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第 1 5卷 第 7 期
2013 年 7 月
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 15 No. 7
Jul .，2013
J = 16.0 Hz，H-7）] ；2个β-D-葡萄糖基[ 4.87
（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1），5.20（1H，d，J = 7.5 Hz，
H-1）]，及1个a-L-鼠李糖基[1.69（3H，d，J = 6.0
Hz，H3-6），6.13（1H，br.s，H-1）]。在HMBC谱中
可以观测到 H 6.26（H-8）与 C 129.3（C-1）； H
4.87（H-1）与 C 70.2（C-9）；H 5.72（H-4）与
C 167.1（C-9） ；H 6.13（H-1）与 C 82.0（C-3） ；
H 5.20（H-1）与 C 84.9（C-4）之间的碳氢远
程相关信号，因此确定了各片段的连接位置。其氢
谱、碳谱（表1）数据与文献相对照[8]鉴定化合物5为
草苁蓉苷E（rossicaside E）。◆
参考文献
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响应面法优化藤梨根总生物碱提取工艺
邸学1，徐洋洋1，裴世柱2，翟延君1
（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600 ；2.辽宁可济药业有限公司，辽宁 沈阳 110102）
摘 要：目的：研究藤梨根中总生物碱的最佳提取工艺。方法：采用Box-Behnken中心组合试验设计原理，在
单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应曲面分析法对藤梨根中总生物碱提取工艺进行优化。结果：建立了
一个总生物碱含量与影响因子的多元二次回归方程，得到总生物碱的最佳提取工艺条件：盐酸浓度为3%，提取时间
为40 min，液料比为25∶1，总生物碱含量的预测值为1.17％，实测值为1.14％。结论：方法简便合理、稳定，可预测性
较优。
关键词：总生物碱；藤梨根；响应面法
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2013) 07- 0058- 04
收稿日期：2012-12-12
作者简介：邸学（1979-），女，辽宁沈阳人，实验师，硕士，研究方向 ：中药品种鉴定及质量评价。
通讯作者：翟延君（1956-），女，辽宁沈阳人，教授，博士，研究方向 ：中药品种鉴定与质量标准研究。E-mail ：lnzyzyj@sohu.com。
Optimization of Extraction Technology of Total Alkaloids in Radix
Actinidiae with Response Surface Methodology
DI Xue1，XU Yangyang1，PEI Shizhu2，ZHAI Yanjun1
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Liaoning University of Traditional Chinese
Medicine，Dalian 116600，Liaoning，China ；2.KEJI Pharmaceutical Industry
Limited Company of Liaoning，Shenyang 110102，Liaoning，China）
Abstract ：Objective ：To study the technological parameters of the extraction process of total alkaloids
in Radix Actinidiae. Methods ：On the basis of one-factor-at-a-time-technique test，the Box-Behnken
central-composite designed response surface with 3 factors and 3 levels was adopted.A second order
quadratic equation for total alkaloids from Radix Actinidiae of paeoniflorin was built.The response surface
methodology（SM）with three factors and three levels was used to optimize ethanol heat reflux applied
foralk-aloids extraction from Radix Actinidiae. Results ：A quadratic polynomial mathematical model with
good correlation was constructed and applied to the optimization.The optimal extraction conditions were as
follows ：the ultrasound extraction time was 40 min，the concentration of HCL was 3%，the ratio of ethanol
to raw material was 25 ：1，under which the predictive value of the content of alkaloids was 1.17% and the
measured value was 1.14%，and there was a good agreement with their predicted values. Conclusion ：The
method is simple，stable and feasible，and the selected process also has a good reproducibility.
