全 文 ：收稿日期:2010-11-02;　修订日期:2011-01-30
基金项目:国家自然科学基金(No.30860365)
作者简介:周　萍(1972-),女(汉族),云南大理人 ,现任大理学院副教授 ,
硕士学位 ,主要从事药品质量控制的研究工作.
＊通讯作者简介:刘光明(1953-), 男(汉族),云南泸西人 , 现任大理学院
教授 ,硕士学位 ,主要从事天然药物的研究和开发工作.
云南松松塔木质素 -糖复合物中的糖含量测定
周　萍 ,林　樊 ,刘　洁 ,吕永俊 ,李好枝 ,刘光明＊
(大理学院·药学院 ,云南 大理　671000)
摘要:目的 测定云南松松塔木质素 -糖复合物中的糖含量。方法 采用热水 、碱水依次提取 ,乙醇分级沉淀的方法提取
出木质素 -糖复合物 , 采用苯酚 -硫酸法在波长 485.4 nm处进行了糖含量的测定。结果 求得标准曲线的回归方程为
Y=0.055 2X+0.014 1(r=0.999 4)。平均回收率为 100.4 %(RSD=0.40 %)。 4种样品 C, D, E, F的糖含量分别为
17.08 %, 17.51 %, 28.38 %, 23.67%。结论 实验方法简便易行 , 准确度高 ,重复性好。
关键词:云南松松塔;　木质素-糖复合物;　苯酚-硫酸法
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.08.008
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2011)08-1820-02
DeterminationofCarbohydrateContentinLignin-CarbohydrateComplexfromPine
ConeofPinusyunnanensisFranch
ZHOUPing,LINFan, LIUJie,LVYong-jun,LIHao-zhi, LIUGuang-ming＊
(ColegeofPharmacology, DaliUniversity, Dali, Yunnan671000, China)
Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentofcarbohydrateinlignin-carbohydratecomplexfrompineconeofP.yunnanensis
Fr.MethodsLignin-carbohydratecomplexwasextractedfrompineconeofP.yunnanensisFr.withthemethodofhotwaterfol-
lowedbyalkalinesolventextractionandfractionalprecipitationwithethanol.Thecontentofcarbohydratefractioninlignin-carbo-
hydratecomplexwasmeasuredbyphenol-sulfuricacidmethodat485.4nm.ResultsTheregressionequationwasY=0.055 2X
+0.014 1(r=0.999 4).Theaveragerecoverywas100.4 % (RSD=0.40%).ThecarbohydratecontentsinsampleC, D, E, F
were17.08%, 17.51%, 28.38% and23.67%, respectively.ConclusionThemethodissimple, accurateandreproducible.
Keywords:PineconeofP.yunnanensisFr;　Lignin-carbohydratecomplex;　Phenol-sulfuricacidmethod
　　松科松属(Pinus)植物全世界约 100种 , 分布于北半球至北
极圈 , 在热带和亚热带地区只生长于山地。我国有 22种 , 10个
变种 , 另引进 16种及两个变种 , 合计五十余种 , 分布极广 [ 1] 。全
国常见的松树约 18种 , 主要分布在云南的云南松 P.yunanensis
Fr.资源十分丰富 ,每年至少有上万吨的云南松松塔被农民当作
燃料烧掉 [ 2] 。
国外学者研究发现松塔的提取物具有抗肿瘤 、抗病毒 、抗
菌 、增强免疫力等生物活性 [ 3] 。 国内学者发现红松与油松松塔
及松子壳均有抗癌活性 [ 4] 。为了进一步开发利用云南松松塔 ,
实验测定了云南松松塔有效成分木质素 -糖复合物中的糖含
量 。
1　仪器与材料
1.1　仪器与试剂 TU1901型紫外 -可见分光光度计(北京普析
通用仪器有限责任公司), AL240-IC电子天平 [梅特勒 -托利多
仪器(上海)有限公司 ] , 松塔多糖自制 , 葡萄糖 (AR含量
