全 文 ：第 24 卷 第 7 期 农业工程学报 Vol. No.7
2008 年 7 月 Transaction of the CSAE Jul. 2008 237

万寿菊花酶助青贮工艺及其酶活性分析

李大婧 1,2，刘春泉 1※，方桂珍 3
（1．江苏省农业科学院原子能农业利用研究所，南京 210014； 2．东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；
3．东北林业大学材料科学与工程学院，哈尔滨 150040）

摘 要：针对万寿菊花（Tagetes erecta）制备叶黄素的传统生产方法中叶黄素损失较多的情况，提出一重酶助青贮处理
万寿菊花生产叶黄素的方法。以叶黄素的提取率为指标值，确定青贮过程的工艺参数，在水－有机溶剂共存体系分析
了酶的活性。试验结果表明：青贮和烘干过程叶黄素都有损失，在烘干过程损失（16.33%）比青贮过程损失（6.55%、
10.27%）更多。在青贮阶段添加 β-葡聚糖酶或液态纤维素酶 30℃青贮 5 d，可以很好的降解植物细胞壁，利于叶黄素
的提取。分别以万寿菊花冻干粉、青贮鲜花为原料，在水－有机溶剂共存体系确定提取过程所需要的最适水量分别为
6.8、2.8～3.8 mL/g，保证了该体系中较好的酶活性，能够降解植物细胞壁使水解顺利进行。采用对照试验发现在酶－
水－有机溶剂共存体系中纤维素酶仍然具有较高活性。
关键词：万寿菊花；酶助青贮；叶黄素；提取；酶活性
中图分类号：Q562；O629.4 文献标识码：A 文章编号：1002-6819(2008)-7-0237-05
李大婧，刘春泉，方桂珍. 万寿菊花酶助青贮工艺及其酶活性分析[J]. 农业工程学报，2008，24(7)：237－241.
Li Dajing, Liu Chunquan, Fang Guizhen. Enzymatic silage technology for Tagetes erecta and analysis of enzyme activity in the
water-organic solvent coexistence system[J]. Transactions of the CSAE, 2008,24(7)：237－241. (in Chinese with English
abstract)

0 引 言
万寿菊（Tagetes erecta L.）为菊科万寿菊属植物，在
中国黑龙江、内蒙古、新疆、云南、山东等地已大规模
推广种植。由于其花瓣叶黄素含量较高，成为工业化生
产叶黄素的良好原料来源。万寿菊花制备叶黄素的传统
生产方法是收获万寿菊花后，青贮、压榨、烘干并造粒、
正己烷提取和浓缩，得到油状叶黄素产品[1-3]，但此过程
叶黄素损失较多，粗略估计，在青贮和烘干阶段约损失
20%～40％的叶黄素。现在国内的大多数生产厂家都是用
这种方法制备叶黄素，青贮的作用主要是降解万寿菊花
植物细胞壁从而使叶黄素容易溶解在溶剂中。
酶助青贮是一种相对简单的生物加工技术，酶和青
贮共同作用能软化细胞壁，使以后的抽提条件较为温
和[4,5]。因此，可在植物活性成分开发利用领域采用该方
法。本试验首先研究万寿菊花传统生产方法中的青贮和
干燥阶段叶黄素的损失情况，在此基础上，提出酶助青
贮方法改进原有工艺，以叶黄素的提取率为指标值，确
定青贮过程工艺参数。同时，试验中以万寿菊花冻干粉