Key words ：total alkaloids ；Radix Actinidiae ；response surface methodology
DOI：10.13194/j.jlunivtcm.2013.07.60.dix.081
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1 5 卷 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
抗癌药物藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属植物中
华猕猴桃Actinidia chinensis Planch.或软枣猕猴桃
Actinidia arguta（Sieb.＆Zucc.）Planch.ex Miq.的
根[1]。其所含生物碱，如猕猴桃碱Actinidine文献
记载其有降压、抗肿瘤等药理作用，但提取方法研
究较少，萜类生物碱的主要提取方法有渗漉法、超
声提取法、回流法、酸水提取法等[2]，国内文献报道
中常用均匀设计和正交设计优化法选择最佳工艺，
但两种方法局域线性模型、某些设计表不适于二次
以上多项式模型。前期研究，采用均匀（正交）设
计尝试进行工艺研究，未得到较佳结果。利用RSM
优化法可使最佳条件下效应的预测值和实测值偏
差较小，进行多元线性和非线性拟合，根据建立的
数学模型描绘三维效应面，从效应面的较优区域读
取较佳工艺条件范围[3]。本实验用酸水提取结合
超声法对软枣猕猴桃根中总生物碱的提取工艺进
行考察，并用响应面分析法加以优化成功，确定了
最佳提取工艺。
1 材料与仪器
1.1 仪器
1100 Series高 效 液 相 色 谱 仪（美 国Agilent
公 司），ACCULAB ALC-110.4万 分 之 一 天
平（SARTORIUS），CP225D万 分 之 一 天 平
（SARTORIUS），KQ5200DB型数控超声波清洗器
（昆山市超声仪器有限公司），HH-4数显恒温水浴
锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），GZX-
9070MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有
限公司医疗设备厂），U3010紫外-可见分光光度
计（日本日立科技有限公司），圣叶RE-3000旋转
蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
1.2 试剂与试药
高效液相用甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净
水，其它试剂均为分析纯 ；自采药材（辽宁省丹东宽
甸）经辽宁中医药大学药学院翟延君教授鉴定为
来源于软枣猕猴桃Actinidia arguta（Sieb.＆Zucc.）
Planch.ex Miq.的根。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的配制
精密称定3.5 mg乌头碱对照品，置于50 mL容
量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，备用。
2.2 供试品溶液的制备
称取药材粉末50 g，置于锥形瓶中加入10倍量
的2%盐酸浸泡12 h，超声40 min，提取液减压浓缩至
浸膏状，精称提取物1 g于具塞锥形瓶中，加入1 mL
氨水浸润，放置30 min，加入20 mL氯仿，超声40 min，
滤过。药渣用氯仿冲洗3次（每次5 mL），合并滤液，
浓缩，定容于25 mL容量瓶中，即得。
2.3 测定波长的选择
精密吸取乌头碱对照品和供试品溶液各1 mL，
置于分液漏斗中，分别精密加入溴麝香草酚蓝缓冲
溶液6 mL，再加入氯仿6 mL，振摇1 min，静置30 min，
分取氯仿层。另取氯仿1 mL，同法操作，所得氯仿
液为随行空白液。分别在400~600 nm波长范围内
进行扫描。结果表明，乌头碱对照液和藤梨根供试
品溶液在415 nm处均有最大吸收，故选择415 nm为
检测波长。
2.4 样品含量的测定
2.4.1 标准曲线的制备
精密吸取乌头碱标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、
5.0、6.0 mL分别置于25 mL的具塞试管中，于水浴
锅中挥干溶剂，分别加入6 mL溴麝香草酚蓝缓冲溶
液和6 mL氯仿，用力振摇1 min，转入分液漏斗中，
放置30 min，取氯仿层，用1号为空白，在415 nm处
测定吸收度，求得回归方程 ：A=0.1088+0.3927C，
R2=0.9996。
2.4.2 精密度试验
精密量取0.07 mg/mL乌头碱对照液及氯仿溶液
各1.0 mL，分别置于25 mL的具塞试管中，于水浴锅中
挥干溶剂，向试管中依次加入6 mL溴麝香草酚蓝缓
冲溶液和6 mL氯仿，用力振摇1 min，转入分液漏斗
中，放置30 min，取氯仿层，于415 nm处测定吸光度，
