全 文 ：第 23卷 第 5期
2007年 5月
农 业 工 程 学 报
Transactions of the CSAE
Vol. 23　 No. 5
May　 2007
酶为介质有机溶剂提取万寿菊花中叶黄素的工艺研究
李大婧 1, 2 , 刘春泉1※ , 方桂珍 3
( 1.江苏省农业科学院原子能农业利用研究所 ,南京 210014;　 2.东北林业大学林学院 ,哈尔滨 150040;
3.东北林业大学材料科学与工程学院 ,哈尔滨 150040)
摘　要: 以万寿菊 ( Tagetes erecta)花粉末为原料 ,采用液态纤维素酶处理和有机溶剂萃取同时进行的方法提取叶黄素 ,研
究并优化此过程的工艺条件。 试验结果表明: 酶为介质有机溶剂提取万寿菊花中叶黄素工艺条件受多种因素影响 ,其中提
取时间、萃取前保温时间、酶浓度、搅拌速度对提取过程影响较大。 确定酶法提取较适宜的工艺条件为: 2. 000 g粒度 60目
的万寿菊花粉末、液态纤维素酶浓度为 7% ( m /m)、液料比为 20∶ 1、萃取前保温时间为 1. 5 h、搅拌速度为 700 r /min、提取
时间为 3 h ,对此工艺条件进行验证叶黄素提取率可达 92. 37%。而单纯的有机溶剂法叶黄素提取率仅为 77. 53% ,此方法明
显优于单纯的有机溶剂法。
关键词: 万寿菊花 ; 叶黄素 ; 纤维素酶 ; 提取工艺
中图分类号: T S201. 1; Q562　　　　文献标识码: A　　　　文章编号: 1002-6819( 2007) 5-0232-05
李大婧 ,刘春泉 ,方桂珍 .酶为介质有机溶剂提取万寿菊花中叶黄素的工艺研究 [ J].农业工程学报 , 2007, 23( 5): 232- 236.
Li Dajing , Liu Chunquan, Fang Gui zhen. Enzyme-mediated o rg anic solvent ex traction o f lutein from marig old
flow er ( Tagetes erecta) [ J]. T ransac tions of th e CSAE, 2007, 23( 5): 232- 236. ( in Chinese with Eng lish abstract)
收稿日期: 2006-06-10　修订日期: 2007-05-06
基金项目:江苏省科技攻关项目 ( BG2006319) ;江苏省农业科学院科
研基金资助项目 ( 6110537)
作者简介:李大婧 ( 1976- ) ,女 ,黑龙江肇东人 ,博士 ,主要从事天然
产物方面的研究。 南京　江苏省农业科学院原子能农业利用研究
所 , 210014。 Email: lidajing@ 163. com
※通讯作者:刘春泉 ( 1959- ) ,男 ,江苏南通人 ,研究员 ,主要从事天
然产物方面的研究。南京　江苏省农业科学院原子能农业利用研究
所 , 210014。 Email: lcq@ js001. com. cn
0　引　言
万寿菊 ( marigold, 拉丁学名 Tagetes erecta L. )为
菊科万寿菊属植物 ,原产于墨西哥 ,目前在我国黑龙江、
新疆、云南、山东等地已大规模种植。由于其花瓣叶黄素
含量较高 ,成为工业化生产叶黄素的良好原料来源。 在
常见类胡萝卜素来源的植物中 ,万寿菊花叶黄素
( lutein)含量最高 ,占花中总类胡萝卜素的 85% [1 ]。 万
寿菊花中绝大多数叶黄素以与月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈
酸和硬脂酸结合生成叶黄素酯的形式存在 ,叶黄素酯在
体内代谢可转化为叶黄素。目前研究认为增加叶黄素的
摄入量 ,可以有效预防老年性黄斑退化病和白内障等疾
病的发生 [2 ] ,减少乳腺癌和前列腺癌的患病几率 [3 ]。 由
于叶黄素的诸多生理功能 ,已成为功能食品领域研究的
新热点。
万寿菊花中叶黄素的提取一般采用有机溶剂法 ,常
用正己烷作为溶剂。 作者曾采用超声波技术辅助正己
烷、石油醚强化提取叶黄素 [4, 5 ] ;王振等 [6 ]采用四氢呋喃
作为溶剂 ,研究了万寿菊中叶黄素的同时提取皂化工
艺 ;也有超声波强化乙醇提取叶黄素的报道 [ 7]。近些年 ,
由于纤维素酶可以破坏植物细胞壁 ,使萃取时细胞内的