收稿日期：2007-05-16 修订日期：2008-03-14
基金项目：江苏省科技攻关项目（BE2006319）；江苏省博士后科研资助计
划项目（0602033B）
作者简介：李大婧（1976－），女，黑龙江肇东人，博士，副教授，主要从
事天然产物方面的研究。南京 江苏省农业科学院原子能农业利用研究所，
210014。Email: lidajing1976@yahoo.com.cn
※通讯作者：刘春泉（1959－），男，江苏南通人，研究员，主要从事天然
产物方面的研究。南京 江苏省农业科学院原子能农业利用研究所，210014。
E-mail: lcq@js001.com.cn
或降解的万寿菊花为原料，直接用有机溶剂进行提取，
对在水－有机溶剂共存体系中的酶活性进行分析。万寿
菊酶助青贮及直接采用有机溶剂进行提取叶黄素的生产
方法省去传统加工中的干燥工艺，有效减少了叶黄素在
加工过程中的氧化损失和异构化，这将为万寿菊花叶黄
素的深加工提供一条新途径。
1 材料与方法
1.1 试验原料、仪器与试剂
1）原料：万寿菊，丰富系列橙色品种，江苏省农业
科学院原子能农业利用研究所提供。
2）仪器：LGJ-12 真空冷冻干燥机（北京松源华兴科
技发展有限公司）、TU-1810S 紫外可见光分光光度计（北
京普析通用仪器有限责任公司）、RE52CS 旋转蒸发仪(上
海亚荣仪器厂)、CP224 电子分析天平(北京赛多利斯天平
有限公司)、722S 型分光光度计（上海棱光科学仪器有限
公司）、LD4-2 离心机（北京医用离心机厂）、101A-2 数
显电热鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）、
PHS-25 酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）、85-2A 恒
温磁力搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、
SK-1 快速混匀器（江苏金坛医疗仪器厂）。
3）试剂：正己烷、无水硫酸钠、丙酮、无水乙醇、
甲苯、氢氧化钾、甲醇均为分析纯；液态纤维素酶（和
氏璧生物技术有限公司），酶活力≥18000 u/mL）、β-葡聚
糖酶（和氏璧生物技术有限公司，酶活≥3300000 u/mL）、
固态纤维素酶（无锡杰能科生物工程有限公司，≥10000
u/g）。
238 农业工程学报 2008 年
1.2 试验方法
1.2.1 青贮过程叶黄素含量测定
取新鲜万寿菊花花瓣，真空冷冻干燥24 h，粉碎、过
60目筛，制成花粉；取新鲜万寿菊花花瓣，在温度（30
±1）℃青贮10 d后真空冷冻干燥24 h，粉碎、过60目筛，
制成冻干粉；取新鲜万寿菊花花瓣，青贮10 d（同时添加
β-葡聚糖酶，添加量为0.5％）后真空冷冻干燥24h，粉碎、
过60目筛，制成冻干粉。用AOAC法[6]分别检测不同处理
冻干粉中叶黄素含量，每组重复3次。
1.2.2 烘干过程叶黄素含量测定
取新鲜万寿菊花花瓣，在温度(30±1)℃青贮10 d后，
一部分真空冷冻干燥24h，粉碎、过60目筛，制成冻干粉；
另一部分采用烘干工艺[2]，分3个阶段，90℃烘干10 min，
70～75℃烘干3 h，55℃烘干2 h，至水分含量达到10%。
用AOAC法分别检测不同干燥处理花粉中叶黄素含量，每
组重复3次。
1.2.3 酶助青贮工艺及考察方法
在万寿菊花青贮过程中添加不同种类酶，添加量为
0.5%，在温度(30±1)℃青贮不同时间后得细胞壁被降解
的万寿菊花。采用两种提取方式考察添加酶对叶黄素提
取效果的影响：一种以降解万寿菊鲜花为原料，直接用
有机溶剂提取。取6 g 降解的万寿菊花，加入24 mL正己
烷，在500 r/min搅拌下提取30 min，提取液于4000 r/min