连续测定6次。RSD为 1.1%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验
精密称取藤梨根粉末6份，各1.0 g，按“2.2”项
下方法制备供试品溶液，取供试品溶液1.0 mL及氯
仿溶液各1.0 mL，分别置于25 mL的具塞试管中，于
水浴锅中挥干溶剂，向试管中依次加入6 mL溴麝香
草酚蓝缓冲溶液和6 mL氯仿，用力振摇1 min，转入
分液漏斗中，放置30 min，取氯仿层，于415nm处测
定吸光度。计算其平均含量为0.2%，RSD为1.2%。
结果表明，该方法重现性良好。
2.4.4 稳定性试验
精密吸取“2.2”项下制备的供试品溶液1.0
mL，按“2.3”项下方法操作，显色后分别在0、5、10、
20、30、40、50 min于415 nm处依法测定其吸光度。
RSD为1.4%。表明其在50 min内稳定。
2.4.5 加样回收率试验
精密吸取5份已知浓度的供试品溶液各1 mL，
分别精密加入2 mL乌头碱对照品溶液（浓度为0.07
mg/mL），混匀，比色测定吸光度。根据回归方程计
算回收率，S=3.73，RSD为3.7%。结果见表1。
表1 加样回收率实验结果
编号 样品含量（mg）
加入量
（mg）
测得量
（mg）
回收率
（%）
平均回收率
（%）
1
2
3
4
5
0.361
0.360
0.359
0.360
0.358
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.475
0.521
0.506
0.513
0.490
94.8
104.2
101.4
102.6
98.4
100.3
2.5 单因素考察
2.5.1 溶剂浓度对总生物碱含量的影响
称取药材粉末10.0 g于具塞锥形瓶中，固定溶
剂体积为200 mL，超声提取60 min，分别考察浓度为
1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的盐酸对总生物碱含
量的影响。
由图1可知，总碱含量随着浓度的增大先增大
后减小，在4.0%时达到最大，可能是因为盐酸浓度
过大，生物碱类成分遭到破坏，因此选择盐酸浓度
3.0%~5.0%作为响应面法的考查范围。
2.5.2 提取时间对总生物碱含量的影响
称取药材粉末10.0 g于具塞锥形瓶中，加入
4.0%盐酸200 mL，考察提取时间为10、25、40、55、70
min对总生物碱含量的影响。
60
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报 1 5 卷
图1 溶剂浓度对总碱含量的影响
图2 提取时间对总碱含量的影响
由图2可知，提取率随时间的增加而先增大后
减小，在40 min时达到最大，可能是超声波的穿透
力比较强，在溶剂中产生强烈的振动、空化效应，生
物碱类成分由于超声时间过长而受到破坏，造成含
量降低，故超声时间不宜过长。因此选择提取时间
25~55 min作为响应面法的考查范围。
2.5.3 液料比对总生物碱含量的影响
称取药材粉末10.0 g于具塞锥形瓶中，加入
4.0%盐酸，超声提取40 min，考察液料比5倍、15倍、
25倍、35倍、45倍对总生物碱含量的影响。
由图3可知，提取率先随溶剂体积增加而增大，
35倍时最大，然后随溶剂体积增大而减小，其原因
可能是随着溶剂用量的增加，药材与溶剂的接触面
积增大，从而提高了传质效率，到35倍时达到最大
值，继续增大液料比阻碍传质。因此液料比选择
20~50倍作为响应面法的考查范围。
图3 料液比对总生物碱含量的影响
2.6 响应面分析法试验设计
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，参
考相关文献，确定提取溶剂、提取时间、料液比为
3个主要影响总生物碱含量的因素，进行单因素实
验考察，分光光度法测定生物碱含量确定各因素
的较优值。再以X1、X2、X3代表各因素，以-1、0、
1对每个自变量的低、中、高实验水平进行编码，响
应面法设计实验优化藤梨根中生物碱的提取工艺
（见表2），分光光度法测定生物碱含量，计算总碱
得率。
表2 试验因素水平及编码
因素 代码 编码水平 -1 0 1
盐酸浓度（%）
提取时间（min）
液料比（倍）
X1
X2
X3
3.0
25
20
4.0
40
35
5.0
55
50
2.6.1 模型拟合
根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原
理，综合单因素影响试验结果，应用响应面分析法
（response surface methodology，RSM）优化主要影响
因素。根据表2设计的3因素3水平进行实验，响
应面试验共有15个试验点，其中12个析因点，5个
中心点，设计方案及实验结果见表3。所得数据用
Design-Expert 8.05b软件进行响应面分析，以总生物
碱含量为响应值对各因素分别进行多元线性回归和
二项式方程拟合[4-7]。
表3 试验设计与结果
