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药
研
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杏香兔耳风中 5 种单体
对 LPS诱导 ＲAW264． 7 细胞内 NO生成的影响*
★ 谢斌1＊＊ 吴蓓2 欧阳辉1 黎田儿1 李艳1 张武岗1 杨世林1 冯育林1＊＊＊ (1．江西中医药大学中
药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330006;2．南昌市食品药品检验所 南昌 330038)
摘要:目的:观察从杏香兔耳风中分离得到的木犀草素、木犀草苷、绿原酸、3，5 －二咖啡酰基奎宁酸(3，5 － DCQA)和 4，5 －二
咖啡酰基奎宁酸(4，5 － DCQA)5 种中药单体对 LPS诱导的炎症状态中细胞内 NO含量的影响，从而初步筛选出具有抗炎作用
的中药单体。方法:以 LPS诱导 ＲAW264． 7 巨噬细胞建立炎症反应模型，采用木犀草素等 5 种不同中药单体预处理细胞，另
设正常对照组及 LPS单独处理组，采用 Griess试剂法分别测定各组 NO生成含量。结果:5 种单体均能降低 LPS诱导的炎症状
态下 ＲAW264． 7 细胞内 NO 的生成，且与各单体的浓度相关。结论:杏香兔耳风中 5 种单体可明显降低 LPS 诱导的
ＲAW264. 7 细胞 NO的含量从而发挥抗炎作用。
关键词:杏香兔耳风;5 种单体;NO;炎症
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:B
炎症是十分常见而又重要的基本病理过程。炎
症不同于感染，但很多炎症又是基于感染而发生的。
在临床治疗上，抗炎药物也是仅次于抗感染药物的
第二大类药物。许多传统中药都有显著的抗炎作
用，从中分离得到的中药单体也具有很好的抗炎作
用［1 － 2］。中药单体成分简单，作用机制及其毒副作
用易明确等优点，使得开发安全有效的中药制剂成
为治疗炎症的研究热点。本实验拟通过 LPS 诱导
ＲAW264． 7 巨噬细胞建立炎症反应模型［3］，观察从
杏香兔耳风中分离得到的木犀草素、木犀草苷、绿原
酸、3，5 －二咖啡酰基奎宁酸(3，5 － DCQA)和 4，5 －
二咖啡酰基奎宁酸(4，5 － DCQA)五种中药单体对
LPS诱导的炎症状态中细胞内 NO 含量的影响，以
期初步筛选出具有抗炎作用的中药单体。
1 材料与方法
1． 1 药品与试剂 五种中药单体木犀草甘、木犀草
素、绿原酸、3，5 －二咖啡酰基奎宁酸、4，5 －二咖啡
酰基奎宁酸均由本实验室自制，纯度大于 98%。
Griess试剂由上海碧云天生物科技有限公司提供，
货号为 S0021。ＲPMI1640 购自 Hyclone 公司，货号
为 SH30809。FBS 购自 BinInd 公司，货号为 04 －
001 － EA。
1． 2 主要仪器 CO2 细胞培养箱(Thermo Scientific
8000) ，低速离心机(上海卢湘仪 TDZ4B － WS) ，分
光光度计(BIO － ＲAD SmartSpench plus) ，倒置显微
镜(Olympus IX71)。
1． 3 细胞培养及处理 ＲAW264． 7 小鼠单核 /巨噬
细胞系由本实验室提供，置于 37℃、5% CO2 的培养
箱中孵育。于 96 孔细胞培养板中每孔加入 200μL
细胞悬液，2 × 104 个细胞 /孔，将培养板置于 CO2 培
养箱中培养 12h。分别加入 2，4，6mg /mL LPS
100μL，再于每个浓度的 LPS 中分别加入不同浓度
的五种单体，每个单体设 4 个浓度(100，200，400，
800μg /mL) ，每个浓度设 3 给平行孔，另设正常对照
孔。加药后，培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置
于 37℃CO2 培养箱中继续培养 24h。
1． 4 NO 含量检测 吸取培养液上清，根据 Geriss
说明书进行 NO 含量检测，用分光光度计于 540nm
处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算样品中 NO含
量。
1． 5 统计学处理 实验数据用 珋x ± s 表示，用单因
素方差分析法(ANOVA)进行分析，组间显著性差异
用 Bonferroni test。P ＜ 0． 05 表示有显著性差异。
2 结果
2． 1 2 mg /mL LPS 诱导 ＲAW264． 7 细胞 NO 生成
的影响 表 1 结果显示，正常 ＲAW264． 7 细胞内
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基金项目:国家自然科学基金项目(81560636，81102787) ;江西省自然科学基金重点项目(20133ACB21005)。
第一作者:谢斌(1975—) ，男，副教授。研究方向:中医药抗感染。E － mail:331080826@ qq． com。
