全 文 ：不断积累经验，提升自身的专业水平。
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(编校:徐萌)
土槿皮乙酸对胰腺癌 AsPC － 1 细胞增殖和凋亡的影响
马 佳1，2，孟祥鹏3，李 岩1
Effects of pseudolaric acid B on the proliferation and apoptosis in pancreatic carcinoma
cell line AsPC－ 1
Ma Jia1，2，Meng Xiangpeng3，Li Yan1
1Department of Gastroenterology，Shengjing Hospital of China Medical University，Liaoning Shenyang 110004，China;2Department of Gas-
troenterology，The Fourth Affiliated Hospital of China Medical University，Liaoning Shenyang 110032，China;3Department of Pancreatic
and Breast General Surgery，Shengjing Hospital of China Medical University，Liaoning Shenyang 110004，China．
【Abstract】 Objective:To examine the effects of pseudolaric acid B (PAB)on the proliferation and apoptosis of
human pancreatic carcinoma cell line ASPC － 1．Methods:ASPC － 1 cells cultured in vitro were treated with various
concentrations (0． 5，1． 0，2． 0，4． 0，8． 0μmol /L)of PAB at various intervals． Growth inhibition was analyzed by 3 －
(4，5 － dimethylthiazol － 2 yl)－ 2，5 － diphenyltetrazolium bromide (MTT)assay． Apoptotic cells were detected by
flow cytometry． Ｒesults:Pseudolaric acid B inhibited the proliferation of ASPC － 1 cells in a time － and dose － de-
pendent manner． The inhibition ratio was (4． 53 ± 3． 32)% after the cells were treated with 0． 5μmol /L PAB for 24h，
and the ratio was (52． 22 ± 1． 71)% after the cells were treated with 8． 0μmol /L PAB for 72h． ASPC － 1 cells treated
with 8． 0μmol /L PAB for 24h showed significantly enhanced apoptosis as compared with the control cells (8． 19% vs
30． 86%，P ＜ 0． 05)．Conclusion:PAB can dramatically suppress the ASPC－1 cell growth and induce cell apoptosis．
【Key words】pseudolaric acid B(PAB);pancreatic carcinoma;proliferation;apoptosis
Modern Oncology 2015，23(09) :1195 － 1198
【收稿日期】 2014 － 09 － 21
【修回日期】 2014 － 10 － 19
【作者单位】 1中国医科大学附属盛京医院消化内科，辽宁 沈阳 110004
2中国医科大学附属第四医院消化内科，辽宁 沈阳 110032
3中国医科大学附属盛京医院胰腺乳腺外科，辽宁 沈阳 110004
【作者简介】 马佳(1987 －)，女，辽宁沈阳人，医师，主要从事胰腺癌的诊断与治疗。E － mail:dorothy_mj@ 126． com
【通讯作者】 李岩(1956 －)，男，辽宁沈阳人，主任医师，博士生导师，主要从事消化道肿瘤的诊断、治疗及机制研究。
·5911·现代肿瘤医学 2015 年 05 月 第 23 卷第 9 期 MODEＲN ONCOLOGY，May. 2015，VOL. 23，NO. 09
【摘要】 目的:观察土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)对胰腺癌 AsPC － 1 细胞增殖和凋亡的影响。方法:
体外培养胰腺癌 AsPC － 1 细胞，用不同浓度 PAB作用不同时间后，MTT法检测 PAB对 AsPC － 1 细胞增殖的
影响，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:MTT 结果表明 PAB 以时间和剂量依赖的方式抑制 AsPC － 1 细胞
