全 文 ：山西农业科学2014，42（8）：796-799，818 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
乌塌菜 DET1基因的克隆及表达模式分析
张 彬 1，2，周 爽 2，朱明库 2，尹美强 1，赵 娟 1，王玉国 1
（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.重庆大学生物工程学院，重庆400044）
摘 要：高叶绿素是一种极为优良的农艺性状，有利于提高光合作用效率，增加产量。以芸薹属高叶绿素突变体乌
塌菜为试验材料，研究调控叶绿素合成的基因 DET1与乌塌菜高叶绿素含量的关系。测序结果显示，乌塌菜 DET1
基因全长cDNA为1690bp，编码535个氨基酸。与小白菜和羽衣甘蓝相比，乌塌菜 DET1基因在第734～739位
缺失了6个核苷酸“TGATGA”，导致乌塌菜 DET1编码的蛋白质BrDET1w在第245位和第246位氨基酸处缺失
了2个甲硫氨酸，其中，第245位的甲硫氨酸位于芸薹属DET1蛋白的保守位点。尽管生物信息学分析显示，乌塌
菜 BrDET1w的相对分子质量、等电点以及亲水性没有受到明显影响，半定量RT-PCR结果也显示，DET1基因的
表达量在小白菜和乌塌菜中差别不大，但 DET1基因保守位点的缺失仍可能是由于乌塌菜高叶绿素含量的原因。
这一结果为乌塌菜 DET1基因的后续研究奠定了基础。
关键词：乌塌菜；DET1；基因克隆；表达模式
中图分类号：S634.4 文献标识码：A 文章编号：1002-2481（2014）08-0796-05
Cloning of Gene DET1 and Analyzing of the Expression Pattern in Wuta-cai
ZHANGBin1，2，ZHOUShuang2，ZHUMing-ku2，YINGMei-qiang1，ZHAOJuan1，WANGYu-Guo1
（1.CollegeofAgronomy，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；
2.SchoolofBiologicalEngineering，ChongqingUniversity，Chongqing400044，China）
Abstract：The agronomic trait high chlorophyll level is helpful to improve photosynthetic efficiency and boost yield. ABrassica
plant,Wuta-caiwithhighchlorophylllevel,wasselected astheresearch material. Weidentified whetherthegeneDET1 related tohigh
chlorophyll level caused the mutation of Wuta-cai. The sequencing results showed that the total cDNA length of DET1 was 1 690 bp,
encoded535aminoacids.ComparedWuta-caiwithpakchoiandkale,therewere6nucleotidesTGATGAmissingonthesites734-739
ofDET1inWuta-cai,whichledthedeletionoftwomethioninesonthe245thand246thsitesofproteinBrDET1w.The245thmethionine
was located on conserved site of protein DET1 inBrassica plants. Th relative molecular mass, isoelectric point and hydrophilia of
BrDET1w were not affected significantly according to the bioinformatics analysis results. There was little significant difference of
expression quantityofgeneDET1 in pakchoiand Wuta-cai based on the results of semiquantitative RT-PCR. However, the deletion of
conserved site of geneDET1 would be the reason why there was high chlorophyll level in Wuta-cai. The result laid the foundation for
furtherresearchongeneDET1inWuta-cai.