物质更多暴露出来 ,在天然产物开发领域得到广泛应
用 [8- 10 ]。 在万寿菊花叶黄素的传统生产方法中由于青
贮、烘干工序叶黄素氧化损失较多 ,有机溶剂提取过程
效率较低 ,人们开始用条件温和的酶法降解植物细胞
壁 [11 ]。 Matoushek研究万寿菊鲜花先用纤维素酶处理
16 h,再用有机溶剂 (氯仿或正己烷 )萃取 ,和无酶的对
照组比 较 ,产量提 高 36% [12 ]。 Delgado-Vargas和
Paredes-Lope研究水相酶法处理万寿菊花粉末、再用有
机溶剂提取 ,与无酶对照组 ( 11. 4 g /kg )比较 ,类胡萝卜
素产量显著增加 ,高达 24. 7 g /kg [13 ]。 但由于反应时间
过长 ,溶剂萃取前需去除酶处理过程大量的水分 ,增加
生产能耗 ,使上述方法在实际应用中受限。以万寿菊花
粉末为原料 ,采用酶反应和有机溶剂萃取同时进行的方
法提取叶黄素 ,在国内外还未见报道。因此 ,本研究提出
一种液态纤维素酶处理和溶剂萃取同时进行提取叶黄
素的方法 ,在有少量水存在的酶 -水 -有机溶剂共存体系
中提取叶黄素 ,探讨合理的工艺条件 ,为工业化酶法提
取万寿菊花中叶黄素提供理论基础。
1　材料与方法
1. 1　试验原料、仪器与试剂
原料:万寿菊 ,丰富系列橙色品种 ,江苏省农业科学
院原子能农业利用研究所提供。
232
仪器: LGJ-12真空冷冻干燥机 (北京松源华兴科技
发展有限公司 )、 RE52CS旋转蒸发仪 (上海亚荣仪器
厂 )、 CP224电子分析天平 (北京赛多利斯天平有限公
司 )、 722S型分光光度计 (上海棱光科学仪器有限公
司 )、 LD4-2离心机 (北京医用离心机厂 )、 101A-2数显
电热鼓风干燥箱 (上海浦东荣丰科学仪器有限公司 )、
PHS-25酸度计 (上海虹益仪器仪表有限公司 )、 85-2A
恒温磁力搅拌器 (江苏省金坛市荣华仪器制造有限公
司 )、 SK-1快速混匀器 (江苏金坛医疗仪器厂 )
试剂:正己烷为分析纯。液态纤维素酶 (和氏璧生物
技术有限公司 ,酶活力 18000 U /mL)。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　原料的预处理
摘取万寿菊鲜花 ,冷冻干燥、粉碎后 ,制成万寿菊花
粉末 ,低温、避光保存以备用。
1. 2. 2　酶为介质有机溶剂提取叶黄素的试验
将添加量为万寿菊花粉末原料量 7% ( m /m )的液
态纤维素酶溶于 12. 4 mL去离子水中 (添加的水量是
经过预试验确定的 ,刚好能与 2 g万寿菊花粉末混合浸
润 ,水量多或少都将影响提取效果 ) ,配制酶溶液。精确
称取不同粒度万寿菊花粉末 2. 000 g置于锥形瓶中 ,与
酶溶液 ( pH 4. 80)充分混合浸润 , 50℃保温一段时间
后 ,一定温度下加入一定体积正己烷萃取 ,达到设定时
间后 ,提取液于 4000 r /min离心分离 10 min,定容到
100 mL,测定吸光值。第一次提取后 ,萃余物加入新的
等量溶剂重复提取 ,如此重复 2～ 3次至提取液无色 ,测
定叶黄素的吸光值。对照组直接用正己烷提取 ,不加酶。
分别考察原料粒度、酶浓度、料液比、搅拌速度、提取前
保温时间、提取时间、提取温度对叶黄素提取效果的影
响 ,并在此基础上优化工艺条件。所有试验重复 3次。
1. 2. 3　分析方法
叶黄素的测定采用分光光度法。用紫外可见光分光
光度计测定叶黄素在 445 nm处的吸光值 ,按如下公式
计算叶黄素含量 [14, 15 ];提取率为第一次提取的叶黄素
量与叶黄素总量的比值。
X = Ay /( A
1%
1cm× 100)
式中　X—— 叶黄素的量 , g; A—— 固定波长下样品
吸收值 ; A1%1cm—— 比吸收系数 (= 比消光系数 X1%1cm ) ,正
己烷液中叶黄素的值为 2589; y—— 样品总体积 , mL。
2　结果与分析
2. 1　原料粒度对叶黄素提取效果的影响
分别取粒度为 20～ 40、 40～ 60、 60～ 80和 80～ 100
目的万寿菊花粉末 2 g , 以 7%液态纤维素酶 50℃酶解
保温 1 h,加入 54 mL正己烷 ,在 45℃以 500 r /min提
取 5 h ,研究不同粒度万寿菊花粉末中叶黄素的提取效