通信作者:冯育林，男，教授。研究方向:中药化学成分。E － mail:fengyulin2003@ hotmail． com。
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NO生成很低，当加入 LPS 诱导后，ＲAW264． 7 细胞
内 NO的生成显著增加(P ＜ 0． 01)。经 LPS 处理后
分别给予五种单体，检测其 NO含量，实验数据表明
加入单体后细胞内 NO 含量显著降低(P ＜ 0． 01) ，
但多数仍高于正常对照组(P ＜ 0． 01)。表明这五种
单体在一定程度上能够部分抑制 LPS 诱导的 NO生
成，且在本实验浓度范围内，各单体浓度越大，NO
含量越低。此外，当单体浓度增加为 800μg /mL 时，
绿原酸和 3，5 － 二咖啡酰基奎宁酸处理的细胞内
NO含量低于正常组，推测随着单体浓度的增大，NO
含量可能低于正常细胞内 NO的含量。表明这五种
单体能够部分甚至完全抑制炎症状态下单核 /巨噬
细胞内 NO的生成，且该抑制作用与其浓度有关。
2． 2 4 mg /mL LPS 诱导 ＲAW264． 7 细胞 NO 生成
的影响 由表 1 结果可知，当 LPS 为 2 mg /mL 时，
木犀草素等五种单体能够降低 NO 的生成，那么我
们考虑当增加 LPS 的浓度时，这五种单体与 NO 的
关系又是如何?实验结果如表 2 所示，当 LPS 的浓
度上升为 4 mg /mL时，细胞内 NO 的生成也随之相
应上升，较正常组有显著性差异(P ＜ 0． 01)。同样，
经 LPS处理后分别加入五种单体，从表中可以看出
细胞内 NO的生成减少，且单体浓度越大，NO 含量
越低(P ＜ 0． 01)。除 800 μg /mL 的 3，5 － DCQA 组
细胞内 NO 含量降至正常外，其余均高于正常组。
表明当 LPS浓度增大时，木犀草素等 5 种单体同样
能部分甚至完全抑制细胞内 NO 的生成，且单体浓
度越大抑制作用越强。
2． 3 6 mg /ml LPS诱导 ＲAW264． 7 细胞 NO生成的
影响 为了进一步验证以上实验结果，我们将 LPS
的浓度增加为 6mg /mL，实验结果与上述一致。如
表 3 数据所示，当 LPS 浓度上升为 6mg /mL 时，
ＲAW264． 7 细胞内 NO 生成显著增加(P ＜ 0． 01)。
同样，在 LPS处理后给予五种单体也能降低细胞内
NO的生成，但仍显著高于正常水平(P ＜ 0． 01)。此
外，从表中还可以看出单体浓度越大，NO 含量越
低。表明在高浓度的 LPS诱导的炎症状态下，木犀
表 1 2 mg /mL LPS诱导 ＲAW264． 7 细胞 NO生成的影响
组别
细胞内 NO含量
100μg /mL 200μg /mL 400μg /mL 800μg /mL
正常对照组 2． 40 ± 0． 01
单独 LPS组 5． 72 ± 0． 02*
LPS +木犀草素 4． 79 ± 0． 04* # 4． 65 ± 0． 03* # 4． 28 ± 0． 01* # 3． 41 ± 0． 01* #
LPS +木犀草苷 4． 44 ± 0． 09* # 4． 08 ± 0． 02* # 3． 72 ± 0． 02* # 3． 14 ± 0． 05* #
LPS +绿原酸 4． 81 ± 0． 03* # 4． 08 ± 0． 03* # 3． 63 ± 0． 03* # 2． 26 ± 0． 02#
LPS + 3． 5 － DCQA 5． 27 ± 0． 03* # 5． 06 ± 0． 01* # 4． 80 ± 0． 02* # 2． 29 ± 0． 02#
LPS + 4． 5 － DCQA 4． 78 ± 0． 01* # 4． 65 ± 0． 03* # 4． 12 ± 0． 02* # 2． 85 ± 0． 01* #
注:与正常对照组比较，* P ＜ 0． 01;与单独 LPS组比较，#P ＜ 0． 01。
表 2 4 mg /mL LPS诱导 ＲAW264． 7 细胞 NO生成的影响
组别
细胞内 NO含量
100μg /mL 200μg /mL 400μg /mL 800μg /mL
正常对照组 2． 40 ± 0． 01
单独 LPS组 8． 10 ± 0． 02*
LPS +木犀草素 6． 71 ± 0． 09* # 6． 19 ± 0． 03* # 5． 36 ± 0． 02* # 4． 90 ± 0． 05* #
LPS +木犀草苷 6． 07 ± 0． 02* # 5． 18 ± 0． 02* # 4． 46 ± 0． 02* # 3． 82 ± 0． 07* #
LPS +绿原酸 6． 56 ± 0． 02* # 5． 42 ± 0． 03* # 3． 93 ± 0． 04* # 3． 05 ± 0． 02* #
LPS + 3． 5 － DCQA 7． 61 ± 0． 01* # 6． 94 ± 0． 01* # 4． 53 ± 0． 03* # 2． 42 ± 0． 01
