全 文 ：· 1188 · 中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年4月第31卷第4期 CJTCMP , April 2016, Vol . 31, No. 4
·论著·
藤梨根总三萜化合物通过下调N-Cadherin、Snail
抑制BGC-823胃癌细胞侵袭的体内外实验研究
张广顺1，张光霁1，廖广辉1，楼招欢1，徐楚韵1，申力1,2
（1浙江中医药大学，杭州 310053；2中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700）
摘要：目的：考察藤梨根总三萜化合物（KRTC）对BGC-823胃癌细胞的侵袭能力和肿瘤活性的影响。方
法：体外实验通过Transwell实验分析KRTC对BGC-823胃癌细胞侵袭能力的影响，Western blot实验分析KRTC对上
皮-间质转化相关标记蛋白表达的影响；体内实验通过构建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型研究KRTC抗肿瘤生长的有效
性，并通过免疫组织化学法检测N型钙黏蛋白（N-Cadherin）、Snail的表达。结果：与表皮生长因子（EGF）组比
较，EGF+KRTC组穿过聚碳酸脂膜的细胞数量明显减少（P<0.01），N-Cadherin、Snail表达明显下调（P<0.01）；
KRTC能够抑制BGC-823胃癌移植瘤的生长，中、高剂量组有显著性差异（P<0.01）。与模型组比较，给药组中
N-Cadherin、Snail的表达明显下调（P<0.01）。结论：KRTC能够抑制BGC-823胃癌细胞的侵袭并能抑制胃癌移植
瘤生长，下调核转录因子Snail进而引起N-Cadherin下调可能是其实现抗胃癌的机制之一。
关键词：藤梨根总三萜化合物；胃癌；肿瘤侵袭；N型钙黏蛋白；Snail
基金资助：国家自然科学基金项目（No.81273904，No.81403199），浙江省自然科学基金项目（No.
LQ13H290001）
Kiwi root triterpene compounds inhibited the invasion of BGC-823 gastric cancer cells by
downregulating N-Cadherin and Snail in vivo and in vitro
ZHANG Guang-shun1, ZHANG Guang-ji1, LIAO Guang-hui1, LOU Zhao-huan1,
XU Chu-yun1, SHEN Li1,2
( 1Zhejiang Chinese Medical Univesity, Hangzhou 310053, China; 2Station for Post-doctoral Research, China Academy of
Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China )
Abstract: Objective: To investigate the effects of Kiwi root triterpene compounds (KRTC) on the invasion and activity
of BGC-823 gastric cancer cells. Methods: The infl uence of KRTC in the invasion of BGC-823 gastric cancer cells was analyzed
with Transwell experiment; EMT related marker proteins were analyzed by Western blot experiment in vitro. The inhibitory
effect of KRTC on the growth of tumor was observed on the basis of the subcutaneous transplantation tumor nude model. The
immunohistochemistry was used to detect the protein expression of N-Cadherin and Snail. Results: Compared with EGF group, the
number of cells through the polycarbonate membrane in EGF+KRTC group was decreased signifi cantly (P<0.01), and the protein
expression of N-Cadherin and Snail were downregulated significantly (P<0.01). KRTC could inhibit the growth of BGC-823
gastric cancer transplanted tumor, but there was statistical signifi cantly difference in the inhibitory effect between the middle and
the high dose group (P<0.01). Compared with the model group, the expression of N-Cadherin and Snail in the drug administration
group were decreased (P<0.01). Conclusion: KRTC can inhibit the invasion of BGC-823 gastric cancer cells as well as the growth
of gastric cancer transplanted tumor. Its mechanism may be related to a down-regulation of the nuclear transcription factor Snail,
resulting in the decrease of N-Cadherin.