果 ,结果见图 1。 万寿菊粒度越细 ,叶黄素吸光度值越
高 ,叶黄素含量越高。 万寿菊粒度在 60目以下时 ,提取
出叶黄素的含量较低 ;粒度超过 60目时 ,叶黄素含量略
有增加 ,但并不明显。由于原料粒度越高 ,生产时所需能
耗越大 ,万寿菊花粉末损耗多 ,综合考虑 ,酶法提取时万
寿菊花粉碎粒度应选 60目为宜。
图 1　原料粒度对叶黄素提取效果的影响
Fig. 1　 Effects o f material g r anularity on lutein ex t raction
2. 2　酶浓度对叶黄素提取率的影响
取 2 g粉碎粒度 60目以上的万寿菊花粉末 (以下
同 ) ,以不同浓度的液态纤维素酶 (分别为 1%、 3%、
5%、 7% ) 50℃酶解保温 1 h,加入 54 mL正己烷 ,在
45℃以 500 r /min提取 5 h,考察不同酶浓度对万寿菊
花粉末中叶黄素提取率的影响 ,结果见图 2。
由图 2发现 ,纤维素酶浓度对叶黄素的提取率有一
定影响 ,当少量的纤维素酶作用于万寿菊花粉时 ,对细
胞壁的降解效果较差 ;酶浓度超过 3%时 ,降解效果较
好 ,叶黄素提取率较高。从大规模工业化生产的角度 ,酶
浓度宜选 3% 。但是 ,酶浓度为 3% 、 5%、 7%时 ,叶黄素
的提取率分别为 82. 89% 、 83. 63% 、 84. 21% ,略有增
加 ,为保证试验中酶始终具有较高活性并获得较高的叶
黄素提取率 ,在下面的单因素试验中酶浓度暂定为
7% ,这与正交试验中酶浓度略高叶黄素的提取率也略
高相一致。
图 2　酶浓度对叶黄素提取率的影响
Fig. 2　 Effects o f enzym e concentr ation
on ex tr action yield o f lutein
233　第 5期 李大婧等: 酶为介质有机溶剂提取万寿菊花中叶黄素的工艺研究
2. 3　搅拌速度对叶黄素提取率的影响
取 2 g花粉末 ,以 7%液态纤维素酶 50℃分别酶解
保温 1 h ,加入 54 mL正己烷 ,在 45℃分别以 300、 500、
700、 900 r /min提取 5 h,考察提取时不同搅拌速度对
万寿菊花粉末中叶黄素提取率的影响 ,结果见图 3。 搅
拌速度对万寿菊叶黄素的提取有较大影响 ,开始随着搅
拌速度的增加 ,提取率明显增加 ,搅拌速度达 700 r /min
时 ,提取率达 94. 88% ,大部分叶黄素被提取出来 ;搅拌
速度继续增加达 900 r /min时 ,搅拌强度较大 ,叶黄素
损失较多 ,提取率下降 ,同时对试验设备要求较高 ,因此
搅拌速度选择 700 r /min为宜。
图 3　搅拌速度对叶黄素提取率的影响
Fig . 3　 Effects of agita tion r ate on ex tr action yield o f lutein
2. 4　提取时间对叶黄素提取率的影响
取 2 g花粉末 ,以 7%液态纤维素酶 50℃分别酶解
保温 1 h,加入 54 mL正己烷 ,在 45℃分别以 700 r /min
提取 1、 2、 3、 4、 5 h ,考察不同提取时间对万寿菊花粉末
中叶黄素提取率的影响 ,结果见图 4。 随着提取时间的
增加 ,提取率逐渐增加 ,提取 3 h时提取率达 88. 01% ,
5 h时达 94. 88% ,大部分叶黄素被提取出来 ,提取效果
较好。由于提取 5 h时间过长 ,搅拌等能耗增加 ,而提取
3 h时提取率也能满足要求 ,尤其对大规模工业化生
产 ,可提高效率 ,缩短生产周期 ,综合考虑 ,在下面的试
验中提取时间暂定为 3 h。
图 4　提取时间对叶黄素提取率的影响
Fig. 4　 Effec ts o f ex traction time on ex traction
yield o f lutein
2. 5　保温时间对叶黄素提取率的影响
取 2 g花粉末 ,以 7%液态纤维素酶 50℃分别酶解
保温 0、 0. 5、 1、 1. 5、 2 h,加入 54 mL正己烷 ,在 45℃以
700 r /min提取 3 h,考察提取前不同保温时间对万寿
菊花粉末中叶黄素提取率的影响 ,结果见图 5,没有酶
解保温步骤 ,叶黄素提取效果很差 ,纤维素酶不能充分
发挥降解作用 ;随着保温时间的增加 ,提取率逐渐增加 ,
当达到 1. 5 h时 ,提取率达 90. 91% ,保温时间继续增
