各 10 μL，37
℃过夜培养，选择合适菌液浓度的点进行菌落计数。
以药物浓度为横坐标，菌落恢复生长的比例为纵坐标
绘制抗菌药物浓度 - 恢复生长菌落比例曲线，计算
MIC99。
1.5.4 防耐药变异浓度（MPC）测定 以各药 MIC为基
准，采用琼脂二倍稀释法配置药物浓度从 MIC到 64
mg·mL-1的抗菌药物平板。细菌富集方法[4，6]：将单个
菌落接种于 500 mL牛肉蛋白胨培养液中，20 r·min-1
37℃磁力搅拌器搅拌培养过夜，菌液 3000 r·min-1离
心后，弃上清，再用无菌生理盐水将菌液浓度调整为
3.0×1010 cfu·mL-1。分别取 3.0×1010 cfu·mL-1 菌液
100 μL均匀涂抹在每个含有倍比稀释的抗菌药物牛
肉蛋白胨琼脂平板上，每个浓度 4个平板，每个药物
浓度平板的细菌总接种量为 1.2×1010 cfu，并通过菌
落计数确保每个浓度平板的接种量为 1010 cfu。37 ℃
培养，以 72 h时无菌落生长的最低药物浓度称为初
测 MPC（provisional mutant Prevention concentration，
MPCpr）。测定MPCpr后，再以 MPCpr为基准，依次
Conclusion The effect of Ainsliaea fragrans total phenolic acids is stronger for restricting Staphylococcus aureus
resistant mutants while is weaker for restricting Escherichia coli resistant mutants than that of chlorogenic acid.
Keywords：Total phenolic acids from Ainsliaea fragrans；Staphylococcus aureus；Escherichia coli；Mutant preventing
concentration
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中药新药与临床药理 2013年 9月第 24卷第 5期
递减（10 %）抗菌药物浓度重新配制含药琼脂平板，
重复 MPCpr测定时的细菌富集及接种，以 72 h时不
出现菌落生长的最低药物浓度定为 MPC。对接近
MPC的药物浓度筛选出的菌株再接种于无药平板上，
传代 2次后，再接种于原筛选浓度的抗菌药物平板
上，确保所筛选出的菌株为耐药突变株。
1.5.5 菌落恢复生长比率曲线的描绘 用 MPC方法富
集细菌后，再将菌液从 3.0×1010 cfu·mL-1倍比稀释
至 3.0×103 cfu·mL-1。根据 MIC99测定及 MPC测定时
菌落生长情况，分别取不同浓度菌液 100 μL，接种
于不同浓度的抗菌药物平板上，计数不同抗菌药物浓
度平板上恢复生长的菌落数，计算菌落恢复生长比
率，绘制突变菌株菌落恢复生长比率曲线[4]。
1.6 数据处理 根据 MIC、MIC99、MPCpr 和 MPC结
果，计算MIC范围、MPCpr范围、MPC/MIC99。
2 结果
2.1 对金黄色葡萄球菌标准菌的 MIC 和 MPC 测定
见表 1。杏香兔耳风总酚酸的MIC小于氯原酸，是绿
原酸的 16 倍；杏香兔耳风总酚酸的 MPC大于绿原
酸；MPC/MIC99差异较大，杏香兔耳风总酚酸是绿原
酸的21倍。
表 1 杏香兔耳风总酚酸和绿原酸对金黄色葡萄球菌的作用
（mg·mL-1）
Table 1 The results of Ainsliaea fragrans total phenolic acids and
CGA against S. aureus
2.2 杏香兔耳风总酚酸以及绿原酸对大肠埃希菌
MIC和MPC的测定 见表 2。杏香兔耳风总酚酸的
MIC大于绿原酸，抗菌作用较弱。杏香兔耳风总酚酸
的 MPC值大于绿原酸。MPC/MIC99差异很小，杏香
兔耳风总酚酸略小于绿原酸。
表 2 杏香兔耳风总酚酸和绿原酸对大肠埃希菌的作用（mg·mL-1）
Table 2 The results of Ainsliaea fragrans total phenolic acids and
CGA against E. coli（mg·mL-1）
2.3 杏香兔耳风总酚酸和绿原酸菌落恢复生长比率曲
线的绘制 见图 1～图 4。从图中可见随着药物浓度
逐渐增加，恢复生长的菌落数出现两次明显下降。第
一次发生在 MIC处随着药物浓度增加，绿原酸 - 金
黄色葡萄球菌、大肠埃希菌恢复生长曲线均出现一个
平台区，而杏香兔耳风总酚酸 - 金黄色葡萄球菌、
大肠埃希菌恢复生长曲线则均经过一个拐点；然后药
物浓度进一步增加，菌落出现第二次明显下降，直到
到达MPC处，平板无菌落生长。
图 1 杏香兔耳风总酚酸-ATCC26003菌落恢复生长曲线
Figure 1 The recovery rate curve of Ainsliaea fragrans total
phenolic acids against S. aureus（ATCC26003）
图 2 杏香兔耳风总酚酸-ATCC44102菌落恢复生长曲线
