全 文 ：第 32 卷 第 12 期
2 0 1 4年 1 2月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 32 No． 12
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DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2014． 12． 069
六棱菊总黄酮对溃疡性结肠炎的作用及其机制
赵晓彬1，徐晓东2
(1．铜川市人民医院中医科，陕西 铜川 727000;2．浙江省中西医结合医院药剂科，浙江 杭州 310003)
摘 要:目的:研究六棱菊总黄酮(LAF)对溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型的作用及其可能的分子生物学机制。
方法:采用三硝基苯磺酸(TNBS)塑造 UC 大鼠模型，并予以不同剂量的 LAF 进行干预，用 HE 染色病理学检侧
LAF对 UC的疗效，用 FCM检测 LAF对大鼠 UC模型结肠黏膜上皮细胞的凋亡率，用 DNA琼脂糖电泳检测结肠
黏膜细胞凋亡的生化特征，用 western blot检测结肠黏膜细胞 Bcl － 2、Bax、Cyt － c、Caspase － 9、Caspase － 3 蛋白表
达情况。结果:LAF对 UC大鼠模型有着显著的疗效，经不同浓度的 LAF作用结肠黏膜细胞后，与模型组比较，细
胞凋亡数目减少，组间有统计学意义(P ＜ 0． 05)，琼脂糖电泳 DNA典型的梯形条带消失，伴随 Bcl － 2 蛋白表达上
调，Cyt － c、Caspase － 9、Caspase － 3 蛋白表达下调(P ＜ 0． 05) ，Bax蛋白表达无明显变化(P ＞ 0． 05) ，而 Bcl － 2 /Bax
比值下降(P ＜ 0． 05)。结论:LAF对 UC大鼠模型有着显著的疗效，其机制可能通过线粒体凋亡途径抑制凋亡相
关。
关键词:六棱菊总黄酮;溃疡性结肠炎;凋亡
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2014)12-3028-03
Effects of Laggera Alata Flavone on Ulcerative Colitis and Its Mechanism
ZHAO Xiaobin1，XU Xiaodong2
(1． Department of Traditional Chinese Medicine，The People’s Hospital of Tongchuan，Tongchuan 727000，Shaanxi，China;
2． Department of Pharmacy，Integrative Medicine Hospital of Zhejiang，Hangzhou 310003，Zhejiang，China)
Abstract:Objective:The aim of this study was to investigate the effects of laggera alata flavone (LAF)on ulcerative
colitis of rat model and its possible molecular mechanism． Methods:The rat models of UC were established with trinitro-
benzene acid (TNBS)and were administrated with different doses of LAF． The tissues of colonic mucosa epithelium were
examined using HE staining pathology and the apoptotic rate of colonic mucosa epithelial cells were detected by FCM．
The biochemical characteristic of apoptosis on DNA was evaluated by agarose electrophoresis and the Bcl － 2，Bax，Cyt －
c，Caspase － 9 and Caspase － 3 expressions of apoptosis related proteins were assessed by Western blot． Ｒesults:The rat
models of UC were successfully established and LAF had significantly therapeutic effects，which was proved by HE stai-