加 ,提取率变化不大 ,这说明保温时间为 1. 5 h时 ,纤维
素酶可以充分降解细胞壁 ,叶黄素提取效果较好。
图 5　萃取前保温时间对叶黄素提取率的影响
Fig. 5　 Effects o f incubation time prev ious
to ex traction on ex tr action yield o f lutein
2. 6　液料比对叶黄素提取率的影响
取 2 g花粉末 ,以 7%液态纤维素酶 50℃分别酶解
保温 1. 5 h ,液料比分别为 15、 20、 25、 30加入正己烷 ,在
45℃分别以 700 r /min提取 3 h,考察提取时不同液料
比对万寿菊花粉末中叶黄素提取率的影响 ,结果见图
6。
图 6　液料比对叶黄素提取率的影响
Fig . 6　 Effects of r atio of liquid to mate rial
on ex tr action yield o f lutein
由图 6发现 ,不同液料比对万寿菊花中类胡萝卜的
提取效果影响不大 ,液料比为 15,提取率相对较低 ;当
液料比在 20～ 30的范围内时 ,提取率变化不大 ,因此可
以确定提取时液料比在 20即可。
2. 7　提取温度对叶黄素提取率的影响
取 2 g花粉末 ,以 7%液态纤维素酶 50℃分别酶解
保温 1. 5 h,加入 54 mL正己烷 ,在 20、 28、 36、 44、 52℃
分别以 700 r /min提取 3 h,考察不同提取温度对万寿
菊花粉末中叶黄素提取率的影响 ,结果见图 7。 提取温
度 20、 28、 36、 44、 52℃时 ,提取率在 85%～ 92%之间变
化 ,但变化并不明显。
2. 8　酶为介质有机溶剂提取叶黄素工艺条件优化
根据单因素试验结果 ,以 60目的万寿菊花粉末为
234 农业工程学报 2007年　
图 7　提取温度对叶黄素提取率的影响
Fig. 7　 Effec ts o f ex traction tempera ture
on ex tra ction yield o f lutein
原料 ,在液料比为 20的条件下 ,设计如表 1所示的因素
水平进行正交试验。为提高生产效率 ,保温时间范围定
在 0～ 1. 5 h。由于单因素试验中发现搅拌速度大于
800 r /min时 ,搅拌强度大 ,试验条件不容易控制 ,不宜
于放大生产 ,同时将转速条件进一步细化 ,因此搅拌速
度水平选择在 400～ 700 r /min的范围。试验结果极差
和方差分析见表 2、表 3(表 2中的提取率为 3次试验结
果的平均值 )。
表 1　酶为介质 -有机溶剂提取叶黄素正交试验因素水平表
Table 1　 Facto rs and levels of o rthogona l experim ent on lutein
ex tr action w ith enzym ed-m edia ted o rg anic so lv ent
水平
因　　素
A
酶浓度
/%
B
搅拌速度
/r· min- 1
C
保温时间
/h
D
提取时间
/h
E
提取温度
/℃
1 1 400 0 1 28
2 3 500 0. 5 2 36
3 5 600 1 3 44
4 7 700 1. 5 4 52
对正交试验结果进行极差分析 ,确定 5因素极差由
大到小依次为提取时间 ( 11. 76)、提取前保温时间
( 9. 63)、酶浓度 ( 6. 84)、搅拌速度 ( 6. 79)、提取温度
( 3. 26)。对正交试验结果进行方差分析 , F0. 05 ( 3, 3) =
9. 28,提取时间 FD > 9. 28,萃取前保温时间 FC >
9. 28,表示提取时间和萃取前保温时间对叶黄素提取率
有显著影响 ;方差分析中酶浓度 FA、搅拌速度 FB 在
0. 05水平不显著 ,但试验中发现它们对叶黄素提取率也
有一定影响 ,当酶浓度和搅拌速率较高时 ,叶黄素提取
效果较好 ;提取温度值 FE较小 ,对叶黄素提取率影响不
大 ,这也与添加的纤维素酶在 30～ 60℃的温度范围内
都能保持其活力有关。 所以为节省能耗 ,选择常温提取
即可。 根据表 2中极差分析结果 ,可以确定酶为介质有
机溶剂提取叶黄素的最优条件是酶浓度 7%、搅拌速度
700 r /min、萃取前保温时间 1. 5 h、提取时间 3 h。在对