Key words：Wuta-cai;DET1;genecloning;expressionpattern
收稿日期：2014-06-20
基金项目：山西省青年科技研究基金项目（2013021024-2）；山西农业大学科技创新基金项目（201302）；山西农业大学引进人才博士启动基金
项目（2012YJ12）
作者简介：张 彬（1982-），女，山西太原人，讲师，博士，主要从事植物生理与分子生物学研究工作。
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2014.08.04
叶绿素是光合作用中最重要的色素，提高植物
叶片中的叶绿素含量有利于提高光合作用效率，增
加作物产量，获得高产、优质品种。目前，已经报道
的叶色突变体大多是叶绿素合成减少突变体，高叶
绿素含量的突变体较少，对其形成机理的研究报道
也不多。高叶绿素突变体不仅可以用于植物光合作
用的研究，而且还能为遗传育种、品种改良提供很
有价值的研究材料和种质资源，其具有较大的研究
价值。
乌塌菜是我国特有的、经过长时间的人工选育
得到的高叶绿素突变体，是研究叶绿素合成调控机
理的良好材料。目前，对乌塌菜的研究主要集中在
分析其营养价值[1-2]和改进其栽培方法上[3-5]，对其高
叶绿素含量的分子机理研究较少。DET1（DE-E－
TIOLATED1）是一个高叶绿素基因，能明显提高植
物的总叶绿素含量，使植株叶片、茎、果实等呈深绿
796· ·
张 彬等：乌塌菜 DET1基因的克隆及表达模式分析
色，在拟南芥[6-7]、番茄[8-9]、高粱[10]、玉米[11]和水稻[12]等
作物中都有相关报道。
本研究以高叶绿素突变体乌塌菜及其同种的
普通小白菜为材料，分析了 DET1在这2个物种叶
片中的表达情况，克隆了2 个物种DET1 基因的
cDNA，并用生物信息学的方法分析了其序列、理化
性质和亲疏水性，旨在为研究其功能并探讨乌塌菜
高叶绿素含量的分子机理奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
乌塌菜和小白菜种子购自重庆天子种业有限
公司；RNA提取试剂盒RNAisoPlus采用TaKaRa生
物公司的产品；ExTaq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接
酶等购自大连TaKaRa公司；反转录酶M-MuLVRT
和 DNA 消化酶 RQ1 Rnase-Free Dnase 为 Promega
公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱
型）是北京TIANGEN公司产品；抗生素购自Sigma
公司；Marker DL2 000＋购自北京天为时代科技有
限公司。其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。引
物合成和基因测序均由上海英骏生物技术公司完
成。克隆载体pMD18-T为TaKaRa公司产品。大肠
杆菌菌株DH5α由重庆大学生物工程研究所实验
室保存。
1.2试验方法
1.2.1 材料处理 将小白菜和乌塌菜播种于含有
60%珍珠岩和40%草炭土的基质中；当幼苗长出
4～5片真叶时，将其定植于单独的花盆中；1个月
后，将幼苗移植到土地里。当乌塌菜的叶片变为墨
绿色时，收集小白菜和乌塌菜的叶片用于后续试验。
1.2.2 RNA的提取 分别取新鲜叶片1g，放入用
液氮预冷的研钵中，不断加入液氮并研磨至粉末
状，按照 TaKaRa 公司 RNA 提取试剂盒 RNAiso
Plus说明书的操作来提取总RNA。
1.2.3 cDNA 的合成 取 2μg 由 1.2.2 获得的总
RNA作为模板，按照Promega公司M-MuLVRT反
转录酶的说明书，使用反转录引物dT-R进行反转
录，合成cDNA。
1.2.4DET1基因的克隆与测序 基于GenBank已
登录的拟南芥 DET1基因序列，利用Primer5.0设计
全长克隆引物：上游QDET1-F为5-AAAACCACAT
AACTAAAAAG-3，下游QDET1-R为5-AAACAAT
AGATTACACAACA-3。以反转录合成的cDNA为模
板，利用高保真酶 Primer Star 来扩增目标基因。
PCR 反应条件为：94℃变性 30 s，54℃复性 30 s，
72℃延伸1.5min，40个循环；最后72℃延伸10min。
用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。将通过
切胶回收纯化的DNA片段连接到pMD18-T载体
上，转化到大肠杆菌DH5α菌株，Amp筛选，PCR鉴
定片段大小后测序。
1.2.5 半定量 RT-PCR 分析DET1 基因在小白菜
和乌塌菜叶片中的表达情况 根据已克隆的小白
菜、乌塌菜 DET1基因序列，利用Primer5.0设计半
定量RT-PCR引物：上游DET1F为5-GCATAGGC
AATCCTCAGAC-3，下游 DET1R 为 5-TGGCAAGT
GGTAAATGTGG-3。以基因 EF1A 作为内参基因
（EF1A-F：5-ATCCCGTTGCTTTCACTGC-3，EF1A-
R：5-CCGTACACATCCTGGTTTC-3）。PCR反应条件
为：94℃5min；94℃30s，54℃ 5s，72℃1min；
72℃延伸10min（其中，EF1A跑26个循环，DET1
跑27个循环）。试验设置3个生物重复，每个反应
重复3次。
1.2.6DET1基因的生物信息学分析 利用NCBI
的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.