ning pathology． LAF could dramatically reduce apoptosis of colonic mucosa epithelial cells and there were significant
difference between LAF group and model group on the apoptotic rate (P ＜ 0． 05)． The typical ladder － shaped band de-
creased in a dose － dependent manner，accompanied with the expression of bcl － 2 protein up － regulation (P ＜ 0． 05)and
Cyt － c，Caspase － 9，Caspase － 3 and the ratio of bcl － 2 /bax had a down － regulation (P ＜ 0． 05)while the Bax protein
slightly altered (P ＞ 0． 05)． Conclusion LAF had obvious therapeutic effect on rat model of UC and its mechanism may
be inhibiting the colonic mucosa epithelial cells via mitochondrial apoptosis pathway．
Key words:LAF;UC;apoptosis
收稿日期:2014 － 06 － 27
作者简介:赵晓彬(1979 －)，男，陕西渭南人，主治医师，学士，研究
方向:中西医结合治疗结肠疾病。
六棱菊(Laggera alata)系菊科六棱菊属草本植物，广
泛分布于我国长江流域以南及西南部，棱菊具有抗菌消炎、
清热解毒等功效，在民间广泛用来治疗上呼吸道感染、支气
管炎、关节炎痛等炎性疾病［1］。六棱菊总黄酮(Laggera ala-
ta flavone，LAF)是从六棱菊中提取出的黄酮类化合物，有
研究报道具有抗菌，抗病毒、抗肿瘤等作用［1］。溃疡性结
肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因不明的直肠和结肠
特异性炎性疾病，目前药物治疗 UC不仅不良反应多，疗效
不稳定，而且容易复发［2］，故开发新型抗 UC药物便成了临
床科研工作者的热门课题。本研究建立 SD大鼠 UC模型，
予以不同浓度 LAF，观察其对 UC的疗效及其可能机制。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
LAF 由陕西中医学院药理教研室提取、分离、纯化获
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得。三 硝 基 苯 磺 酸 (TNBS) (Sigma 公 司，批 号 为
068k500) ，琼脂糖为(日本和光制药工业株式会社)。兔抗
Bax单克隆抗体、鼠抗 Bcl － 2、Bax单克隆抗体、鼠抗 Cyt － c
单克隆抗体、鼠抗 Caspase － 9 和 Caspase － 3 多克隆抗体、
GAPDH抗体(Beyotime 公司)。SD 大鼠，清洁级，雌雄各
半，体重 220 ～ 245 g，由北京维通利华实验动物技术公司提
供(合格证:0093102，许可证:SCXK(京)2012 － 0011)，于无
菌屏蔽环境(百级无菌室)中饲养。
1． 2 仪器与设备
流式细胞仪(型号:Epics － XL)为美国 Coulter 公司生
产，结果采用 Multicycle软件分析;垂直电泳仪和电泳槽为
美国 BIO － ＲAD 公司产品，结果采用 Alpha Imager 2200 软
件分析。
1． 3 实验方法
1． 3． 1 溃疡性结肠炎大鼠动物模型的建立 SD 大鼠 UC
模型塑造采用 TNBS 灌肠法［3］，取 3 月龄 SD 大鼠 25 只禁
食 24 h，均采用乙醚麻醉，麻醉满意后，用大鼠灌胃针头缓
缓从肛门插入约为 8 cm，以 4 mL /kg 的剂量缓慢轻柔地推
入 TNBS溶液(含 25 g /L TNBS 和体积分数 50%乙醇)，捏
紧肛门平放 5 min，UC大鼠造模完成，术后常规饲养，另外
取 5 只 3 月龄 SD大鼠作为正常对照组。
1． 3． 2 给药方法与标本留取 造模成功后第 3 天，随机
将大鼠为模型对照组，LAF(100、200、400 mg /kg)实验组
和柳氮磺胺吡啶(SASP)阳性药物对照组(200 mg /kg)，并
按上述剂量给药，正常对照组及模型对照组给等容积蒸馏