Key words: Kiwi root triterpene compounds; Gastric cancer; Tumor invasion; N-Cadherin; Snail
Funding: National Natural Science Foundation of China (No.81273904, No.81403199), Natural Science Foundation of
Zhejiang Province (No.LQ13H290001)
通讯作者：申力，北京市东城区东直门内南小街16号中国中医科学院博士后科研流动站，邮编：100700，电话：0571-86613586
E-mail：shenli1116@126.com
· 1189 ·中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年4月第31卷第4期 CJTCMP , April 2016, Vol . 31, No. 4
我国属胃癌高发区，每年新发现40万胃癌患者，
占世界发病人数的42%，并呈年轻化趋势[1]。转移和
复发是胃癌患者的主要死亡原因，也是影响临床治
疗和预后的主要因素。到目前为止，手术治疗仍是主
要的治疗手段，但大多数患者在明确诊断时已是中
晚期，虽经手术切除、化疗等综合治疗，但联合化疗
总体反应率也只有44%-49%[2]。因此寻找安全合理
的抗转移药物是目前研究的重点。
中药藤梨根性凉，味酸、微涩，无毒，主要功效
为利湿消肿、清热解毒，临床常用于胃癌、食管癌、
肠癌等消化道肿瘤的治疗。国内应用藤梨根进行抗
肿瘤治疗的临床及基础研究也日益增多，显示出其
具有较好的抗肿瘤作用[3-4]，但笔者目前尚未见对藤
梨根总三萜化合物（Kiwi root triterpene compounds，
KRTC）抑制肿瘤侵袭转移的研究的相关报道。本研
究通过体内外研究初步揭示了KRTC抑制BGC-823胃
癌细胞的侵袭转移能力及可能的作用机制。
材料
1. 细胞株与动物 BGC-823胃癌细胞，由浙江
省中医院中心实验室提供；SPF级雄性BALB/c-nu裸
鼠30只，5周龄，体质量17-20g，生产许可证号：SCXK
（沪）2007-0005。
2. 药品与试剂 KRTC（母液浓度为483mg/
mL），由浙江中医药大学药物研究所提供；胎牛
血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：
110311）；结晶紫（武汉谷歌生物科技有限公司，货
号：gr-C8470）；Transwell板（Corning incorporated，
货号：3422）；BD Matrigel™（Becton, Dickinson
and Company，货号：356234）；β-act in（Santa
Cruz Biotechnology，货号：sc-1616r）；波形蛋白
（Vimentin）（BIOSS，货号：BS-0756R）；E型钙黏
蛋白（E-Cadherin）（货号：3195p）、N型钙黏蛋白
（N-Cadherin）（货号：4061）、Snail（货号：4719）均
购自Cell Signaling Technology。
3. 仪器 CO2恒温培养箱（SANYO，型号：MCO-
15AC）；洁净工作台（苏净安泰，型号：SW-CJ-
1FD）；倒置荧光显微镜（Nikon，型号：TE2000）。
方法
1. MTT法检测KRTC对BGC-823细胞增殖的影
响 将对数生长期的BGC-823细胞，以5×103个/孔接
种于96孔培养板，100μL每孔，孵育24h后更换新鲜
培养液，加入不同药物终浓度的KRTC，孵育24、48、
72h后，每孔加入MTT 20μL，继续孵育4h。倾去药液
及培养液, 每孔加入二甲基亚砜150μL，酶标仪振荡
10min，充分溶解沉淀后，在酶标仪490nm条件下，检
测吸光度数值（OD值），计算抑制率[5]。
2. Transwell实验考察KRTC对BGC-823细胞侵
袭能力的影响 BGC-823细胞以7×105个细胞接
