全 文 ：铁苋菜抗溃疡性结肠炎的有效成分
邓 莉 1, 2 , 李凤前 1 , 邹 豪 2 , 陈建明2 , 胡晋红 1＊
(1.第二军医大学长海医院药学部 ,上海 200433;2.第二军医大学药学院药剂教研室 ,上海 200433)
收稿日期:2006-09-17
作者简介:邓 莉(1973～ ),女 ,博士 ,讲师;研究方向:中药抗溃疡性结肠炎药物;电话:021-25074589转 802。
＊通讯作者:胡晋红 ,女 ,博士生导师 E-mail:hujh@smmu.edu.cn.
关键词:铁苋菜;溃疡性结肠炎;对羟基苯甲酸;香草酸;原儿茶酸;大鼠
摘要:目的:筛选铁苋菜抗溃疡性结肠炎的有效成分。方法:利用 TNBs诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型 , 以大鼠发生腹泻
与便血的个数 、大鼠结肠形态学改变 ,组织 MPO酶 、SOD、NO的水平作为指标 , 对铁觅菜各极性部位的药效进行考察 ,选
择最佳药效部位进行硅胶柱层析 ,分离化合物并进行化学结构的分析鉴定。结果:铁苋菜醋酸乙酯部位的药效较其它极
性部位显著 , 将该部位上硅胶柱层析进行梯度洗脱得到三个化合物 , 经光谱分析鉴定为对羟基苯甲酸甲酯 、香草酸和原
儿茶酸。结论:铁苋菜抗溃疡性结肠炎的活性物质集中在醋酸乙酯极性部位 , 可作进一步研究。
中图分类号:R285.6 文献标识码:A 文章编号:1001-1528(2007)07-0969-03
PolarcompoundsofAcalyphaaustralis.LonTNBS-inducedulcerativecolitis
DENGLi1, 2 , LIFeng-qian1 , ZOUHao2 , CHENJian-ming2 , HUJin-hong1＊
(1.DepartmentofPharmacy, ChanghaiHospital, SecondMilitaryMedicalUniversity, Shanghai200433 , China;2.ColgegofPharmacy, SecondMilitary
MedicalUniversity, Shanghai200433 , China)
KEYWORDS:Acalyphaaustralis.L;ulcerativecolitis;4-hydroxybenzoicacidmethylester;3-methoxy-4-
hydroxybezoicacid;protocatechuicacid;rat
ABSTRACT:AIM:ToinvestigatetheactivecompoundsofAcalyphaaustralis.Linthetreatmentofulcerative
colitis(UC)inrat.METHODS:GuidedbytheTNBS-inducedcolitismodel, theefectsofdiferentpolarextrac-
tionsoftheAcalyphadecoctionontheUCmodelwereevaluated.Thepharmacodynamicextractionswaspurifiedand
extractedbycolumnchromatographwithpetroleumether, ethylacetateandnormalbutanolinturn.Thechemical
structureofthecompoundswaselucidatedbyspectraanalysis.RESULTS:EthylacetateextractionsoftheAcalyph
decoctionwasthebestpolarcompoundsfortreatingUCandthreechemicalcompoundswereobtained:4-Hydroxy-
benzoicacidmethylester;3-methoxy-4-hydroxybenzoicacid;protocatechuicacid.CONCLUSION:Theactive
compoundsconcentrateontheethylacetateextract.Itisahopefulcompoundthatneedstobestudied.