水，每天给药 1 次，连续 10 d，于末次给药 24 h后，脱颈椎
法处死大鼠，取距肛门 8 cm 结肠，沿纵轴剪开，肠腔用 4
℃的 PBS清洗干净［4］。刮取肠黏膜组织，用眼科剪反复
剪碎组织块后，用 200 目尼龙网过滤 2 次，制成单细胞悬
液，备用。
1． 3． 3 HE染色病理学 于无菌状态下取各组大鼠结肠黏
膜组织约 1 cm × 1 cm，用 10%甲醛固定，常规脱水及石蜡
包埋，以 4 μm连续切片，HE染色镜下观察 SD大鼠结肠黏
膜上皮组织的病理学改变，评价 LAF 对 UC 大鼠模型结肠
黏膜的病理学效果。
1． 3． 4 FCM实验 取备用 UC 大鼠模型结肠黏膜上皮单
细胞，计数 1 × 106细胞悬液，用 PBS清洗 2 遍后，加入 4 ℃
的 75%乙醇混匀固定，4 ℃过夜后 PI 避光染色 30 min，然
后进行流式细胞仪检测［5］，以上实验重复 3 次。
1． 3． 5 DNA琼脂糖凝胶电泳实验 取备用 UC 大鼠模型
结肠黏膜上皮单细胞，加入细胞裂解液裂解细胞及细胞核，
离心、除沉，加 ＲNA酶，提取细胞 DNA，取 10 μg 定量样品
与适量加样缓冲液混匀后，用 1． 5%琼脂糖凝胶在 50 V 恒
压下电泳，EB染色，紫外透射反射仪下检测，并用自动成像
系统(Polaroid)拍照［6］。
1． 3． 6 western blot 实验 取 UC 大鼠模型结肠黏膜上皮
单细胞，加入细胞裂解液冰面裂解提取蛋白，取 30 μg定量
样品用 SDS － PAGE电泳分离后将蛋白转移至 PVDF膜上，
再用 5%脱脂牛奶 － TBST室温摇床封闭 2 h，一抗于 37 ℃
孵育 3 h，二抗于 37 ℃孵育 1 h，ECL发光剂激发荧光，压片
显影定影［7］。结果用灰度扫描仪处理分析。
1． 4 统计学分析
实验资料用珋x ± s表示，用 SPSS 13． 0 软件行 One － Way
ANOVA分析，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 HE染色病理学检测 LAF 对 UC 大鼠模型的治疗效
果
正常组大鼠结肠黏膜上皮完整，腺体排列规则，层次清
晰，无炎细胞浸润及溃疡形成;模型组大鼠结肠黏膜上皮细
胞严重缺失，腺体排列紊乱，部分消失，黏膜层及黏膜下层
有大量炎性细胞浸润，充血水肿明显，有溃疡形成。与模型
组相比，随着 LAF浓度的增大，各组大鼠结肠黏膜充血水
肿渐趋减轻，上皮缺失渐趋减少，腺体结构渐趋完整，炎症
细胞浸润渐趋减少。其中以 400 mg /kg LAF 的效果和 200
mg /kgSASP的效果相近似，见插页ⅩⅥ图 1。
2． 2 LAF对 UC大鼠模型结肠黏膜上皮细胞的凋亡率
正常组大鼠结肠黏膜上皮仅有少数细胞发生凋亡，凋
亡率为 4． 2%;而模型组黏膜上皮细胞大量凋亡，凋亡率为
50． 2%;经不同浓度的 LAF 作用后，黏膜上皮细胞凋亡率
明显减少，凋亡率随浓度依赖性降低，凋亡率分别为
35. 6%、24． 8%和 12． 7%，与模型组比较，组间有统计学意
义(P ＜ 0. 05);而经 SASP 作用后的黏膜细胞凋亡率为
10. 5%，与模型组比较，差异有显著统计学意义(P ＜
0． 01)，与 400 mg /kg的 LAF作用效果相当，差异无统计学
意义(P ＞ 0． 05) ，见插页ⅩⅥ图 2。
2． 3 LAF对 UC大鼠模型结肠黏膜上皮细胞凋亡 DNA 的
梯形条带
凋亡特异性的生化特征是核 DNA 在核小体连接处被
切断，形成 180 ～ 200 bp或其整数倍大小的 DNA片段，在琼
脂糖凝胶电泳上表现为梯状条带。本研究结果显示不同浓
度 LAF作用于 UC大鼠模型结肠黏膜上皮细胞后，模型组
和低剂量组均出现 DNA 琼脂糖电泳均出现了典型的梯状
条带，而经过 LAF中高剂量组作用的结肠黏膜上皮细胞的
梯形条带不明显，本研究结果进一步证实了 UC 肠黏膜细
胞发生凋亡，结果与 FCM实验结果相近似，见插页ⅩⅥ图 3。
2． 4 LAF对 UC大鼠模型结肠黏膜上皮细胞凋亡相关蛋
白表达
模型组黏膜细胞的 Bcl － 2 蛋白表达上调，经 LAF作用
后 Bcl － 2 蛋白表达显著降低，组间差异有统计学意义(P ＜
0． 05);而 SASP 对 bcl － 2 蛋白的下调率和 400 mg /kg LAF
相当，两组间比较，差异无统计学意义(P ＞ 0． 05) ;而各组
间 Bax蛋白表达没有变化(P ＞ 0． 05)，模型组 Bcl － 2 /Bax
比值上调，经 LAF作用后，Bcl － 2 /Bax比值下降，与模型组
比较，组间有统计学意义(P﹤ 0． 05)。模型组黏膜细胞的
Cyt － c、Caspase － 9 和 Caspase － 3 蛋白表达上调，经 LAF作
用后 Cyt － c、Caspase － 9 和 Caspase － 3 蛋白表达均显著降