离心分离10 min，取上清液过无水硫酸钠干燥柱后用正己
烷定容到100 mL，测定叶黄素吸光值。另一种将降解的
万寿菊花冷冻干燥24h得万寿菊花粉。以冻干粉为原料，
与前种方法中干物质相同量为基准（约1 g左右），加入
24 mL正己烷，在500 r/min搅拌下提取10 min，提取液于
4000 r/min离心分离10 min，取上清液过无水硫酸钠干燥
柱后用正己烷定容到100 mL，测定叶黄素吸光值。对照
组的试验方法同添加酶组。每组重复3次。
1.2.4 水－有机溶剂共存体系纤维素酶作用试验
试验1：取2 g花粉，以7%液态纤维素酶50℃酶解保
温1 h，加入54 mL正己烷，在45℃分别以700 r/min提取1、
2、3、4、5 h，测定叶黄素吸光值；试验2：取2 g花粉，
以7%液态纤维素酶50℃分别酶解保温1 h后冻干。以冻干
粉为原料在45℃分别以700 r/min分别提取1、2、3、4、5 h，
测定叶黄素吸光值。每组重复3次。
1.2.5 叶黄素的测定方法
1.2.3和1.2.4中叶黄素的测定采用分光光度法。用紫
外可见光分光光度计测定叶黄素在445 nm的吸光值，按
下式计算叶黄素含量[7,8]；提取率为第1次提取的叶黄素量
与样品所含叶黄素总量的比值。
X=Ay/(A1%1cm×100)
式中 X ——叶黄素的质量，g；A ——固定波长下样品
吸收值；A1%1cm ——比吸收系数，正己烷液中叶黄素的值
为2589；y ——样品总体积，mL。
2 结果与分析
2.1 青贮和干燥过程中叶黄素的损失
2.1.1 青贮过程中叶黄素的损失
对万寿菊花叶黄素生产中的青贮工序进行研究，考
察青贮过程、及添加 β-葡聚糖酶的青贮过程对叶黄素含
量的影响及叶黄素的损失情况。用 AOAC 法分别检测不
同处理花粉中叶黄素含量（假设冻干过程对叶黄素无影
响），试验结果，青贮 10 d 的万寿菊花含量为 17.56 g/kg、
青贮过程添加 β-葡聚糖酶的叶黄素含量为 16.86 g/kg，与
对照组的万寿菊花叶黄素含量 18.79 g/kg 比较，青贮过程
中叶黄素略有损失，后两种工艺中分别损失 1.23 g/kg 和
1.93 g/kg，损失的叶黄素占万寿菊花叶黄素总量的 6.55%
和 10.27%。这可能是由于青贮过程酸性较强，叶黄素在
强酸性条件下发生轻微降解造成的[9]。另外，在青贮过程
中，发现有较多的组织细胞水变为高生物需氧量的污水，
这主要是由于青贮过程中多种微生物的活动产生的[10]。
2.1.2 烘干过程中叶黄素的损失
对万寿菊花叶黄素生产中的烘干工序进行研究，考
察烘干对叶黄素含量的影响及叶黄素的损失情况。用
AOAC 法分别检测不同处理花粉中叶黄素含量（假设冻
干过程对叶黄素无影响），结果显示，冻干工艺叶黄素
含量为 15.33 g/kg，烘干过程叶黄素含量为 12.78 g/kg，
损失 2.55 g/kg，大约万寿菊中 16.63%的叶黄素在干燥过
程中都被氧化损失。与青贮工艺比较，在烘干过程中叶
黄素损失更多。因此，有必要改进传统的万寿菊花叶黄
素生产工艺。
2.2 酶助青贮工艺参数研究
针对干燥过程中叶黄素损失较多的情况，本研究提
出一种酶助青贮处理万寿菊花生产叶黄素的方法。试验
中以降解的万寿菊鲜花为原料，省去传统方法中的烘干
工艺，工艺路线为：万寿菊鲜花→青贮（添加纤维素酶
或 β-葡聚糖酶）→（冻干）→提取→浓缩→油状叶黄素
产品。以叶黄素的提取率为指标值，确定青贮过程中适
宜工艺参数（叶黄素在有机溶剂中提取的工艺参数在文
献[11]中已进行过研究）。
2.2.1 青贮过程中添加不同种类酶对叶黄素提取效果
的影响
在万寿菊花青贮过程中选取了不同厂家生产的液态
纤维素酶、β-葡聚糖酶、固态纤维素酶 3 种酶，并采用两
种不同提取方式观察青贮过程中添加酶对叶黄素提取效
果的影响，试验结果见图 1。

