全 文 ：苏铁（Cycas revoluta Thunb．）系苏铁科苏铁属
常绿乔木， 起源于 3亿年前的晚石炭纪， 是现存最
古老最原始的种子植物之一 [1-3]， 是国家一级重点
保护植物， 其树型优雅， 叶片别致， 其性味甘、
平、 涩， 有小毒， 具有体外抑制肿瘤细胞增殖的作
用等， 因此， 常将其水煎剂用于治疗多种肿瘤， 是
中国传统观的赏树种和药用植物 [4-6]。 而随着苏铁
的观赏价值和药用价值越来越受到人们的重视， 其
栽植规模越来越大， 随之而来的是病害的发生越来
越严重， 直接影响到植株的生长， 进而影响其观赏
价值。 目前国内对于苏铁叶枯病的研究多针对炭疽
菌 （Colletotrichum）和橄榄色盾壳霉 （Coniothyrium
olivaceum）所致的叶枯病 [7-8]， 拟茎点霉引起的苏铁
叶枯病还未见报道。
拟茎点霉属[Phomopsis（Sacc.）Bubák.]真菌是半
知菌亚门腔孢纲真菌。 一般侵染植物的叶、 枝及
果， 常引起的植物病害症状主要有溃疡、 烂茎、 果
腐， 叶枯、 枝枯等 [9-10]， 危害较大， 寄主广， 种类
多， 但由于种间形态差异小， 常见以寄生植物属内
拟茎点霉的形态比较来进行种类鉴定或命名， 据报
道该属寄主植物有 74 个科 136 个种[11]。
2009~2013 年， 在贵州城市苏铁盆景、 遵义植
热带作物学报 2014， 35（10）： 2066-2070
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2014-02-02 修回日期 2014-05-04
基金项目 贵州省科技创新人才团队项目（[2012]4004）； 贵州省 “生物学” 重点支持学科； 贵州省科技厅自然科学基金（黔科合 J 字 LKZS
[2014]20 号）。
作者简介 李小霞（1979 年—）， 女， 硕士， 副教授； 研究方向： 植物病原真菌学。 E-mail： xzj198099@163.com。
苏铁叶枯病病原菌鉴定
李小霞1，2， 肖仲久1，2， 许艾斌1，2， 徐刚红1，2
1 遵义师范学院， 生命科学学院， 贵州遵义 563002
2 贵州省赤水河流域植物资源保护与应用研究特色重点实验室， 贵州遵义 563002
摘 要 近年在贵州省苏铁各栽培地发现一种叶枯病害， 为明确其致病菌， 采集苏铁叶枯病叶片样本数份， 并
对病原菌进行形态观察、 致病性测定及 rDNA-ITS 序列分析。 结果表明： 经分离纯化获得的病原菌， 通过柯赫
氏法则， 接种后出现的病害症状与直接采集到的病害标样症状一致， 确定其为致病菌； 对病原菌进行传统的形
态学观察 ， 结果显示病原菌分生孢子器和分生孢子的形态与拟茎点霉一致 ； 将待测菌株 rDNA-ITS 序列与
GenBank 中相关菌株 ITS 序列进行同源性比较 ， 结果显示该菌株与 Phomopsis vaccinii（GenBank 登陆号为 ：
KC488259， JX846914）的同源性达 97％ 。 结合病原菌形态学特征及株 rDNA-ITS 序列 （GenBan 登录号 ：
JN417709）特征， 确定苏铁叶枯病病原菌为 Phomopsis cycadis.
关键词 苏铁； 拟茎点霉； 病原菌
中图分类号 S791.11 文献标识码 A
Identification of Leaf Blight Pathogen on Cycas revoluta Thunb
LI Xiaoxia1，2, XIAO Zhongjiu1，2, XU Aibin1，2， XU Ganghong1，2
1 Life Sciences Institute, Zunyi Normal College, Zunyi, Guizhou 563002, China
2 Key laboratory of Regional Characteristic for Conservation and Utilization of Plant
Resource in Chishui River Basin, Zunyi, Guizhou 563002, China
Abstract Leaf blight on Cycas revoluta Thunb was discovered in Guizhou Province recently. The objective of the
study was to identify the pathogen. The Cycas Leaf blight standard samples were collected and the pathogen was
identified by morphology, pathogenicity and ribosomal DNA-ITS. The results showed that the isolated fungus was
used for department’ s law of disease and syndrome. Disease symptoms after inoculation were the same as that on
the collected samples， which showed the fungus was the pathogen. The pycnidia and conidia’ morphology of the
pathogen were similar to that of Phomopsis. Comparing the measured sequence with the related sequence of
Phomopsis vaccinii（No： KC488259， JX846914） in GenBank, the homology was 97%. According to its characteristics
of morphology and sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA （ITS） （No：
JN417709）the pathogen was identified as Phomopsis cycadis.