试验号 X1 X2 X3 总生物碱含量（%）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
0
0
1
1
0
-1
1
-1
0
0
-1
-1
1
0
0
0
1
-1
-1
-1
-1
1
0
0
0
1
0
0
1
1
0
-1
-1
0
1
0
0
-1
0
0
0
1
-1
1
0.12
1.17
0.08
0.29
0.13
0.14
0.28
0.19
0.17
1.16
1.17
0.15
0.26
0.13
0.23
经软件对结果的分析，发现二阶回归多项
式较优，得到以总生物碱含量为响应值，以X1、
X2、X3为变量的二阶模型公式 ：Y=1.17-0.036X1-
0.024X2+1.000E-002X3+0.048X1X2-0.025X1X3+0.075
X2X3-0.05X12-0.48X22-0.50X32（R2=0.9993）。
表4 回归分析结果
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P（Prob>F） 显著性
Model
X1
X2
X3
X1X2
X1X3
X2X3
X1X1
X2X2
X3X3
残 差
失拟性
纯误差
总 差
2.40
0.011
4.513E-003
8.000E-004
9.025E-003
2.500E-003
0.022
0.92
0.86
0.93
1.725E-03
1.725E-003
0.000
2.40
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
3
2
14
0.27
0.011
4.513E-003
8.000E-003
9.025E-003
2.500E-003
0.022
0.92
0.86
0.93
3.450E-004
5.750E-004
0.000
772.58
30.47
13.08
2.32
26.16
7.25
65.22
2662.62
2504.50
2688.98
<0.0001
0.0027
0.0153
0.1883
0.0037
0.0432
0.0005
<0.0001
<0.0001
<0.0001
0.729
***
**
*
**
*
***
***
***
***
注 ：***P<0.001，** P<0.01，*P<0.05。
由表4方差分析结果可知 ：超声时间、盐酸浓
61
1 5 卷 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
度、料液比对总生物碱含量有显著影响 ；盐酸浓度
与超声时间的交互作用有非常显著的影响 ；超声
时间与料液比的交互作用有极显著影响 ；二项式
中的χ2偏回归系数达极显著水平。模型回归方
程的失拟性检验P=0.729>0.05，差异不显著，总回
归方程P<0.0001，表明回归模型具有极显著水平，
该模型与实际试验拟合度较好。因此该模型可应
用于藤梨根中总生物碱的提取条件的理论分析与
预测。
2.6.2 工艺参数优化与预测
把总生物碱含量与三因素中的两者拟合为三
维曲面图，固定其中的一个为中值，以拟合目标函数
为数学模型，绘制曲面图（见图4~6），盐酸浓度、提
取时间和料液比两两因素的交互作用立体图表示
了水平选择适当，方程的模型符合实际。最佳提取
工艺为 ：盐酸浓度为2.92%，提取时间为39.24 min，
液料比为25.19，藤梨根中总生物碱含量理论值为
1.17％。
图4 提取时间和盐酸浓度对总碱含量的影响
图5 盐酸浓度和液料比对总碱含量的影响
2.6.3 回归模型的验证试验
根据实验结果，按最优提取工艺条件 ：盐酸浓
度为3%，提取时间为40 min，液料比为25∶1进行验
证，实际测得总碱含量为1.14％，实际值与预测值
1.17％比较接近。证明回归模型有效，能准确预测
实验结果。
图6 提取时间和液料比对总碱含量的影响
3 结论与讨论
采用响应面试验设计方法得出总生物碱提取
工艺参数的二次回归方程，方差分析结果表明总回
归方程P<0.0001，回归模型具有极显著水平，表明
该模型与实际试验拟合度较好。因此该模型可应
用于藤梨根中总生物碱的提取条件的理论分析与
预测。
响应面分析方法是研究几种因素间交互作用
的回归分析方法，求得的回归方程精度高，可以准
确找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最
优值，是比较理想的方法，图形是特定的响应值对
应的各因素构成的一个三维空间，可以直观地反映
各因素对响应值的影响，从试验所得的响应面分析
图上可以分析出它们之间的相互作用，方法简便、
直观。
本研究首先通过单因素试验分别考察盐酸浓
度、超声时间、液料比对藤梨根中总生物碱提取量
的影响，同时采用Design-Expert8.05b软件的中心
组合设计方法设计响应面试验，建立了数学模型，
得到了总生物碱的最佳提取工艺条件 ：盐酸浓度
为3%，提取时间为40 min，液料比为25∶1。与预
测值相近，得到藤梨根总生物碱最佳提取工艺条
件。◆
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