图 1 青贮过程中添加不同种类的酶对叶黄素提取效果的影响
Fig.1 Effects of different enzymes on lutein extraction in silage

就提取工艺而言，直接以降解万寿菊花为原料提取
叶黄素的工艺比以冻干花粉为原料组叶黄素提取率低，
第 7 期 李大婧等：万寿菊花酶助青贮工艺及其酶活性分析 239
这主要是由于前种工艺中万寿菊花的水分含量较高（经
测定，约 83%），高水分含量阻止了萃取过程。这在水
－有机溶剂共存体系酶活性分析中会进一步讨论。但是，
由于前种工艺中省去干燥步骤，有效减少能耗，生产工
艺相对简单，是一种很好的生产方法，在工业化生产中
适宜大规模推广应用。在以降解万寿菊花为原料组中，
添加液态纤维素酶和 β-葡聚糖酶叶黄素提取效果较好，
提取率比对照组分别增加了 41.30 和 43.85 个百分点，而
固态纤维素酶效果很差，几乎没有降解作用；在以万寿
菊花冻干粉为原料组，添加液态纤维素酶、固态纤维素
酶和 β-葡聚糖酶叶黄素的提取效果都较好，比对照组分
别增加了 27.64、28.55、38.10 个百分点。这表明在以万
寿菊花冻干粉为原料的生产工艺中，3 种酶都可以有效降
解植物细胞壁，增加叶黄素提取率。值得一提的是，青
贮中添加固态纤维素酶，在后种工艺中，其提取率较高，
而在前种工艺中提取率较低，说明青贮过程中添加固态
纤维素酶可以降解植物细胞壁，但如果在提取工艺中有
较多水分存在，水相界面的形成会阻止有机溶剂与溶质
的接触，所以如果采用酶-水-有机溶剂共存方式提取叶黄
素，在青贮过程不能添加固态纤维素酶。
2.2.2 青贮时间对叶黄素提取效果的影响
在温度(30±1)℃分别青贮万寿菊花 5、10、20、30 d，
并采用两种提取方式考察青贮天数对万寿菊花叶黄素提
取效果的影响，试验结果见图 2。无论采用哪种提取方式，
万寿菊花青贮 5、10、20、30 d，叶黄素的提取率基本相
同，并无多大变化，说明青贮时间对叶黄素的提取效果
无影响。而且厌氧条件下青贮能长期保存生物活性物质，
无需立即加工，是保存万寿菊花的一种好方式。在两种
提取方法中，可以看出，以降解的万寿菊花为原料的提
取方法提取率较低，主要是较多水分的存在阻止了溶剂
与原料接触。虽然在较短时间内此法提取率相对较低，
但由于它节省了压榨、干燥、造粒等工序所需的能耗和
生产成本，即使延长提取时间仍然是一种较经济的新型
生产方法。

图2 不同青贮时间对黄素提取率的影响
Fig.2 Effects of silage time on lutein extraction

2.3 在水－有机溶剂共存体系酶活性分析
目前，关于酶在有机溶剂中的反应活性研究是酶学
领域的研究热点。研究认为，只要条件合适，酶可以在
非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底
物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，
也可以在水与有机溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含
微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性[12]。在
传统酶学中，酶分子是在水溶液中存在的，能均一地溶
解于水溶液中（除固定化酶外）。在有机溶剂中，酶分
子不能直接溶于其中，它在含微量水的有机溶剂中以悬
浮状态起催化作用（图 3）。近年来的研究结果表明，酶
悬浮于苯、己烷等有机溶剂中不变性，而且还能表现出
催化活性，在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性。