Key words Cycas revoluta Thunb； Phomopsis； Pathogen
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.030
第 10 期 李小霞等： 苏铁叶枯病病原菌鉴定
物园、 习水国家自然保护区等地调查发现， 苏铁叶
枯病大面积发生， 严重的导致整株枯死。 因此， 本
实验室连续几年分批采集了上百份自然发病的标
样， 并进行形态学和分子生物学鉴定， 为苏铁叶枯
病的防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 病害标本的采集
2009~2013 年每年的 5~8 月， 每个采集点（贵
州省植物园、 遵义植物园、 安顺市植物园、 遵义师
范学院盆景植物园）月均 1 次， 分别采集发病的苏
铁叶片标样。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离、 纯化及致病性的测定 采集
自然发病的苏铁叶片， 以常规组织法[12]进行病原菌
的分离。 将分离菌株纯化后， 取健康苏铁叶片进行
室内接种试验： 将采集的苏铁叶片用 75％酒精进
行表面消毒， 采用有伤（刺伤法）接种和无伤接种 2
种方法， 每个叶片接种 2个接种点， 每个供试菌株
接种 3 片叶片。 实验组接种已纯化的 5 mm 的菌
饼， 对照组接种 5 mm 无菌的 PSA 培养基， 将其
置于铺有湿润吸水纸的培养皿中， 于 25 ℃、 光照
1 500 lx的光照培养箱中培养， 观察接种结果， 并对
接种成功的病斑进行组织分离， 以确认致病菌株[4]。
1.2.2 病原菌的孢子、 菌丝形态观察及形态学鉴定
按照柯赫氏法则， 在确定致病性后， 用针尖从
标本上挑取小黑点（分生孢子器）， 在光学显微镜下
观察分生孢子器和分生孢子的形态， 并测量其大
小。 25 ℃、 PSA 平板上培养菌株数天， 记录菌落
的培养性状。
1.2.3 病原菌 DNA 提取 DNA 的提取 ， 参照
Sharp 等 [13]、 Xiao等 [14]的方法， 并略有改进。 取约
0.2 g 菌丝， 置于预冷的研钵中， 加入少许石英砂
研磨至粉状， 再加入 600 μL 的 2％ CTAB 抽提缓
冲液， 轻轻搅动后， 置于 2 mL 的灭菌离心管中，
65 ℃的水浴 30~60 min， 期间每隔 10 min 上下轻轻
颠倒， 混匀离心管内的缓冲液 1~2 次； 冷却 2 min
后， 加入（酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇）（V∶ V ∶ V 25 ∶ 24 ∶ 1）
至满管， 使二者混合均匀， 4 ℃离心（12 000 r/min）
10 min； 重复该步骤 2~3 次直至水相与有机相中
间层无杂质； 离心后取上清液至新离心管内， 加
入 600 μL 预冷的异丙醇， 慢慢上下摇匀 30 s， 使
异丙醇与水层充分混合至能见到 DNA絮状物； 置
于4 ℃离心（12 000 r/min）， 10 min后 ， 弃上清液 ，
晾干； 加入 1 mL 75％乙醇漂洗 DNA， 7 500 r/min
再离心5 min， 倒掉上清液， 室温晾干； 加入 30 μL
无菌水， 4 ℃过夜溶解后， -20 ℃保存备用。
1.2.4 rDNA-ITS 区域核苷酸序列测定 选用真菌
ITS扩增的通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC
GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行
配对扩增 [14]（引物由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成）。 反应结束后， 取 5 μL 扩增产物， 进
行 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测， Tiangen 的 DNA 凝
胶回收试剂盒回收目的 DNA 片段， 由上海生工生
物工程技术服务有限公司测序， 将测得的 ITS 序列
在 NCBI 网站中进行同源性分析 ， 分析后向
GenBank 提交序列， 再从 GenBank 中选取合适的
序列， 经 CLUSTALW 2.0 软件进行序列对比， 并
用 MEGA 5.05 软件采用邻接法 （Neighbor-joining
analysis， NJ）构建系统发育树， 其中 Bootstrap 检验
的重复次数为 1 000次。
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离
将采集的样本经分离纯化后， 共获得苏铁叶部
病原菌菌株 15 株， 编号为 P01-15。 其中， P01、
04、 08、 09 回接后为非致病菌， 其它菌株形态特
征基本一致， 选取菌株 P03 为代表（标本采自遵义