慢性溃疡性结肠炎(UlcerativeColitisUC)是以
慢性迁延性的腹泻 、腹痛 、便血为主要症状的慢性非
特异性炎症性肠病 。在我国 ,此病的发病率呈逐年
上升的趋势 。铁苋菜 [ 1] ,是大戟科植物铁苋菜(Aca-
lyphaaustralisL)的全草 ,其味苦涩性平 ,具有清热
利水 ,杀虫止血的功效 ,在民间常用于治疗肠炎 、痢
疾 、腹泻。铁苋菜对 TNBS诱导的大鼠 UC模型具有
一定的治疗作用 [ 2] ,本实验利用 TNBS诱导的 UC
大鼠模型对铁苋菜的各极性部位进行药效考察 ,并
对药效显著部位进行化学成分的提取分离 。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康♂SD大鼠 70只 ,清洁级 , 180 ～ 200 g,购
于中国科学院上海实验动物中心 ,动物合格证号:
[ SYXK(沪)2002-0026] ,自由进食和饮水。
1.2 试剂与材料
铁苋菜购于上海杨浦中药饮片厂 , 批号为
[ 020313] ,经上海第二军医大学陈万生教授鉴定为
大戟科植物铁苋菜的干燥全草;TNBS购于 Sigma公
司 , 5 (w/v)水溶液 ,批号 [ 71K5009] ;还原性酚酞
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试剂;柳氮磺胺吡啶(SASP)为上海三维制药有限公
司生产 ,批号 [ 200304C28] ,用刀片轻轻刮去外层包
衣后 ,粉碎过 80目筛 ,称取一定量的粉末 ,加入蒸馏
水配成 0.1 g/mL的混悬液备用;髓过氧化物酶
(MPO)检测试剂盒购于南京建成生物工程有限公
司 ,批号 [ 20030704] ;
硅胶 H(200-300目)为青岛海洋化工厂产品;
HSHF254硅胶预制板为烟台硅胶开发试验厂产品 。
色谱溶剂系统:p.e.-EtOAc(10∶1)和 p.e.-EtOAc-
Acetone(9∶5∶2);TLC显色剂:20 H2SO4乙醇 ,碘
蒸气 ,碘化铋钾 ,所用化学试剂均为分析纯 。
1.3 仪器与设备
UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公
司);熔点测定仪 (天津分析仪器厂 RY-2型熔点
仪);BrukerVector22型红外光谱仪;BrukerDRX-
500型核磁共振仪;质谱仪:Mat-212磁式(EI-MS);
Q-Tofmicro(ESI-MS)。
1.4 动物模型的制备
取健康 SD大鼠 ,禁食不禁水 24h后 ,腹腔注射
2 的戊巴比妥 ,使大鼠轻微麻醉后 ,将直径 2 mm
的乳胶管经肛门轻轻插入大鼠体内大约 8 cm处 ,将
TNBS(125 mgTNBS/kg体重)的 50 乙醇溶液 ,用
注射器一次性注入到大鼠的肠腔内 ,将大鼠的尾部
提起 ,倒置 30 s,使造模剂充分渗入大鼠的肠腔 。
1.5 铁苋菜各提取部位的分离
取 5 kg铁苋菜中药饮片 ,浸泡 2 h后 ,加入 6倍
量的水 ,煎煮 2次 ,每次 1 h,趁热过滤 ,合并滤液 。
将滤液置于旋转蒸发仪浓缩 ,得密度为 1.101g/mL
的浓缩液 ,取浓缩液依次用石油醚 、醋酸乙酯 、水饱
和正丁醇进行萃取 ,药液:溶剂 =1∶2 ,每份药液连续
萃取 3次。最终得各提取部位溶液 ,于旋转蒸发仪
浓缩得各部位提取物 ,分别为铁苋菜水提取部位
(A)、石油醚部位(B)、醋酸乙酯提取部位(C)、正丁
醇提取部位(D)及萃后水层部位(E)。
1.6 动物分组及给药
随机取健康 SD大鼠 10只作为正常对照组 ,每
日灌胃与其它给药组同体积的生理盐水;将 TNBS
诱导的 UC模型大鼠随机分为 7组 ,每组 10只 ,分
别给予各极性部位提取物 ,连续给药 10d。
1.7 考察大鼠粪便
用潜血试剂检测大鼠粪便 ,记录大鼠发生腹泻
及便血的个数。
1.8 结肠组织肉眼损伤评分
各组大鼠给药 10 d后 ,过量注射戊巴比妥致
死 ,剖开大鼠的腹部 ,观察肠道大体改变 。将距肛门
10cm长的末端结肠取出 ,沿肠系膜纵行切开 ,用冰
生理盐水冲洗 ,用滤纸沾干水分后称质量。将黏膜
面向上展开 , 观察黏膜损伤并按照 Walace和
Keenan1990年的评分标准 [ 3] 进行评分:0.无炎症
和溃疡;1.局部充血但无溃疡;2.溃疡但无充血;3.