99.00%), 95 %乙醇 、苯酚 、浓硫酸 、二甲基亚砜均为分析纯。
1.2　药材 松塔于 2009-09采集于大理白族自治州大理市苍山 ,
经大理学院药学院生药教研室马晓匡教授鉴定为云南松 P.yun-
nanensisFr.松塔。
2　方法与结果
2.1　松塔木质素 -糖复合物的提取 称取风干粉碎过 20目筛的
松塔 580 g,加 1倍量的沸水静置水提 , 24 h后将水倾出后加入
1 000 ml的 1mol/LNaOH溶液 , 静置 24 h后 ,抽滤 ,滤液采用分
级醇沉法 ,再抽滤 , 干燥 ,即得松塔样品 C, D, E, F。
2.2　溶液的配制
2.2.1　5 %苯酚溶液的配制 取苯酚适量 , 加热套加热蒸馏 , 收
集 180 ～ 182 ℃的馏分 ,称取此馏分 12.5 g, 置 250 ml量瓶中 , 用
水稀释至刻度 ,摇匀 , 置 250 ml棕色试剂瓶中 , 避光 ,冷藏。
2.2.2　葡萄糖溶液的配制 精密称取 105 ℃干燥至恒重的葡萄
糖 0.020 0 g, 置 100 ml量瓶中 , 加水稀释至刻度 , 摇匀 , 制成 200
μg/ml的标准溶液。 另称取干燥至恒重的葡萄糖 0.030 0 g置
100ml量瓶中 ,加水至刻度 , 精密量取此溶液 10 ml置 100 ml量
瓶中 , 加水至刻度 , 即得 30 μg/ml的葡萄糖溶液。
2.2.3　样品溶液的配制 精密称取 C, D, E, F样品各 0.030 0 g,
分别置 50 ml烧杯中 ,加水 30ml, 沸水浴加热 10min, 边加热边搅
拌 , 取出后冷却至室温 , 分别加入二甲基亚砜溶液 2滴 , 超声 10
min。分别过滤置 100 ml量瓶中 , 水定容至 100 ml, 摇匀 , 置冰箱
备用。
2.3　最大吸收波长的选择 精密量取 30 μg/ml的葡萄糖溶液及
E样品液各 1 ml,加 5 %苯酚溶液 1ml, 浓硫酸 5ml, 均匀混合后
室温放置 10min,置沸水浴加热 15 min, 取出用自来水冲至室温
后放置 10min。以 1ml水同法显色作为空白 , 在 200 ～ 600 nm波
长范围内扫描 ,确定最大吸收波长为 486.5nm。结果见图 1。
2.4　最佳显色条件的选择 对吸光度有影响的因素:苯酚的用
量 , 浓硫酸的用量 , 加酸后的放置时间 ,水浴温度和水浴加热时间
分别进行考察。
2.4.1　5%苯酚用量的考察 精密量取 30 μg/ml的葡萄糖溶液 1
ml, 置 10 ml量瓶中 , 5%苯酚溶液用量分别为 1.2 ～ 1.9 ml,浓硫
酸 6 ml, 加酸后放置 10min,水浴温度为 25 ℃,水浴恒温 15 min,
取出后放置 10 min。在 485.4 nm波长下测定吸光度 , 结果见
表 1。结果表明 , 加 5%苯酚溶液 1.4 ml时所测吸光度最大。
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8
1.样品;2.葡萄糖
图 1　样品和葡萄糖的紫外光谱图
表 1　苯酚溶液用量对吸光度的影响
苯酚用量 V/ml 吸光度(A)
1.2 0.198
1.3 0.227
1.4 0.258
1.5 0.243
1.6 0.233
1.7 0.229
1.8 0.213
1.9 0.202
2.4.2　水浴温度的考察 精密量取 30 μg/ml的葡萄糖溶液 1ml
置 10 ml量瓶中 , 加 5 %苯酚溶液 1.4 ml,浓硫酸 6 ml, 加酸后放
置 10min,水浴温度分别为 25, 45, 55 ℃,沸水 , 取出后冷至室温。
在 485.4nm波长下测定吸光度 , 结果见表 2。 从表 2可以看出
25 ℃与 55 ℃时的吸光度 A值都较高 , 实验选择 25 ℃为最佳温
度。
表 2　水浴温度对吸光度的影响
水浴温度 T/℃ 吸光度(A)
25 0.283
45 0.261
55 0.282
沸水 0.270
2.4.3　浓硫酸用量的考察 精密量取 30 μg/ml的葡萄糖溶液 1
ml置 10ml量瓶中 , 加 5%苯酚溶液 1.4ml,浓硫酸用量为 6.4 ～
7.0ml, 加酸后放置 10 min, 水浴温度为 25 ℃, 水浴恒温 15 min,
取出后放置 10min。在 485.4 nm波长下测吸光度 , 结果见表 3。
从表 3可以看出:加浓硫酸 6.5 ～ 6.6 ml时吸光度 A值最大 ,实
验选择加 6.5 ml浓硫酸。
表 3　浓硫酸用量对吸光度的影响
浓硫酸用量 V/ml 吸光度(A)
6.4 0.227
6.5 0.235
6.6 0.235
6.7 0.224
6.8 0.223
6.9 0.208
7.0 0.201
2.4.4　加酸后放置时间的考察 精密量取 30 μg/ml的葡萄糖溶
液 1 ml置 10ml量瓶中 ,加 5%苯酚溶液 1.4 ml, 浓硫酸 6.5 ml,