Figure 2 The recovery rate curve of Ainsliaea fragrans total
phenolic acids against E. coli（ATCC44102）
图 3 绿原酸-ATCC26003菌落恢复生长曲线
Figure 3 The recovery rate curve of CGA against S. aureus
（ATCC26003）
3 讨论
防耐药变异浓度（mutant prevention concentration，
MPC），是指不会出现耐药菌落生长的抗菌药物浓度，
也就是防止第一步或下一步耐药突变株被选择性富集
药物
杏香兔耳风总酚酸
绿原酸
MIC
0.4
6.0
MIC99
0.3
5.3
MPCpr
12.0
12.0
MPC
10.8
8.4
MPC/MIC99
34.0
1.6
药物
杏香兔耳风总酚酸
绿原酸
MIC
12.0
6.0
MIC99
11.7
5.6
MPCpr
24.0
12.0
MPC
16.8
9.6
MPC/MIC99
1.4
1.7
菌
落
恢
复
生
长
比
例
1.00E+00
1.00E- 01
1.00E- 02
1.00E- 03
1.00E- 04
1.00E- 05
1.00E- 06
1.00E- 07
1.00E- 08
1.00E- 09
1.00E- 10
1.00E- 11
0 5 10 15
杏香兔耳风总酚酸 /mg·mL-1
菌
落
恢
复
生
长
比
例
1.00E+00
1.00E- 01
1.00E- 02
1.00E- 03
1.00E- 04
1.00E- 05
1.00E- 06
1.00E- 07
1.00E- 08
1.00E- 09
1.00E- 10
1.00E- 11
0 5 10 15 20 25
杏香兔耳风总酚酸 /mg·mL-1
菌
落
恢
复
生
长
比
例
1.00E+00
1.00E- 01
1.00E- 02
1.00E- 03
1.00E- 04
1.00E- 05
1.00E- 06
1.00E- 07
1.00E- 08
1.00E- 09
1.00E- 10
0 2 4 6 8 10 12
绿原酸 /mg·mL-1
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 September，Vol． 24 No． 5
扩增所需的最低抗菌药物浓度[2，5]，可作为评价抗菌药
物抗菌活性及药物抑制耐药突变株选择能力的药效学
参数。MPC与 MIC之比为选择指数（selection index，
SI）用于比较抗菌药物选择耐药突变的能力，数值越
小，药物抑制选择耐药突变能力越强。MIC和MPC
之间的药物浓度范围 [7] 为耐药突变选择窗（mutant
selection window，MSW），该理论认为药物浓度在
MSW之间，耐药突变菌株才会被选择性富集扩增，
从而产生耐药性。研究结果表明 [8，10]，通过 MIC及
MPC的测定，目前所用的大部分抗菌药药物浓度均
在MSW范围之内。这些研究为目前临床上广泛而严
重的耐药问题提供了一个良好的研究依据，开辟了防
耐药研究的新领域，具有重大的科学临床意义
本实验结果显示，杏香兔耳风总酚酸对金黄色葡
萄球菌和大肠埃希菌的 MIC分别为 0.375 mg·mL-1和
12 mg·mL-1，该药物对金色葡萄球菌的作用力很好。
MPC结果表明，两者作用力差异缩小，但是对金色
葡萄球菌的作用较强。此结果表明该药抗革兰氏阳性
菌作用较强。MPC/MIC99表明，杏香兔耳风总酚酸对
金色葡萄球菌虽然 MIC值较小，但是 MSW范围较
宽，细菌富集范围比较大。杏香兔耳风总酚酸对大肠
埃希菌MIC值相对较大，但是MSW范围较小，说明
细菌富集范围小。
本实验所制备的杏香兔耳风总酚酸有较高含量的
绿原酸，故把绿原酸设为对照药。绿原酸对金色葡萄
球菌和大肠埃希菌的 MIC值同为 6.0 mg·mL-1，表明
抑菌作用力相似。MPC结果表明绿原酸对金黄色葡
萄球菌作用略强。SI值表明，绿原酸对金色葡萄球
菌的MSW稍微窄些。
综上，对于金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，杏香
兔耳风总酚酸和绿原酸均有抑制耐药菌作用，且不易
筛选出耐药突变株。在临床上，通常将 MPC理论与
药代动力学参数相结合，可以合理的选择给药方式和
药物浓度，在控制感染的同时防止耐药突变株的产
生，这也正是本课题须要继续探讨的方向。
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（编辑：邓响潮）
图 4 绿原酸-ATCC44102菌落恢复生长曲线
Figure 4 The recovery rate curve of CGA against E. coli（ATCC44102）
菌
落
恢
复
生
长
比
例
1.E+00
1.E- 01
1.E- 02
1.E- 03
1.E- 04
1.E- 05
1.E- 06
1.E- 07
1.E- 08
1.E- 09
1.E- 10
0 2 4 6 8 10 12
绿原酸 /mg·mL-1
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