种在6孔板上，加入2mL含10%FBS的RPMI1640细
胞培养基。培养24h至细胞达到70%-90%。按下列
方式处理：①空白组：常规培养；②表皮生长因子
（epidermal growth factor，EGF）组：100ng/mL EGF
处理24h；③KRTC组：1.5mg/mL的KRTC处理24h；
④EGF+KRTC组：1.5mg/mL KRTC预处理2h，再加
100ng/mL EGF共培养24h。收集处理好的细胞，分别
制成105个/mL悬液，取1mL细胞悬液于1 500r/min离心
5min，弃上清液。加入200μL无血清培养基，吹打均
匀后放入提前制备好的Transwell小室中（BD matrigel
和RPMI1640以1∶3的比例稀释，吸取50μL加入
Transwell的上室中，无菌放置室温干燥）。Transwell
板中加入500μL含20%FBS的RPMI1640的完全培养
基，将小室放入板中。37℃下常规培养48h。将小室取
出，用PBS洗去培养基，70%甲醛固定微孔膜下层的
细胞，结晶紫染色10min，用棉签擦去聚碳酸脂微孔
滤膜上层的细胞，在倒置显微镜（×200）下计数细
胞，每个样本随机计数5个视野。
3. Western blot实验分析KRTC阻断胃癌上皮-间质
转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）发生 药
物作用72h后RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白。30μg
蛋白进行4%-12%SDS-PAGE凝胶电泳、转PVDF膜、
5%脱脂牛奶室温封闭1h，目标蛋白一抗4℃过夜、羊抗
兔二抗室温1h，ECL化学发光检测试剂盒检测EMT标
记蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin及转录因子
Snail的表达变化。
4. 皮下移植瘤疾病模型研究KRTC抗胃癌转移
的有效性
4.1 动物模型的建立 收集对数生长期的胃癌
BGC-823细胞，以0.9%氯化钠溶液调整细胞浓度至
5×107/mL，以每只0.2mL皮下注射接种裸鼠，待瘤块
约为1cm×1cm大小时剥取瘤组织，做为皮下抑制瘤
的瘤源；将瘤组织切为1mm3的小瘤块备用，将裸鼠
麻醉，用剪刀在皮下剪一小切口，将小瘤块植入，用
OB胶将切口粘合。
4.2 分组 造模成功后，待肿瘤长至平均瘤体
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积在100mm3左右时随机分为KRTC高、中、低剂量
（100、50、25mg·kg-1·d-1）组及模型组（0.9%氯化
钠溶液），每组6只。灌胃给药，且均用0.9%氯化钠溶
液调至相同体积，连续给药4周。
4.3 免疫组化两步法检测N-Cadherin、Snail的
表达 停药后第2天，脱臼处死小鼠，分离出肿瘤组
织，并将组织保存于福尔马林中，制备石蜡切片，免
疫组化两步法[6]检测计算各切片的阳性指数。组内
每张切片随机挑选3个400倍视野进行拍照。应用
Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析得出每张
照片阳性的累积光密度值（IOD）。IOD值越大，阳性
表达越强。
5. 统计学方法 所有数据均用SPSS 19.0软件包
进行统计处理，计量资料用x-±s表示。Transwell穿膜
细胞数、蛋白表达水平等数据用One-way ANOVA统
计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1. KRTC对BGC-823细胞增殖能力的影响 见图
1。KRTC能明显抑制BGC-823细胞的增殖。KRTC作
用于BGC-823细胞24、48、72h的IC50分别为2.6、3.1、
3.7mg/mL。而1.5mg/mL KRTC作用BGC-823细胞24、
48、72h的抑制率分别为9.8%、14.1%和18.9%。此浓