低，组间差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)。而 SASP 对 Cyt －
c、Caspase － 9 和 Caspase － 3 蛋白的下调率与 400 mg /kg
LAF相当，两组间比较，差异无统计学意义(P ＞ 0． 05)。见
插页ⅩⅦ图 4。
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3 讨 论
六棱菊是一种传统中药材，具有抗菌消炎、清热解毒等
药理学效应，在民间六棱菊以单方或复方的形式广泛地用
于治疗上呼吸道感染、支气管炎、关节炎痛和疟疾等炎性疾
病，药理作用明显，而未见不良反应，深受传统医药临床工
作者和患者的亲睐。现代药理学研究表明，六棱菊的主要
药效成份为黄酮类和倍半萜类化合物［1］;六棱菊总黄酮
(Laggera alata flavone，LAF)是从六棱菊中提取出的黄酮类
化合物，有研究报道具有抗菌，抗病毒、抗炎、保肝、抗肿瘤、
调节免疫等功能［2］，然而 LAF 的抗炎机制尚未见报道，因
此本研究建立 SD大鼠 UC 模型，予以不同浓度 LAF，观察
其对 UC的疗效及其可能的分子生物学机制。
细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序
而导致的细胞死亡，是细胞的一种程序性死亡的形式之一，
凋亡在生物胚胎发生发育，成熟细胞新旧交替，激素依赖性
生理退化，自身免疫性疾病，肿瘤的发生发展有密切的联
系，凋亡是多因素、多阶段和多基因严格控制的过程，现在
研究细胞凋亡控制途径主要有两条，一条是死亡受体介导
的外源性凋亡通路，另一条是线粒体途径介导的内源性凋
亡通路［5］。Bcl － 2 家族成员通过调控线粒体信号转导系
统而调控内源性凋亡途径，其中 Bcl － 2 蛋白和 Bax蛋白是
Bcl － 2 家族成员中两个重要的成员，共同组成调控 Cyt － c
的释放通道，Bcl － 2 蛋白具有抑制 Cyt － c 释放的功能，而
Bax则促进 Cyt － c释放，Bcl － 2 /Bax 决定了线粒体外膜的
通透性和阻止细胞色素 c 的释放的量［6 － 7］;Cyt － c 是细胞
线粒体凋亡途径的关键，Cyt － c 进入胞浆后，即与 Apaf －
1、ATP /dATP结合成凋亡体复合物［8］，凋亡体复合体进而
激活 Caspase － 9 蛋白，而 Caspase － 9 蛋白可以通过水解
Caspase － 3 前体蛋白［9］，而激活 Caspase － 3 蛋白，而
Caspase － 3 蛋白是细胞凋亡的执行者，它可以直接降解细
胞内的结构蛋白和功能蛋白引起细胞凋亡，可以使细胞质、
细胞核、细胞骨架的重要蛋白降解失活，而导致细胞发生凋
亡［10］。本研究表明，UC 模型大鼠结肠黏膜上皮细胞大量
发生凋亡，而经不同浓度的 LAF作用后，UC模型大鼠症状
明显好转，伴随着结肠黏膜上皮细胞凋亡数目大幅度的减
少，与模型组比较差异有明显的统计学意义(P ＜ 0． 05);同
时调控内源性凋亡途径的线粒体途径的关键蛋白 Bcl － 2 表
达下调(P ＜0． 05)，而 Cyt － c、Caspase －9和 Caspase －3蛋白
表达上调(P ＜0． 05) ，同时 Bcl －2 /Bax比值降低(P ＜0． 05) ，
提示 LAF对 UC大鼠模型的治疗效用可能与其抑制内源性
线粒体凋亡途径引起结肠黏膜上皮细胞凋减少相关。
综上所述，LAF对 UC有着显著的治疗效用，其作用机
制可能与其抑制结肠黏膜上皮细胞凋亡发生有关，这为我
们从生物医学角度治疗 UC提供理论依据是实验数据;LAF
是从传统中药材中提取，药效显著，而无不良反应，具有广
泛的开发前景，但是相关研究还的继续深入，尤其是 LAF
抑制 UC黏膜上皮细胞的凋亡其它相关机制需要进一步深
入研究探讨。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
803 － 809．
“临时抱佛脚”效率高
“临时抱佛脚”的确很有用。美国《医药日报》称，德国
研究发现，压力可提高学习效率。
德国鲁尔大学认知神经科学研究所的科学家将 80 名
参试者分成两组。40 名参试者服用可阻止盐皮质激素受
体激活的药物螺内酯，其余人服用安慰剂。他们从两组中
分别随机抽取 20 人参加压力测试。之后，所有参试者接受
学习能力测试。科学家发现，压力会迫使参试者大脑转为
潜意识学习模式，而服用螺内酯的参试者则较少转为潜意
识学习模式。
研究负责人拉尔斯·施瓦本博士说，压力环境下，肾上
腺皮质分泌盐皮质激素受体，调动大脑的意识和潜意识机
制，双管齐下，增强记忆。
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