植物园）， 按柯赫氏法则进行致病性测定和病原菌
鉴定。
2.2 致病性的测定
接种 48 h 后， 刺伤接种处出现褐色水渍状病
斑； 随着接种时间的延续， 褐色水渍状病斑上下扩
展； 接种后第 8 天， 叶片出现干枯； 接种后第 13
天， 出现埋生的黑色分生孢子器； 接种 15 d 后，
人工接种叶片几乎全叶变为褐色（图 1）， 与自然发
病症状一致。 对其进行病原菌分离培养， 其分离物
与接种供试菌株培养性状相同， 由此可见， 供试菌
株为苏铁叶枯病的致病菌。 无伤接种和对照接种后
无病斑出现。
2.3 病原菌形态学的鉴定
自然发病的病叶一般发生在叶尖或中部， 初为
梭形、 圆形、 不规则形， 黄褐色， 边缘灰白色， 逐
渐向叶柄扩展， 引起叶尖干枯， 后期病部散生黑色
小点（分生孢子器）（图 2）。 分生孢子器球状至扁球
形， 埋生于叶面， 大小为 255~423 μm（n=30）， 器
壁黑褐色， 孔口明显（图 3）， 分生孢子梗无色、 分
隔、 簇状或合轴分枝， 11~25×1.7~2.6 μm。 轻轻压
迫分生孢子器， 内涌出甲型（α型）分生孢子， 无
色， 纺锤形， 单胞， 内含 1~3 个油球， 一般为 2
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第 35 卷热 带 作 物 学 报
图 6 菌株在 PSA 上培养 6 d 的情况（25℃，正反面）
Fig. 6 Colony obverse and reverse on PSA after 6 d（25℃）
图 7 菌株在PSA上培养25 d的情况（25℃，正反面）
Fig. 7 Colony obverse and reverse on PSA after 25 d（25℃）
个， 大小为 5.14~10.8×1.9~4.4 μm（n=30）（图 4）。
寄主植物上未分离到乙型（β型）分生孢子。 新鲜标
样进行分离纯化后， 在 25 ℃、 PSA 培养 4 d 后，
菌丝辐射状生长， 菌丝的正反面均为白色、 绒毛
状， 菌丝平板上呈现 “深-浅-深” 的轮纹（图 5）；
6 d 后菌丝的反面出现轮状黑色小点（图 6）； 15 d
后正面出现黑点状的分生孢子器（子实体）， 排列在
同心圆的边缘（图 7）。 30 d 后黑色的子实体中喷射
出黄色的分生孢子， 取其黄色分生孢子置于玻片
上， 在光学显微镜下观察分生孢子性状。 分生孢
子器内产生 2 种类型的分生孢子， 除有在寄主上
看到的无色的甲型分生孢子外， 还有乙型分生孢
子， 无色， 线性， 内无油球， 单胞， 有些一端弯
曲呈钩状 ， 有些稍有弯曲 ， 大小为 15.36~51.2×
0.7~1.28 μm（n=30）（图 8）， 经初步形态鉴定为拟
茎点霉属 Phomopsis 真菌。
2.4 rDNA-IT 区域核苷酸序列的测定与分析
菌株用 ITS 区域通用引物 ITS1/ITS4 进行 PCR
图 1 苏铁叶枯病回接实验
叶片症状（15 d）
Fig. 1 Symptom on artificially
inoculated leaf
图 3 病菌分生孢子器
Fig. 3 Pycnidium of leaf blight
pathogen on Cyca
图 2 苏铁叶枯病田间症状
Fig. 2 Symptom on leaf
of Cycas in field
接种菌株 CK
200 μm

图 4 寄主上的甲型分生孢子 图 5 菌株在 PSA 上培养 4 d 的情况（25℃， 正反面）
Fig. 4 α conidia of pathogen on host Fig. 5 Colony obverse and reverse on PSA after 4 d（25℃）
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第 10 期 李小霞等： 苏铁叶枯病病原菌鉴定
图 8 菌株在 PSA 上培养产生的甲型和乙型分生孢子
Fig. 8 α and β conidia produced on PSA
P. vaccinii JX846914
P. vaccinii KC488259
P. vaccinii EU520059
P. occulta HM439635
○P.cycadis JN417709
P.amygdali HQ632014
P.amygdali HGU133064
L.cuneyi AF191172
0.02
分支点上的数值为支持率； 标尺 0.02 为进化距离； 外群： Leucostoma curreyi AF191172。
Numbers at nodes indicating bootstrap values for each node out of 1 000 bootstrap replications; Scale 0.02 meaning evolutional
distance; Outgroup: Leucostoma curreyi AF191172.