一处溃疡及炎症;4.两处或两处以上溃疡及炎症;5.
溃疡延伸超过 2 cm。同时取少量炎症部位的肠组
织 ,迅速放置在液氮罐中保存备用 。
1.9 铁苋菜各提取部位对 UC模型大鼠肠组织
MPO、SOD、NO水平的影响
从液氮罐中取出结肠组织 100mg,加入冰生理
盐水 ,在冰浴条件下 , 在组织匀浆器中匀浆 , 配成
10 及 1 的结肠组织匀浆 ,按照 MPO、SOD、NO检
测试剂盒说明书进行操作 ,测定 MPO、SOD、NO的
水平 。
1.10 对最佳药效部位进行化学成分分离与结构鉴
定
将最佳药效部位上硅胶柱 ,溶剂反复梯度洗脱 ,
并用薄层层析法进行监测。最后将所得化合物进行
光谱分析和结构鉴定。
2 结果
2.1 铁苋菜各提取部位对 UC模型腹泻与便血的
影响
结果见表 1。经方差分析可知 ,醋酸乙酯部位
给药组的大鼠在 1、7、10 d内发生腹泻与便血的个
数显著少于其它部位(P<0.05)。
2.2 铁苋菜各提取部位对 UC模型大鼠结肠形态
学的影响
各组大鼠给药 10 d后 ,解剖大鼠结肠进行肉眼
观察 ,按照 Walace和 Keenan1990年的评分标准对
各组大鼠结肠进行评分 ,并称量湿重 ,结果见表 2。
从表中看出 ,各提取部位中 ,灌胃醋酸乙酯提取
部位组的大鼠结肠损伤评分最低 ,结肠重量最轻与
水提取液无显著性差异(P>0.05)。
2.3 铁苋菜各提取部位对 UC模型大鼠结肠组织
MPO的影响
结果见表 3。从表中可见 ,与模型组相比 ,其降
MPO作用顺序为:醋酸乙酯部位 >正丁醇部位 >萃
后水层 >石油醚部位。
2.4 各组结肠组织 SOD及 NO的水平
结果见表 4。铁苋菜水提液醋酸乙酯部位给药
大鼠 SOD的升高以及 NO的降低最显著。
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Table.1 EffectofdifferentextractsofAcalyphaonthediarrheaandbloodystoolinTNBS-inducedcolitisrats
Group Dose/mg/kg
Numberofdiarhea/n
D1 D7 D10
Numberofbloodystool/n
D1 D7 D10
Normal 0 0 0 0 0 0
Model 10 6 4 10 4 3
A 325.00 10 2 1 10 2 0
B 1.00 10 7 6 10 5 3
C 15.20 10 1 0 10 0 0
D 53.10 10 3 1 10 3 2
E 245.70 10 3 1 10 2 0
SASP 300.00 10 1 1 10 4 2
Table.2 EffectofdifferentextractsofAcplyphaonthecolon
macroscopicdamagescoreandcolonwetweightin
TNBS-inducedcolitisrats( x±s, n=10)
Group Dose/mg/kgb.w
Macroscopic
damagescore
Colonwetweight
/mg/100gb.w
Normal 0 0.54±0.05
Model 3.84±1.21 1.03±0.22
A 325.00 2.56±0.77 0.82±0.20
B 1.00 3.77±1.34 1.03±0.75
C 15.20 2.63±0.67＊ 0.79±0.54＊
D 53.10 2.92±1.06 0.85±0.46
E 245.70 3.23±0.85 0.92±0.51
SASP 300.00 2.12±0.78 0.76±0.25
vsmodel:＊P<0.05;VsA, ＊P>0.05。