图 3 酶分散在有机溶剂中的反应体系
Fig.3 Reaction system of enzyme dispersed in organic solvent

基于当前水解酶在含有微量水的有机溶剂中反应活
性方面的研究情况，试验中以万寿菊鲜花或万寿菊花冻
干粉为原料，在水-有机溶剂共存体系分析酶是否具有活
性。研究中主要是使水解酶（如纤维素酶）在有少量水
主要是有机溶剂的介质（正己烷）中降解植物细胞壁，
所需要的水分应包括水解所需的水分和维持酶活性所需
的水分[13]。虽然较多水分也可以使酶水解，但由于水相
界面的形成，能阻碍溶剂与溶质的接触。因此，要确定
萃取过程所需要最小水量以保证酶活性同时使水解顺利
进行。
在摸索试验中发现少量水分的存在足以维持酶水解
和溶剂中叶黄素的萃取。在以鲜花或青贮鲜花为原料试
验中，这些水分包括鲜花中水分或青贮鲜花中水分
（80%～85%）和溶解酶时所需的少量水分；在以万寿菊
花冻干粉为原料的试验中，这些水分包括花粉中含有的
微 量 水 分 和 浸 润 花 粉 所 需 的 少 量 水 分 。
Delgado-Vargas[14,15]采用酶法提取叶黄素的试验中使用
了大量的水分溶解酶，溶剂萃取前需去除酶处理过程大
量的水分，增加了工艺步骤，在实际应用中受限。所以，
在以冻干花粉（水分含量为 5%）为原料的试验中，由于
浸润花粉所需水分量相对较大，试验中对最小加水量进
行研究，结果见图 4。试验中发现，用 10 mL 水浸润 2 g 花
粉，无法将花粉全部溶解，加水量在 12～13.5 mL 时，浸
润效果较好，这部分水分足以维持酶水解和溶剂中叶黄
素的提取。但加水量在 12 mL 左右，提取时容易出现搅
拌不匀现象，加水量在 13.5 mL 时效果最好。当加水量在
14 mL 时，由于在溶质和有机溶剂之间形成的水相界面阻
止正己烷与含叶黄素的细胞脂肪球接触，所以提取率降
低。经过换算确定，在以万寿菊花冻干粉为原料的试验
中，在酶－水－有机溶剂共存体系中水解所需的水分和
维持酶活性所需的水分约为 6.8 mL/g；在以万寿菊鲜花或
240 农业工程学报 2008 年
青贮鲜花为原料，水解所需的水分和维持酶活性所需的
水分约为 2.8～3.8 mL/g。

图 4 酶-水-有机溶剂共存试验中最适加水量
Fig.4 Suitable water amount in enzyme-water-organic
solvent coexistence system

研究酶在花－水－有机溶剂共存体系中的活性，设计
了如下试验：以 7%液态纤维素酶 50℃分别酶解保温万寿
菊花粉（2 g）1 h，然后采取两种方式：直接提取和以冻
干粉为原料提取叶黄素。从试验结果图 5 可以看出，酶
降解冻干后提取的工艺，叶黄素在 1～5 h 的提取过程中
提取率无较大波动，约为 85％；而酶降解直接提取工艺
中，酶在水和有机溶剂共存体系中，开始 1 h 时提取率较
低为 72.22%，提取 2h 后与酶降解冻干工艺提取率几乎相
同，随着提取时间的延长，提取率逐渐增加，提取时间
至 5h 时，95％以上的叶黄素都被提取出。这说明在花-
水-有机溶剂共存体系中，有少量水分的存在下，酶仍然
具有活性，可以降解植物细胞壁，能使更多的叶黄素溶
解在有机溶剂中。

图 5 酶在水-有机溶剂中活性分析
Fig.5 Analysis of the enzyme activity in water-organic
solvent coexistence system

3 结 论
1）万寿菊花制备叶黄素的传统方法中，青贮和烘干
过程叶黄素都有损失，叶黄素在烘干过程损失（16.33%）
比青贮过程损失（6.55%、10.27%）更多；
2）提出酶助青贮处理万寿菊花生产叶黄素的方法，
工艺路线为：万寿菊鲜花→青贮（添加纤维素酶或 β-葡
聚糖酶）→（冻干）→提取→浓缩→油状叶黄素产品。
此方法以青贮鲜花为原料，无干燥步骤，节省能耗、叶
黄素损失少，且青贮阶段原料可长期存放，是较为理想
的生产叶黄素方法。
3）研究青贮过程中不同种类的酶、青贮时间对叶黄
素提取效果的影响，发现在青贮阶段添加 β-葡聚糖酶或
液态纤维素酶 30℃青贮 5 d，可以很好的降解植物细胞
壁，利于叶黄素的提取。
4）分别以万寿菊花冻干粉、青贮鲜花为原料，在水
-有机溶剂共存体系确定提取过程所需要的最适水量分别
为 6.8、2.8～3.8 mL/g，保证了该体系中较好的酶活性，
能够降解植物细胞壁使水解顺利进行，但此体系中较多
水分的存在能阻碍溶剂与溶质的接触，不利于叶黄素提
取；采用对照试验发现在酶-水-有机溶剂共存体系中纤维
素酶仍然具有较高活性。