生长，流式结果显示 8． 0μmol /L PAB处理 AsPC － 1 24 小时后，凋亡率由对照组的 8． 19%升高至 30． 86%，差
异有统计学意义(P ＜ 0． 05)，表明 PAB 可诱导胰腺癌细胞凋亡，呈剂量依赖性。结论:土槿皮乙酸以时间和
剂量依赖的方式抑制胰腺癌 AsPC － 1 细胞增殖并诱导其凋亡。
【关键词】土槿皮乙酸;胰腺癌;增殖;凋亡
【中图分类号】Ｒ735． 9 【文献标识码】A DOI:10． 3969 / j． issn． 1672 － 4992． 2015． 09． 06
【文章编号】1672 － 4992 －(2015)09 － 1195 － 04
胰腺癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，近 20 年来发病
率逐渐增高趋势明显［1］。胰腺癌早期诊断困难，恶性程度
高、发展较快、预后较差［2］。早期手术切除是目前治疗胰腺
癌最有效的措施［1］，放化疗、激素治疗、免疫治疗、分子靶向
治疗及中医中药治疗等亦受到广泛关注。土槿皮乙酸
(pseudolaric acid B，PAB)为土槿皮的主要活性成分，具有抗
真菌［3］、抗肿瘤［4］、抗血管生成［5］及抗微管形成［6］等作用。
本实验旨在观察其对胰腺癌 AsPC － 1 细胞增殖和凋亡的影
响，为胰腺癌的治疗及新药的开发提供依据，结果如下。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
ＲPMI 1640 细胞培养基购自 Gibco 公司;PAB 购自辽宁
药品新技术研究所，批号 110880;胎牛血清购自 Gibco 公司;
四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自 Sigma 公司;Annexin V － FITC /
PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限
公司。
1． 2 细胞系及细胞培养
人转移胰腺癌细胞株 AsPC － 1 来源于人胰腺癌裸鼠异
种移植产生的癌性腹水，可以表达 CEA、人胰腺相关抗原、人
胰腺特异性抗原和黏蛋白，呈上皮样贴壁生长，由我科传代
培养，接种于含 10%胎牛血清、100U /ml 青链霉素的 ＲPMI
1640 培养基，于 37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每
2 － 3 天传代一次。
1． 3 MTT法检测 PAB对 AsPC －1 细胞增殖的影响
收集对数生长期 AsPC － 1 细胞，调整细胞悬液浓度为 2
× 104 /ml，接种于 96 孔板，每孔 200μl。同时空白组加入
200μl培养液作为本底，对照调零。培养 12h 后，空白组和
对照组加入新鲜培养液200μl，实验组分别加入 PAB 浓度
为 0． 5、1． 0、2． 0、4． 0、8． 0μmol /L的培养液 200μl，每个剂量 5
个复孔。于 24、48、72h，每孔加入 MTT 20μl，继续培养 4h，小
心吸弃培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，避光振
荡 5 － 10min，酶标仪测 492nm 处的吸光度(A)值，计算细胞
生长抑制率，细胞生长抑制率(Ｒ)= (A对照组 － A实验组)/
(A对照组 － A空白组)× 100%。
1． 4 流式细胞术检测 PAB对 AsPC －1 细胞凋亡的影响
采用 Annexin V － FITC /PI双染法检测细胞凋亡率，分别
收集对照组和经 1． 0、2． 0、4． 0、8． 0μmol /L PAB 作用 24h 的
AsPC － 1 细胞，调整细胞浓度，按凋亡检测试剂盒说明处理
细胞，简要步骤如下:PBS 洗细胞二次;收集 5 × 105 个细胞，
加入 500μl Bingding Buffer 重悬细胞;加入 5μl Annexin V －
FITC和 5μl PI 室温避光染色 15min，流式细胞仪检测，分析
凋亡率。
1． 5 统计学处理
采用 SPSS 17． 0 统计软件进行单因素方差分析，P ＜
0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 PAB抑制 AsPC －1 细胞的增殖
不同浓度 PAB 作用相同时间，随着药物浓度的增加对
AsPC － 1 细胞生长的抑制率呈增加趋势。0． 5μmol /L PAB
作用 24 小时，对细胞生长无显著影响，而 2． 0μmol /L PAB作
用 24 小时后，对细胞生长的抑制率为(17． 91 ± 3． 95)%，差
异有统计学意义(P = 0． 002)。相同浓度的 PAB作用不同时
间，随时间的延长抑制率亦增加。8． 0μmol /L PAB 作用 24
小时，对细胞的抑制率为(27． 92 ± 3． 51)%，作用 72 小时，对
细胞的抑制率为(52． 22 ± 1． 71)%，差异有统计学意义(P =
0． 002)。由此可见，PAB以时间及剂量依赖的方式抑制胰腺
癌 AsPC － 1 细胞的生长，见图 1。
图 1 PAB抑制 AsPC － 1 细胞增殖