Table.3 EffectofdifferentextractsofAcalyphaonthe
MPOactivityincolonofTNBS-inducedcolitis
rats
Group Dose/mg/kgb.d MPO/U/g
Normal 0.27±0.14
Model 15.54±3.26
A 325.00 5.18±2.31
B 1.00 15.01±5.04＊＊
C 15.20 5.37±2.78＊
D 53.10 8.37±1.96＊＊
E 245.70 10.32±2.76＊＊
SASP 300.00 5.31±2.14
vsmodel, ＊P<0.05;VsC, ＊＊P<0.05。
Table.4 EffectofdifferentextractsofAcalyphaonSOD
activityandNOlevelincolontissueOfTNBS-in-
ducedcolitisrats
Group Dose/mg/kgb.w SOD/nU/mgprot NO/μmol/gprot
Normal 83.63±5.74 1.27±0.42
Model 74.37±5.38 4.51±1.13
A 325.00 117.48±8.16 2.13±0.32
B 1.00 77.14±4.46 3.97±0.76
C 15.20 101.35±11.25＊ 2.07±0.37＊
D 53.10 93.52±10.97 3.76±0.42
E 245.70 85.63±9.05 4.01±0.97
SASP 300.00 125.16±11.07 2.29±0.27
vsmodel, ＊P<0.05;VsD、E＊P<0.05。
2.5 对醋酸乙酯萃取部位进行化学成分分离及结
构鉴定
将醋酸乙酯萃取部位上硅胶柱 ,用石油醚 /醋酸
乙酯(10 /1)及石油醚 /醋酸乙酯 /丙酮(9/5/2)反复
洗脱 ,并通过调整比例不断增加洗脱剂的极性。用
硅胶薄层层析法进行监测 ,最终得到 3个化合物 ,重
结晶进行纯化后 ,进行光谱分析和结构鉴定 ,得到 3
个单体化合物 , C-2-1 ,对羟基苯甲酸甲酯 、C-2-2, 4-
羟基 -3-甲氧基苯甲酸 、C-2-3,原儿茶酸。
3 讨论
在前期工作中我们证实了铁苋菜对 TNBS诱导
的 UC大鼠模型具有一定的治疗作用 ,并且实验发
现铁苋菜具有升高 SOD及 GSH-Px、降低 MDA和
NO的抗氧化及抗 NO作用 。利用 TNBS诱导的 UC
大鼠模型对铁苋菜的药效物质基础进行追踪考察 ,
发现醋酸乙酯萃取部位的药效较为显著 ,对醋酸乙
酯部位进行柱层析梯度洗脱 ,分离并结构鉴定得到
3个单体化合物 ,分别为对羟基苯甲酸甲酯 、香草酸
和原儿茶酸。这三个化合物都属于 C6C1型天然酚
酸类化合物 ,此类化合物是植物发挥抗氧化性的主
要物质基础之一。
参考文献:
[ 1] 南京中医药大学主编.中药大词典 [下册 ] [ M] .上海:上海科
技出版社 , 2000, 1853-1855.
[ 2] 邓 莉 ,胡晋红.铁苋菜水提物对 TNBS诱导的溃疡性结肠炎
大鼠模型的防治作用 [ J] .第二军医大学学报 , 2005, 26(5):
535-538.
[ 3] WalaceJL, KeenanCM.Anoralyactiveinhibitorofleukotriene
synthesisaccelerateshealinginaratmodelofcolitis[ J] .Am J
Physiol, 1990, 258(4Ptl):G527-534.
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