图 10 基于 rDNA-ITS 基因序列构建的苏铁叶枯病病原菌的 NJ 系统发育树
Fig. 10 Neighbour joining phylogenetic tree based on rDNA-ITS
gene sequences of Phomopsis cycadis and related fungi
63
76
98
100
扩增， 结果可得到 1 条 600 bp 左右的条带（图 9），
回收目的片段进行测序， 结果大小为 527 bp。 将
测序得到的序列与 GenBank 中已有的 DNA 序列进
行同源性比对， 菌株P03（GenBan登录号： JN417709）
与分离自中国山东的蓝莓拟茎点枝枯病病原菌
Phomopsis vaccinii（GenBank 登陆号为： KC488259，
JX846914）同源性最高， 达 97％， 分值为 891。 系
统发育分析结果表明 ， 在以 Leucostoma curreyi
（Accession No. AF191172）为外群构建的系统发育
树中， 目标病原菌与分离自蓝莓的拟茎点霉菌株遗
传距离最近（图 10）。 但苏铁叶枯病病原菌并非 P.
vaccinii， 结果鉴定为苏铁拟茎点霉 Phomopsis
cycadis。
3 讨论与结论
拟茎点霉是重要的植物内生真菌和资源真菌，
但也是一种重要的植物病原真菌， 诸多报道其引起
多种植物叶、 茎、 枝等病害 [7-8,15]。 为明确引起贵州
苏铁叶枯病病原菌， 本课题组通过病原菌培养特性
观察， 确认引起贵州省苏铁叶枯病病原菌为拟茎点
霉 Phomopsis 属真菌， 国外曾经有关于苏铁叶枯病
方面的报道， 对该病的病原菌也有不同的报道， 有
图 9 菌株DNA PCR 产物
Fig. 9 Electrophoresis image of rDNA
ITS-PCR product of isolate
500bp
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第 35 卷热 带 作 物 学 报
刺盘孢 Colletotrichum sp.、 拟茎点霉 Phomapsis、
拟盘多毛孢 Pestalopsis sp.。 Phomopsis cycadis 最
初发表于 1954 年 [16]， 在此之前一直采用茎点霉
Phoma cycadis [17]， 国内几乎无拟茎点霉 Phomapsis
引起的苏铁叶枯病病原菌的报道。 通过 rDNA ITS
序列比对分析， 结果发现该病原菌与分离自山东的
2 株 P. vaccinii 同源性最高（97％）。 rDNA-ITS 构
建的系统进化树显示， P. cycadis 和 P. vaccinii 分
处于不同的分支， 支持率达 98％， 同时比较两者的
致病性特点及病原菌形态特征， 结果发现两者差异明显，
P. vaccinii的分生孢子器直径一般 300~500 μm， 甲
型分生孢子大小为 6~11×2~5μm[18-19]， 比本菌分生孢
子器大， 而且其甲型分生孢子稍宽， 因此， 可判别
苏铁叶枯病病原菌并非 P. vaccinii。 另外， P. vaccinii
主要寄生于杜鹃花科越桔属蓝莓（Vaccinium）植物上，
可通过花芽和伤口侵入。 本研究在病原菌致病性实
验中发现， 伤口对于 P. cycadis 入侵寄主尤为重
要， 无伤接种无病斑出现， 因此， 在苏铁的栽培
中， 农事操作过程减少造成苏铁叶片伤口是减少该
病菌危害的重要手段。
因此， 基于病原菌形态特征和 rDNA ITS 序列
分析， 将引起贵州遵义等地的苏铁叶枯病的病菌鉴
定为苏铁拟茎点霉 P. cycadis。
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责任编辑： 黄东杰
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