加酸后放置 4 ～ 20 min,水浴温度为 25℃, 水浴恒温 15 min,取出
后放置 10 min。在 485.4nm波长下测定吸光度 ,结果见表 4。结
果表明放置 4 ～ 6min时吸光度 A值趋于稳定。
综上得最佳显色条件为:5 %苯酚溶液 1.4 ml, 浓硫酸 6.5
ml, 加酸后放置 4 ～ 6 min, 水浴温度为 25 ℃,水浴恒温 15 min。
2.5　标准曲线的制备 精密量取 200 μg/ml的葡萄糖标准溶液
0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7ml分别置 10 ml的量瓶中 ,分
别加水使成 1 ml, 按最佳条件显色 , 在 485.4 nm波长下测吸光
度。以吸光度(Y)为纵坐标 , 质量浓度(X)为横坐标 , 绘制标准曲
线 , 得回归方程为:Y=0.055 2X+0.014 1, r=0.999 4。
表 4　加酸后放置时间对吸光度 A值的影响
加酸后的放置时间 t/min 吸光度(A)
4 0.246
6 0.244
8 0.233
15 0.225
20 0.229
2.6　精密度实验 取高 、中 、低 3种浓度的葡萄糖溶液按最佳条
件显色 ,测定吸光度值 , 每一浓度测定 3份。结果高 、中 、低 3种
浓度的 RSD分别为 0.23%, 0.39%, 1.25%(n=3)。
2.7　稳定性实验 取同一样品液 1 ml置 10 ml量瓶中 , 按最佳条
件显色 ,在 485.4 nm波长下测定吸光度。分别测定放置 10, 20,
60, 90, 120, 180, 240 min后的吸光度 ,吸光度值的 RSD为 2.41%,
表明显色液在 240 min内稳定。
2.8　回收率实验 精密称取已知多糖含量的 E样品 9份 , 分别加
入高 、中 、低 3种浓度的葡萄糖溶液 , 每个浓度各 3份 ,按样品溶
液配制方法制备并测定吸光度值 , 计算加样回收率。结果测得
高 、中 、低 3种浓度的加样回收率分别为 99.7% ～ 100.4 %,
99.8% ～ 100.7%, 99.3% ～ 101.7%, RSD分别为 0.29%,
0.49%, 1.30%(n=3)。
2.9　样品含量的测定 分别精密量取 C、D、E、F4种样品溶液 1
ml置 10 ml量瓶中 ,按最佳条件显色 , 在 485.4 nm波长下测定吸
光度。根据公式:多糖含量(%)=CVD/W×100%, C为样品液
中葡萄糖的浓度(μg/ml), D为样品的稀释因素 , V为取样体积
(ml), W为样品重量(g)。结果测得 C, D, E, F4种样品糖含量
(%)分别为 17.08%, 17.51%, 28.38%, 23.67%。
3　讨论
本实验采用苯酚 -硫酸法测定多糖含量 ,其原理为多糖在强
酸作用下水解生成单糖 ,并迅速脱水生成糠醛 , 糠醛与酚性物质
苯酚缩合成黄色的化合物 , 在 485.4nm波长处有吸收。 本方法
简便易行 ,显色稳定 , 灵敏度高 ,重复性好。
样品溶解条件的考察:经考察样品在常温水中溶解度极低 ,
在热水中溶解度升高 ,水浴加热 10 min后样品 E、F基本完全溶
解 , C、D仍有部分未溶物质。为解决溶解度问题 , 我们将样品放
置到室温 , 分别加入两滴二甲基亚砜溶液 , 置于超声波清洗器中
超声 , 10 min后 4个样品已完全溶解。二甲基亚砜(DMSO)是一
种含硫有机化合物 ,常温为无色透明液体 , 具有吸湿性的可燃液
体。因具有较高的极性且能溶于大多数有机溶剂故被誉为 “万
能溶剂 ”。本实验中加入两滴二甲基亚砜是为提高整个溶液体
系的极性 ,使样品得以充分溶解。
本法操作中应特别注意:①苯酚溶液的配制:配制前苯酚一
定要先蒸馏 ,蒸馏时要加入少量铝片和碳酸氢钠。配制好的苯酚
溶液应避光冷藏。 ②浓硫酸的加入:最好为快速加入 , 充分摇匀
后应开盖放置以便散热。
参考文献:
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[ J] .大理学院学报 , 2007, 6(12):77.
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初报 [ J] .大理学院学报, 2009, 8(2):69.
[ 3 ] 　吕小满 ,胡艳芬 ,刘光明 ,等.松塔化学成分及生物活性的研究进展
[ J] .医学综述 , 2010, 16(7):1071.
[ 4 ] 　吕永俊 ,王士贤 ,彭　芳, 等.松果有效成分研究———VI.红松与油
松松塔及松子壳的抗癌活性 [ J].大理学院学报 , 2008, 7(2):1.
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8 时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期