工艺参数进行验证时 ,在 30℃采用上述提取条件 ,绝大
部分叶黄素已被提出 ,叶黄素的提取率可达 92. 37% 。
表 2　酶为介质 -有机溶剂提取叶黄素正交试验结果
Table 2　 Results of o rtho gona l experiment on
enzyme-media ted o rg anic solv ent ex tr action o f lutein
序
号
A
酶浓度
B
搅拌速度
C
保温时间
D
提取时间
E
提取温度
提取率
/%
1 1 1 1 1 1 57. 38
2 1 2 2 2 2 72. 91
3 1 3 3 3 3 78. 73
4 1 4 4 4 4 81. 29
5 2 1 2 3 4 78. 36
6 2 2 1 4 3 74. 27
7 2 3 4 1 2 74. 42
8 2 4 3 2 1 78. 07
9 3 1 3 4 2 79. 28
10 3 2 4 3 1 86. 48
11 3 3 1 2 4 64. 77
12 3 4 2 1 3 75. 58
13 4 1 4 2 3 76. 27
14 4 2 3 1 4 72. 66
15 4 3 2 4 1 85. 23
16 4 4 1 3 2 83. 52
K 1 217. 73 218. 47 209. 96 210. 03 230. 37
K 2 228. 84 229. 74 234. 06 219. 02 232. 60
K 3 229. 58 227. 36 231. 56 245. 32 228. 64
K 4 238. 26 238. 85 238. 85 240. 05 222. 81
k1 72. 58 72. 82 69. 99 70. 01 76. 79
k2 76. 28 76. 58 78. 02 73. 01 77. 53
k3 76. 53 75. 79 77. 19 81. 77 76. 21
k4 79. 42 79. 62 79. 62 80. 02 74. 27
R 6. 84 6. 79 9. 63 11. 76 3. 26
表 3　试验结果的方差分析及显著性检验
Table 3　 Variance analy sis o f experiment r esults
and significance test
方差来源 偏差平方和 自由度 F F0. 05 显著性
A 94. 42 3 4. 04 9. 28
B 93. 54 3 4. 00 9. 28
C 218. 28 3 9. 33 9. 28 *
D 376. 60 3 16. 10 9. 28 *
E 23. 40 3 1. 00 9. 28
误差 23. 39 3
　* :因子对性能在 0. 05水平上的影响显著性。
2. 9　酶为介质有机溶剂提取法与有机溶剂提取法的比
较
采用酶为介质有机溶剂提取法与有机溶剂法对叶
黄素提取效果进行比较。 以万寿菊花粉末为原料 ,在上
述酶法优选工艺条件下 ,验证试验中叶黄素的提取率可
达 92. 37% ,而以不加酶直接用正己烷提取的有机溶剂
组叶黄素的提取率仅为 77. 53% ,提取效果差 ,不能把
绝大多数叶黄素提取出。这说明液态纤维素酶能较好地
降解植物细胞壁 ,使万寿菊花粉末中更多的叶黄素释放
235　第 5期 李大婧等: 酶为介质有机溶剂提取万寿菊花中叶黄素的工艺研究
出来。
3　结　论
由于在有机溶剂提取方法中叶黄素的提取率较低 ,
本试验提出一种酶处理和溶剂萃取同时进行的方法生
产叶黄素。试验结果表明 ,酶为介质有机溶剂提取万寿
菊花中叶黄素工艺条件受多种因素影响 ,如原料粒度、
酶浓度、料液比、提取前保温时间、搅拌速度、提取时间、
提取温度等 ,其中提取时间、萃取前保温时间、酶浓度、
搅拌速度对叶黄素提取率影响较大。确定酶为介质有机
溶剂提取叶黄素较适宜的工艺条件为: 2. 000 g粒度 60
目的万寿菊花粉末、酶浓度为 7% ( m /m )、液料比为 20、
萃取前保温时间为 1. 5 h、搅拌速度为 700 r /min、提取
时间为 3 h ,对此工艺条件进行验证叶黄素提取率可达
92. 37% 。而单纯的有机溶剂法叶黄素提取率仅为
77. 53% ,此方法明显优于单纯的有机溶剂法。