html）分析开放阅读框；利用 CLUSTALX 和 DNA-
MAN6.0对小白菜BrDET1p、乌塌菜 BrDET1w、羽
衣甘蓝 BoDET1和拟南芥 AtDET1的氨基酸序列进
行比对；利用 ExPASy（http://www.expasy.org/vg/in-
dex/Protein）完成蛋白质结构及其理化性质的生物
信息学分析。
2 结果与分析
2.1 小白菜和乌塌菜 cDNA 的合成与 DET1 基因
的克隆情况分析
小白菜和乌塌菜新鲜叶片提取的RNA电泳图
条带清晰完整，28S与18S的条带亮度比约为2∶
1，表明RNA的质量很高，符合试验要求，可以用于
反转录合成cDNA。
以提取的小白菜和乌塌菜RNA为模板进行反
转录后，用特异性全长引物QDET1-F/QDET1-R扩
增小白菜和乌塌菜cDNA，电泳图显示，二者均克隆
得到约1.6kb的片段（图1-B，1-C）。将目的片段连
接到pMD18-T载体中。PCR鉴定结果表明，特异性
引物 QDET1-F/QDET1-R 分别扩增得到约 1.6 kb
的目的片段，与预测结果一致，证明目的片段已被
成功连入pMD18-T载体中。送样测序。
2.2小白菜和乌塌菜 DET1基因的特征比较
测序结果表明，在小白菜中克隆得到了长度为
797· ·
山西农业科学2014年第42卷第8期
2.3 小白菜和乌塌菜叶片中 DET1 基因的表达情
况分析
利用半定量RT-PCR的方法分析比较了小白
菜和乌塌菜中 DET1基因的表达情况，结果（图4）
显示，DET1基因在小白菜和乌塌菜中的表达水平
差异不大。
1 696bp的cDNA序列，该序列包含了1614bp的
ORF序列，编码了537个氨基酸；在乌塌菜中克隆
得到长度为1690bp的cDNA序列，该序列包含了
1608bp的ORF序列，编码了535个氨基酸。小白菜
和乌塌菜 DET1基因的序列比较结果表明，小白菜
和乌塌菜 DET1基因共有9个核苷酸不同，其中，
第 645，672，1 302 位的 3 个核苷酸差异没有影响
蛋白质序列，而乌塌菜 DET1基因在第734～739位
缺失了6个核苷酸“TGATGA”（图2），导致乌塌菜
DET1 编码的蛋白质 BrDET1w 在第 245 位和第
246位氨基酸处缺失了2个甲硫氨酸（M）（图3）。
为了进一步验证乌塌菜 DET1基因在734～739位
缺失“TGATGA”是否是乌塌菜中独有的现象，又用
同样的引物和方法克隆了同为十字花科芸薹属的
羽衣甘蓝的 DET1基因（图1-A）。序列比较结果表
明，羽衣甘蓝734～739位没有缺失“TGATGA”（图
2）。因此，乌塌菜 DET1基因在第734～739位缺失
“TGATGA”是乌塌菜中不同于其他芸薹属植物的
现象。
798· ·
（下转第 818 页）
2.4 小白菜、 乌塌菜和羽衣甘蓝 DET1 基因的生
物信息学分析
2.4.1 开放阅读框以及蛋白质保守位点分析
ORFFinder分析结果显示，小白菜、乌塌菜以及羽
衣甘蓝的 DET1基因都由一个完整且连续的开放
阅读框组成；氨基酸序列比对分析显示，乌塌菜
BrDET1w在第 245 位和第 246 位氨基酸处缺失了
2个甲硫氨酸（M）。小白菜 BrDET1p以及羽衣甘蓝
BoDET1在此位置都没有缺失，拟南芥 AtDET1在
第245位没有缺失，但在246位同样缺失了一个甲
硫氨酸。因此，乌塌菜 BrDET1w第245位缺失的甲
硫氨酸位于芸薹属DET1蛋白的保守位点。
2.4.2 氨基酸组成以及理化性质分析 小白菜
BrDET1p编码了537个氨基酸，相对分子质量为
61844.1，等电点（pI）为7.70；羽衣甘蓝BoDET1编
码了536个氨基酸，相对分子质量为61886.2，pI
为7.30；乌塌菜BrDET1w编码了535个氨基酸，相
对分子质量为61581.7，pI为7.70。
2.4.3 蛋白质亲疏水性分析 通过在线软件 Ex-
PASy中的ProtParam工具对乌塌菜BrDET1w、羽衣
甘蓝 BoDET1以及小白菜 BrDET1p的亲疏水性进
行了分析，结果显示，乌塌菜BrDET1w的GRAVY
（Grand average of hydropathicity）值为 -0.313；小白
菜 BrDET1p 的 GRAVY 值为 -0.305；羽衣甘蓝
BoDET1的GRAVY值为-0.330。说明这3个蛋白
都是亲水性的。
3 讨论
本研究在小白菜、乌塌菜中都克隆得到了一个
高叶绿素相关基因 DET1。该基因在拟南芥[6-7]、番
茄[8-9]、高粱[10]、玉米[11]和水稻[12]等作物中均有报道。
番茄HP-2（highpigment-2）是拟南芥DET1的同源
基因，HP-2突变的番茄茎、叶片和未成熟果实因叶
绿素含量升高而呈现深绿色[8]。拟南芥 DET1是一