度对细胞活力影响不明显，故选用1.5mg/mL进行下
面的体外侵袭实验。
图1 KRTC对BGC-823细胞增殖的影响
2. KRTC对BGC-823细胞侵袭能力的影响 见图
2-图3。BGC-823细胞经EGF刺激后，穿过聚碳酸脂
膜的细胞数目明显增多（P＜0.01），而用没有细胞毒
性的KRTC（1.5mg/mL）预处理后EGF组穿过聚碳酸
脂膜的细胞数量明显减少（P＜0.01）。提示KRTC具
有抑制EGF刺激引起的BGC-823细胞侵袭。
3. KRTC对EMT关键蛋白N-Cadherin、E-Cadherin、
Viment in、Snai l表达的影响 见图4-图5。与正
常组比较，EGF组N-Cadher in、Snail表达上调，
EGF+KRTC组显著下调（P<0.01），而E-Cadherin、
Vimentin无显著性变化。
图2 KRTC对BGC-823细胞侵袭能力的影响
注：A. 正常组；B. EGF组；C. KRTC组；D. EGF+KRTC组。下图同。
A
C
B
D
图3 各组穿过Transwell小室的细胞个数比较（n=3）
注：与正常组比较，**P＜0.01；与EGF组比较，△△P<0.01。图5同。
A CB D
**
△△ △△
图4 各组肿瘤组织中N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、
Snail的表达情况
BA C D
N-Cadherin
E-Cadherin
Vimentin
Snail
β-actin
图5 各指标相对灰度值的比较（n=3）
0.8
A AC CB BD D
0.8
0.4 0.4
0.6 0.6
0.2 0.2
0 0
△△
N-
Ca
dh
eri
n/β
- ac
tin

E-
Ca
dh
eri
n/β
- ac
tin

A AC CB BD D
0.8 0.8
0.4 0.4
0.6 0.6
0.2 0.2
0 0
△△ △△
**
Vi
me
nti
n/β
- ac
tin

Sn
ail
/β-
ac
tin

△△
· 1191 ·中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年4月第31卷第4期 CJTCMP , April 2016, Vol . 31, No. 4
4. KRTC对胃癌裸鼠皮下移植瘤的影响 见图
6。从皮下移植瘤的生长曲线可以看出，低、中、高剂
量组的KRTC均表现出了延缓BGC-823细胞生长的
特性。且随着给药时间的延长，KRTC低、中、高剂量
组抑制肿瘤生长的速度越来越明显。给药4周后，与
模型组比较，KRTC中、高剂量组肿瘤体积明显减小
（P<0.01）。
图6 各组裸鼠肿瘤的生长曲线比较
肿
瘤
体
积（
mm
3 ）
给药天数（d）
5. KRTC对BGC-823肿瘤组织N-Cadherin、Snail
表达的影响 见图7，表1。免疫组织化学结果表明，
与模型组比较，给药组中N-cadherin、Snail的表达
显著下调（P<0.01），且随剂量的增高，N-cadherin、
Snail下调作用越明显（P<0.01）。
图7 各组肿瘤组织中N-Cadherin、Snail的表达情况
（免疫组化×400）
N-
Ca
dh
eri
n
Sn
ail
表1 各组肿瘤组织中N-Cadherin、Snail的平均光密度值
（x-±s，n=6）
组别 N-Cadherin Snail
模型组 56 327.49±7 421.58 13 954.08±2 169.04
KRTC低剂量组 22 352.32±4 455.98** 7 758.69±570.51**
KRTC中剂量组 13 197.63±1 306.98△△ 5 916.10±573.24△△
KRTC高剂量组 10 166.74±825.25△△▲▲ 3 675.96±893.33△△▲▲
注：与模型组比较，**P＜0.01；与KRTC低剂量组比较，△△P＜0.01；
与KRTC中剂量组比较，▲▲P＜0.01。
讨论
三萜是一类具有独特空间结构的生物活性天然