Fig． 1 PAB inhibit the proliferation of AsPC － 1 cells
2． 2 PAB诱导 AsPC －1 细胞的凋亡
不同浓度 PAB作用 AsPC － 1 细胞 24 小时，其凋亡率随
着药物浓度的增加呈增加趋势。1． 0μmol /L PAB作用于 As-
PC － 1 细胞后，细胞凋亡率改变并不明显;但 8． 0μmol /L
PAB 作用 24 小时后，细胞凋亡率由对照组的(7． 86 ±
0． 47)%升高至(31． 26 ± 0． 56)%，差异有统计学意义(P ＜
0． 001)。由此可见，PAB 可诱导胰腺癌 AsPC － 1 细胞凋亡，
呈剂量依赖性，见图 2。
3 讨论
胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，因其早期诊断困
难、病程进展快、死亡率高受到人们广泛关注。目前胰腺癌
的治疗采取以手术治疗为主，放化疗、分子靶向治疗等为辅
的综合治疗。中医药治疗在延长患者生存期、缓解症状、改
善生存质量方面起到一定的作用。
土槿皮乙酸是从松科植物金钱松的根皮或近根皮部分
分离得到的新型二萜酸类化合物，为土槿皮的主要活性成
·6911· 马 佳，等 土槿皮乙酸对胰腺癌 AsPC － 1 细胞增殖和凋亡的影响
分。大量实验表明，其对胃癌［7］、肝癌［8］、结直肠癌［9］、黑色
素瘤［10］、乳腺癌［11 － 12］、宫颈癌［13］、前列腺癌［14］等多种肿瘤
具有抑制作用，但这些研究多是基于细胞或动物水平的研
究，并没有临床应用的相关报道。
图 2 PAB诱导 AsPC － 1 细胞凋亡
Fig． 2 PAB induce AsPC － 1 cells apoptosis
我们采用不同浓度 PAB 作用于 AsPC － 1 细胞不同时
间，MTT法结果显示 PAB 对 AsPC － 1 细胞增殖有明显的抑
制作用。随着浓度的增加和时间的延长，这种抑制作用逐渐
增强，提示 PAB可以抑制胰腺癌细胞 AsPC － 1 增殖，呈时间
和剂量依赖性。Annexin V － FITC /PI 双染检测细胞凋亡率，
结果显示，PAB作用 AsPC － 1 细胞 24 小时，随着药物浓度的
增加，细胞凋亡率明显增加。提示 PAB 可以诱导 AsPC － 1
细胞凋亡，呈剂量依赖性。
关于土槿皮乙酸抗肿瘤的作用机制目前尚不清楚，可能
与其作用于细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性蛋白激酶，影响
p53、Bcl － 2 家族、Caspase 活性及与肿瘤发生相关的细胞信
号传导途径等有关［4，15 － 18］。土槿皮乙酸主要抑制增殖活跃
的肿瘤细胞生长，对源于正常组织生长缓慢的细胞影响甚
微，动物移植瘤模型中，有效剂量为观察到毒性反应，且 PAB
可以抑制 P － 糖蛋白过度表达引起的肿瘤耐药［19］。Ko
JK［17］等的研究发现 PAB通过下调 C － myc，抑制 Bcl － xL 表
达，激活 Caspase － 3 及其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，
诱导结肠癌 HT － 29 细胞凋亡。徐永红等［20］研究发现 PAB
可以通过对 Bax和 Bcl － 2 表达进行调控，使线粒体膜电位下
降，激活 Caspase，进而诱导胃癌 SGC7901 细胞发生凋亡。田
杰等［21］研究发现 PAB可激活 Caspase － 3 的上游蛋白 Caspse
－ 8 和 Caspase － 9 来诱导细胞凋亡，同时 PAB通过 p53 蛋白
诱导人乳腺癌细胞 MCF － 7 凋亡。陈振军等［22］发现 PAB可
抑制大鼠脑胶质瘤 C6 细胞增殖，阻滞细胞周期中 G2 /M 期，
下调 PCNA表达为其可能的作用机制。土槿皮乙酸还可以
直接作用于微管蛋白，使微管蛋白解聚，抑制人微血管内皮
细胞的增殖、迁移和腔管形成，清除动物体内新形成的内皮
腔管和微血管［6］。
本实验发现 PAB可抑制胰腺癌 AsPC － 1 细胞生长，诱
导其凋亡，存在对胰腺癌的潜在治疗作用。但并未对其具体
作用机制进行探讨，需进一步研究，从而对中药的开发和应
用及肿瘤的治疗提供更多的依据。
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－ 487． (编校:徐萌)
hβ － arrestin2 基因重组质粒构建及蛋白表达和定位
刘彩红1，2，毛 琪1，郭文东1，朱亚勤1
Construction of the recombinant plasmid of human β － arrestin2 gene and the expression
and localization of fusion protein
Liu Caihong1，2，Mao Qi1，Guo Wendong1，Zhu Yaqin1
1The Key Laboratory of Medical Cell Biology of Ministry of Education，Department of Cell Biology，Division of Cell Pathobiology，College
of Basic Medical Science，China Medical University，Liaoning Shenyang 110001，China;2Department of Immunology，College of Medical