个重要的光形态发生的负调控因子[8]，DET1蛋白和
DBB1蛋白二者结合在一起，共同抑制了光形态的
发生[13-14]，并通过提高E3泛素连接酶活性调控了植
物体很多生理活动[15]。
本研究从一个高叶绿素突变体乌塌菜中克隆
了 DET1基因，同时克隆了小白菜和羽衣甘蓝中的
DET1基因进行对比。通过半定量PCR的方法分析
比较了小白菜和乌塌菜中 DET1基因的表达情况，
并对该基因氨基酸及蛋白质序列进行了比较分析，
结果显示，乌塌菜 DET1基因在第734～739位缺
失了6个核苷酸“TGATGA”，导致乌塌菜 DET1 编
码的蛋白质在第245位和第246位氨基酸处缺失
了2个甲硫氨酸（M），其中，第 245 位的甲硫氨酸
位于芸薹属DET1蛋白的保守位点。尽管生物信息
学分析显示，这2个氨基酸的缺失并没有明显影响
乌塌菜 BrDET1w的相对分子质量、等电点以及亲
水性，半定量RT-PCR的结果也显示，DET1基因的
表达量在小白菜和乌塌菜中差别不大，但在番茄
中，HP-2蛋白（拟南芥DET1的同源蛋白）的一个
氨基酸发生突变导致了高叶绿素性状的出现[8]，因
此，乌塌菜突变的 DET1基因可能是导致其高叶绿
素的原因。乌塌菜 DET1的功能还有待于进一步研
究证实。
参考文献：
［1］周玉丽，舒英杰，黄昌松.乌塌菜VC、可溶性糖及可溶性蛋白含
量的变异和聚类分析[J].长江蔬菜：学术版，2011（12）：18-21.
［2］舒英杰，周玉丽，徐俊.乌塌菜Vc含量动态变化的初步研究[J].
安徽技术师范学院学报，2005，19（3）：14-16.
［3］田丰，张永成，曹青莉.施肥对乌塌菜硝酸盐含量的影响[J].西
北农业学报，2004，13（2）：162-165.
［4］查振英.乌塌菜高产栽培技术[J].安徽农学通报，2011，17（22）：
64-66.
［5］应芳卿，刘宗立，王从亭，等 乌塌菜无公害栽培技术[J].安徽农
学通报，2006，12（9）：70.
［6］Pepper A，DelaneyT，WashbumT，etal.DET1，anegativeregulator
oflight-mediateddevelopmentandgeneexpressioninArabidopsis，
encodes a novel nuclear-localized protein [J]. Cell，1994，78：
109-116.
［7］SongHR，CarreIA.DET1regulatestheproteasomaldegradationof
LHY，acomponentoftheArabidopsis circadianclock [J].PlantMol
Biol，2005，57：761-771.
［8］MustilliAC，FenziF，CilientoR，etal.Phenotypeofthetomatohigh
pigment-2 mutantiscaused byamutation in the tomato homolog of
DEETIOLATED1[J].PlantCell，1999，11：145-157.
［9］Levin I，Frankel P，Gilboa N，et al. The tomato dark green mutation
isanovelalleleofthetomatohomologoftheDEETIOLATED1gene
张 彬等：乌塌菜 DET1基因的克隆及表达模式分析
799· ·
（上接第 799 页）
[J].TheorApplGenet，2003，106：454-460.
［10］PatersonAH，BowersJE，BruggmannR，etal.Thesorghumbicol-
orgenomeand thediversification ofgrasses[J]. Nature，2009，457：
551-556.
［11］AlexandrovNN，Brover W，Freidin S，etal. Insights in corn genes
derived from large-scale cDNA sequencing [J]. Plant Mol Biol，
2009，69：179-194.
［12］黄俊丽，刘太波，王贵学，等.水稻高叶绿素含量基因DET1
cDNA的克隆、生物信息学分析及超表达载体的构建[J].中国
生物工程杂志，2010，30（4）：60-64.
［13］Schroeder D F，Gahrtz M，Maxwell B B，et al. De-etiolated 1 and
damaged DNA binding protein 1 interact to regulateArabidopsis
photomorph genesis[J].CurrBiol，2002，12：1462-1472.