[参 考 文 献]
[1] 芦新友, 侯 飞，周永强，等．北江垦区色素万寿菊高产
加工技术[J]．中国农机推广，2004，2：53－54．
[2] 刘淑梅，高广智，仇立伟，等．万寿菊的初加工工艺[J]．现
代化农业，2002，10：40．
[3] 郭书丛，王 雨，张 慧，等．自万寿菊花中提取叶黄素
树脂的研究[J]．粮油加工与食品机械，2006，1：86－89．
[4] 杨雪霞，陈洪章，李佐虎．添加纤维素酶的青贮研究进展
[J]．生物技术通报，2001，1：37－41．
[5] 兴 丽，韩鲁佳，刘 贤，等．乳酸菌和纤维素酶对全株
玉米青贮发酵品质和微生物菌落的影响[J]．中国农业大学
学报，2004，9(5)：38－41．
[6] AOAC. Official methods of Analysis[M]. Arlington, VA:
Association of Official Analytical Chemists，2000，45：5－
6．
[7] 赵文恩，孙晓平，时国庆，等．万寿菊叶黄素提取分离研
究[J]．食品科学，2003，24(12)：68－70．
[8] Craft N E, Soares J H. Relative solubility, stability, and
absorptivity of lutein and β-carotene in organic solvents[J].
J.Agric.Food Chem，1992，40：431－434．
[9] 李大婧，方桂珍，刘春泉．叶黄素和叶黄素酯稳定性研究
[J]．林产化学与工业，2007，27(1)：112－116．
[10] Navarrete-Bolanos J L, Jimenez-Islas H, Botello-Alvarez E,
et al. Mixed culture optimization for marigold flower ensilage
via experimental design and response surface methodology
[J]. J Agric Food Chem，2003，51：2206－2211．
[11] 李大婧，刘春泉，方桂珍．酶为介质有机溶剂提取万寿菊
花中叶黄素的工艺研究[J]．农业工程学报，2007，23(5)：
232－236．
[12] 罗贵民．酶工程[M]．北京：化学工业出版社，2002：139
－206．
[13] Bell G, Halling P J, Moore B D, et al. Biocatalyst behaviour in
low water system[J]. Trends Biotechnol，1995，13：468－473．
[14] Delgado-Vargas F, Paredes-Lopez O. Effects of enzymatic
treatments on carotenoid extraction from marigold flowers
(Tagetes erecta) [J]. Food Chemistry，1997，58(3)：255－258．
[15] Delgado-Vargas F, Paredes-Lopez O. Effects of enzymatic
treatments of marigold flowers on lutein isomeric profiles[J].
J Agric Food Chem，1997，45：1097－1102．

第 7 期 李大婧等：万寿菊花酶助青贮工艺及其酶活性分析 241


Enzymatic silage technology for Tagetes erecta and analysis of enzyme
activity in the water-organic solvent coexistence system

Li Dajing1,2, Liu Chunquan1※, Fang Guizhen3
(1. Institute of Application in Atomic Energy, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
2. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;
3. College of Material Science and Engineering, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Abstract: Due to lutein loss in traditional production, a biological procedure described for Tagetes erecta in this article
combines silage with enzymatic hydrolysis of the plant cell wall. To take lutein extraction rate as an index, the ensilage
process parameters were determined, and enzyme activity in the water-organic solvent coexistence system had been
analyzed. The results indicated that lutein has a loss in both ensilage and drying process, and lutein in the drying process
(16.33%) compared to ensilage process (6.55%, 10.27%) loses more. Adding β-glucosan enzyme or liquid cellulose in
the ensilage stage at 30℃ for 5 d may well degenerate plant cell wall, which is useful for lutein extraction. To take
Tagetes erecta frozen dried powder, ensilaged fresh flower as raw materials, the suitable water yield 6.8, 2.8～3.8 mL/g
respectively that the extraction process needed in the water-organic solvent coexistence system was determined, which
has guaranteed a good enzyme activity, it can degrade the plant cell wall to make hydrolysis carry on smoothly. Through
the check experiment we have also found cellulase a higher activity in the enzyme-water-organic solvent coexistence
system.
Key words: Tagetes erecta; enzymatic silage; lutein; extraction; enzyme activity