LPS + 4． 5 － DCQA 6． 88 ± 0． 26* # 6． 27 ± 0． 02* # 4． 25 ± 0． 02* # 3． 42 ± 0． 01* #
注:与正常对照组比较，* P ＜ 0． 01;与单独 LPS组比较，#P ＜ 0． 01。
表 3 6mg /mL LPS诱导 ＲAW264． 7 细胞 NO生成的影响
组别
细胞内 NO含量
100μg /mL 200μg /mL 400μg /mL 800μg /mL
正常对照组 2． 40 ± 0． 01
单独 LPS组 29． 7 ± 0． 02*
LPS +木犀草素 18． 69 ± 0． 01* # 16． 46 ± 0． 02* # 13． 43 ± 0． 06* # 12． 39 ± 0． 02* #
LPS +木犀草苷 17． 52 ± 0． 16* # 13． 82 ± 0． 05* # 12． 41 ± 0． 03* # 8． 84 ± 0． 08* #
LPS +绿原酸 21． 89 ± 0． 01* # 18． 25 ± 0． 04* # 14． 75 ± 0． 03* # 7． 02 ± 0． 03* #
LPS + 3． 5 － DCQA 25． 70 ± 0． 02* # 20． 98 ± 0． 03* # 16． 38 ± 0． 02* # 7． 37 ± 0． 01* #
LPS + 4． 5 － DCQA 22． 73 ± 0． 02* # 20． 17 ± 0． 03* # 15． 74 ± 0． 07* # 6． 23 ± 0． 02* #
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江西中医药 2015 年 12 月第 12 期总 46 卷第 396 期
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草素等五种单体能部分但不能完全抑制 NO 的生
成。
以上实验数据表明，当 LPS 浓度为 2mg /mL、
4mg /mL或 6mg /mL 时，木犀草素、木犀草苷、绿原
酸、3，5 － DCQA 和 4，5 － DCQA 都能呈浓度依赖的
抑制 LPS诱导 ＲAW264． 7 细胞内 NO的生成。表明
这五种单体具有一定程度的抗炎作用。
3 讨论
NO是介导炎症反应的关键因子，可杀灭侵入
机体的病原微生物，维持机体正常的免疫防御功能。
各种动物组织和细胞内 NO的合成均由一氧化氮合
成酶(NOS)催化 L － 精氨酸形成。NOS 有三种亚
型，其中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)是合成 NO
的唯一途径。少量的 NO是维持正常细胞功能必不
可少的物质，然而研究表明 LPS 和 /或细胞因子等
刺激因子能诱导单核巨噬细胞高表达 iNOS 从而合
成过量的 NO，造成细胞毒性和组织损伤等一系列
炎症反应［5 － 7］。LPS 是格兰阴性菌致病的主要因
素，能通过与细胞膜受体相互作用，作用于宿主细
胞，并通过细胞内信号传递级联基因表达发生变
化［4］。LPS能够刺激体内多种细胞合成和释放众多
内源性生物活性因子，如 NO、PGE2、TNF － a、IL － 6
等，导致全身炎症反应发生。
本实验选取了五种中药单体检测其抗炎活性，
分别是木犀草素、木犀草苷、绿原酸、3，5 － DCQA 和
4，5 － DCQA。其中木犀草素和木犀草苷均属黄酮
类化合物，是天然黄酮的代表性物质。木犀草素具
有抗肿瘤、保护心血管、调节免疫系统和抗炎等多种
药理学作用［8 － 11］。木犀草苷，又名木犀草素 － 7 － O
－葡萄糖苷，木犀草苷也是重要的生物活性物质，具
有抗肿瘤、抗氧化、消炎和抗病毒等多种活性［12 － 14］。
绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中合成的一种苯丙
类物质，也具有抗菌消炎、免疫调节、抗病毒、抗肿瘤
等多种药理学功能［15 － 16］。而 3，5 － DCQA 和 4，5 －
DCQA的活性目前尚不清楚。
本实验通过 LPS 诱导 ＲAW264． 7 巨噬细胞建
立细胞炎症反应模型，检测木犀草素等五种单体的
抗炎作用。实验结果表明，木犀草素、木犀草苷、绿
原酸、3，5 － DCQA 和 4，5 － DCQA 这五种单体均能
降低 LPS诱导的 ＲAW264． 7 细胞内 NO的含量。且
单体浓度越大，NO 的含量越低。表明这五种单体
均具有抗炎作用。另外实验结果还表明这五种中药
单体之间除个别外均具有显著性差异(P ＜ 0． 05) ，
但尚不能表明这五种单体有优劣之分。这些中药单
体有望成为在 NO 介导的相关疾病中发挥抗炎作
用。
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(收稿日期:2015-10-14)编辑:翟兴英
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