［14］Lieberman M，Segev O，Gilboa N，et al. The tomato homolog of the
geneencodingUV-damagedDNAbindingprotein1（DDB1）un-
derlinedasthegenethatcausesthehighpigment-1mutantpheno-
type[J].TheorApplGenet，2004，108：1574-1581.
［15］Yanagawa Y，Sullivan J A，Komatsu S，et al.Arabidopsis COP10
forms a complex withDDB1 andDET1 in vivo and enhances the
activityofubiquitinconjugatingenzymes[J].GenesDev，2004，18：
2172-2181.
6 栽培技术要点
合理的栽培技术是甜高粱高产稳产的前提和
保证。
6.1适时播种
适时播种对甜高粱生产至关重要，晋甜杂3号
需中等肥力土壤的10cm耕层，地温稳定在10℃
以上，土壤含水量在15%～20%时播种为宜。山西
地区通常在4月下旬至5月上旬播种。
6.2确保全苗
因甜高粱籽粒较小，播种较浅，为达到全苗、苗
壮的目的，播前需精细整地。精细播种，播种深度掌
握覆土镇压后在2cm左右，播种时用毒谷防治地
下害虫。
6.3合理密度
晋甜杂3号的适宜行距45～60cm，留苗密度为
水肥地7.5万～9.0万株/hm2，山旱地7.5万株/hm2。
6.4 合理施肥
施足底肥，施复合肥750kg/hm2左右。拔节至
抽穗期，追施尿素225kg/hm2。
6.5 田间管理
当幼苗4～6片叶时间苗、定苗，中耕除草防旱
保墒，促进甜高粱生长发育。第2次除草在中耕后
10d左右进行，并追施尿素300～375kg/hm2，适当
增施磷、钾肥各45～75kg/hm2。中耕时选择去除分
蘖，可以增加植株的株高、茎粗、抗倒性和主茎鲜质
量[13-14]。生长期间可用菊酯类农药防治黏虫、蚜虫。
6.6 适时收割
晋甜杂3号通常在籽粒蜡熟末期、糖分积累达
到最大值时收获。
7 适宜推广地区
晋甜杂3号适宜在东北三省、山西、河南、甘
肃、宁夏、新疆、内蒙古、安徽等省区播种。
参考文献：
［1］卢庆善，孙毅.杂交高粱遗传改良[M].北京：中国农业科学技术
出版社，2005：145-176.
［2］卢庆善.甜高粱 [M].北京：中国农业科学技术出版社，2008：
103-104.
［3］塔那.内蒙古农村能源物质：甜高粱调查报告[J].内蒙古农业科
技，2011（5）：116-117.
［4］王春虎，赵现方.雅津13号等甜高粱品种在豫北平原试种效果
及高产栽培关键技术[J].农业科技通讯，2012（6）：152-156.
［5］赵威军，张福耀，程庆军，等.A3CMS在甜高粱育种中的可行性
研究[J].作物杂志，2008（1）：13-16.
［6］马涌，张福耀，赵威军，等.甜高粱育种思路探讨[J].山西农业科
学，2011，39（6）：619-621.
［7］邹剑秋，王艳秋，张志鹏，等.A3型细胞质能源甜高粱生物产量、
茎秆含糖锤度和出汁率研究 [J].中国农业大学学报，2011，16
（2）：8-13.
［8］田森林，赵威军，郑丽萍.我国甜高粱育种方法探讨[J].山西农
业科学，2011，39（5）：419-421，455.
［9］张晓英，赵威军.甜高粱茎秆含糖量的研究进展[J].山西农业科
学，2011，39（6）：616-618.
［10］常玉卉，赵威军，张福耀，等.能源用甜高粱晋甜杂1号的选育
[J].山西农业科学，2012，40（2）：99-100，104.
［11］赵威军，张福耀，程庆军，等.能源用甜高粱晋甜杂2号的选育
及栽培技术[J].山西农业科学，2013，41（8）：793-796.
［12］张阳，赵威军，张福耀，等.新选甜高粱不育系和恢复系的配合
力分析[J].作物杂志，2010（5）：102-104.
［13］赵威军，张福耀，常玉卉，等.去除分蘖对甜高粱倒伏的影响[J].
中国农学通报，2012，28（33）：84-87.
［14］邵荣峰，赵威军，张阳，等.去分蘖对甜高粱主要农艺性状的影
响[J].作物杂志，2012（1）：126-129.
山西农业科学2014年第42卷第8期
818· ·