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Enzyme-mediated organic solvent extraction of lutein
from marigold flower(Tagetes erecta )
Li Dajing
1, 2
, Liu Chunquan
1※
, Fang Guizhen
3
( 1. Institute of Application of Atomic Energy in Agriculture , J iangsu Academy of Agricultural Sciences,
Nanjing 210014, China; 2. College of Forestry , Northeast Forestry University , Harbin 150040, China;
3. College of Material Science and Engineering , Northeast Forestry University , Harbin 150040, China )
Abstract: A tech nolog y fo r ex t racting lutein f rom marigo ld flower mea l w as studied by using simultaneous
cellulo lytic enzyme treatment and o rg anic solv ent ex t raction methods. The optimal conditions in the enzyme-
media ted o rganic solv ent ex t raction process were investiga ted. The resul ts show that the prima ry facto rs w hich
af fected the enzyme-mediated organic solv ent ex traction are ex t raction time, incubation time previous to ex t rac-
tion, enzyme concentration and agi tation ra te in the ex t raction process in compa rison w ith the o thers. The opti-
mal condi tions are as follow s: 2. 000 g 60 mesh marig old f low er meal as material , 7% ( m /m, f low er meal ) liquid
cellulase concentration fo r 1. 5 h incuba tion and 3 h ex t raction dura tion wi th 700 r /min agitation rate in combina-
tion wi th 20∶ 1( vo lume /weight ) solv ent to solid weight ratio, under w hich high ex traction yield ( 92. 37% ) of
lutein can be achiev ed by means of v erification test. In addi tion, the ex t raction yield of lutein ex t racted by using
sing le o rg anic solvent is just 77. 53% and the resul ts suggest tha t the enzyme-mediated organic solv ent ex t raction
process is superior to sing le o rg anic so lv ent ex t ration method.
Key words: marigold flow er ( Tagetes erecta L. ) ; lutein; cellulase; ex t raction tech nolog y
236 农业工程学报 2007年