产物，不仅在抗炎、抗菌、保肝护肾等方面有着重要
的应用价值，还具有很强的抗肿瘤活性[7]。Patrick Y
K等[8]发现人参皂苷20（R）-Rg3可以干扰血管生成的
多个环节，通过抑制血管生成等抑制肿瘤的生长和
转移。赵若琳等[9]发现桔梗皂苷-D能抑制非小细胞
肺癌H460和A549细胞黏附、侵袭和迁移。KRTC系
从藤梨根中提取出来的三萜类成分，在本研究中，亦
显示出了较好的抗肿瘤活性。
近年研究发现EMT与胃癌浸润转移密切相
关[10-11]。EMT是极性上皮细胞转换为具有活动能
力、能够在细胞基质间自由移动的细胞的过程，是
恶性肿瘤发展过程中的一个重要现象，该过程包括
细胞形态学的改变和基因型的改变，其中以上皮细
胞向间质细胞转分化为主要特征，在此过程中上皮
标志物E-Cadherin表达下调，间质标志物Vimentin、
N-Cadherin等表达上调，引起上皮源性肿瘤细胞失
去细胞极性，细胞连接疏松，胞内骨架蛋白重组，一
系列的改变使肿瘤的黏附能力下降，迁移能力增加，
使得肿瘤细胞更易于离开原有位置发生转移。随着
EMT研究的不断深入，发现肿瘤基质成纤维细胞、
内皮细胞等分泌的EGF是恶性肿瘤EMT发生的主要
诱导因子之一，EGF可以通过活化多条信号通路上调
Snail-1、Slug和Twist等的转录表达，进而增强上皮和
间质细胞分子标记物、基质金属酶、血管黏附因子、
炎性趋化因子等表达，导致细胞黏附能力下降、侵
袭性增加和运动迁移能力增强[12-14]。在Transwell实
验通过EGF刺激BGC-823胃癌细胞，可以使BGC-823
胃癌细胞穿过聚碳酸脂膜的细胞数目明显增多，而用
KRTC预处理后EGF刺激组穿过聚碳酸脂膜的细胞
数量明显减少，提示KRTC具有抑制EGF刺激引起的
BGC-823细胞侵袭。
研究[15]发现Snail、Slug等转录因子可与保守
E-box结合抑制一些基因的表达，包括E-Cadherin、
紧密连接蛋白等的表达，同时Snail和Slug还可直
接抑制上皮标记物Cytokeratin-8、Mucin-1的表达和
促进RhoB的形成，促使EMT的发生并提高细胞侵
袭转移的能力[16-17]、Western blot实验中，EGF组中
N-Cadherin、Snail表达明显上调，KRTC预处理后
N-Cadherin，Snail表达明显下调，提示KRTC可能通
过下调核转录因子Snail进而引起N-Cadherin下调抑
制BGC-823细胞侵袭。
从胃癌的生长曲线和瘤体大小的比较可以看
出，KRTC低、中、高剂量组的KRTC均表现出了延
缓BGC-823细胞生长的活性，且随着给药时间的延
· 1192 · 中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年4月第31卷第4期 CJTCMP , April 2016, Vol . 31, No. 4
长，中、高剂量组抑制肿瘤生长的速度越来越明显，
显示了KRTC较好的抗肿瘤活性。通过对胃癌组织
的免疫组织化学分析发现KRTC干预后胃癌组织中
Snail、N-Cadherin的表达亦显著下调，这与本研究在
体外实验中的发现是一致的。钙黏蛋白是细胞黏附
分子中的一个家族, 其中N-Cadherin和E-Cadherin是
与肿瘤转移关系最密切的两种类型。N-Cadherin在
上皮组织中的异位表达可以影响上皮细胞的形态和
行为，诱导其向间质转化，即产生EMT[18]。本研究中
Snail、N-Cadherin显著下调。表明Snail、N-Cadherin
是KRTC发挥抗胃癌作用的关键。
本研究通过体内和体外两个方面考察了KRTC
对BGC-823胃癌细胞的侵袭能力以及对胃癌裸鼠移
植瘤的作用效果的影响。初步揭示了KRTC具有较好
的抑制胃癌细胞的侵袭能力和抑瘤活性，表明KRTC
是一个具有潜力的抗肿瘤药物。但其抗胃癌转移的
具体分子机制，有待于进一步的研究。
参 考 文 献
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