Laboratory Science and Technology，Harbin Medical University － Daqing，Heilongjiang Daqing 163319，China．
【Abstract】 Objective:To construct the expression plasmid of pEGFP － C1 － β － arrestin2 and identify the expres-
sion and localization of its fusion protein．Methods:Using pGEX － 5X － 1 － β － arrestin2 as template，we obtained hu-
man β － arrestin2 coding sequence by PCＲ amplification and cloned it into pEGFP － C1． After the recombinant plas-
mid was identified by enzyme digestion and sequencing，the plasmid was transfected into HEK293． The expression of
the recombinant plasmid in HEK293 was detected by Western blot． The localization of fusion protein in HEK293 was
observed by using laser scanning confocal microscopy． Ｒesults:The coding sequence of human β － arrestin2 was
cloned into pEGFP － C1． The expression of fusion protein with a molecular weight of 77 kDa was detected by Western
blot and localized in the cytoplasm of HEK293． Conclusion:The recombinant plasmid of hβ － arrestin2 gene was suc-
cessfully cloned into eukaryotic expression vector，and the fusion protein was localized in the cytoplasm of HEK293．
【Key words】hβ － arrestin2 gene;Western blot;green fluorescent protein
Modern Oncology 2015，23(09):1198 － 1200
【摘要】 目的:构建 pEGFP － C1 － β － arrestin2 融合蛋白表达载体，并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。
方法:以 pGEX － 5X － 1 － β － arrestin2为模板，PCＲ法扩增 hβ － arrestin2 编码序列，亚克隆至 pEGFP － C1 中，
pEGFP － C1 － β － arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞 HEK293，West-
ern blot检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在 HEK293 细胞中的分布。结果:hβ － ar-
restin2 编码序列被成功克隆至 pEGFP － C1 中，Western blot 检测到融合蛋白表达，分子量约为 77kDa，pEGFP
－ C1 － β － arrestin2定位于 HEK293 细胞的细胞质中。结论:成功构建 hβ － arrestin2 基因真核表达载体，证实
了融合蛋白定位在 HEK293 的细胞质中。
【关键词】hβ － arrestin2基因;蛋白质印记;绿色荧光蛋白
【中图分类号】Ｒ73 － 3 【文献标识码】A DOI:10． 3969 / j． issn． 1672 － 4992． 2015． 09． 07
【文章编号】1672 － 4992 －(2015)09 － 1198 － 03
【收稿日期】 2014 － 10 － 18
【修回日期】 2014 － 11 － 09
【基金项目】 辽宁省自然科学基金项目(编号:20092123);辽宁省重点实验室项目(编号:2009S108)
【作者单位】 1中国医科大学基础医学院细胞病理生物学研究室，细胞生物学教研室，教育部医学细胞生物学重点实验室，辽宁 沈阳
110001
2哈尔滨医科大学大庆校区医学检验与技术学院免疫教研室，黑龙江 大庆 163319
【作者简介】 刘彩红(1986 －)，女，黑龙江人，助教，硕士，主要从事细胞炎性应答机制与炎性相关肿瘤早期诊断的研究。E － mail:hongjiayou_
2006@ sina． com
【通讯作者】 朱亚勤(1963 －)，女，辽宁人，教授，博士生导师，主要从事细胞炎性应答机制与炎性相关肿瘤早期诊断的研究。
·8911· 刘彩红，等 hβ － arrestin2 基因重组质粒构建及蛋白表达和定位