全 文 ：第 32卷　第 3期
2008年 5月
　南京林业大学学报(自然科学版)
　JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalSciencesEdition)
Vol.32, No.3
May, 2008
兔耳风属 3个近缘种 ISSR分子鉴别
温　强 ,叶金山 ,于　宏 ,江香梅
(江西省林业科学研究院 ,江西省植物生物技术重点实验室 ,江西　南昌　330032)
摘要:采用 ISSR分子标记技术 ,对菊科兔耳风属杏香兔耳风(AinsliaeafragransChamp)、红背兔耳风(A.rubrifolia
Franc)和铁灯兔耳风(A.macroclinidioidesHag)等 3个极易混淆的近缘种进行了分子鉴别。从 100条 ISSRUBC
系列引物中筛选出 20条多态性好的引物进行检测 ,其中利用引物 UBC807、UBC826、UBC834、UBC843、UBC853、
UBC895的扩增特异性条带制成 ISSR指纹图谱 , 完全可以用于 3个近缘种的鉴别。 此外 , 基于相似系数的
UPGMA聚类分析显示 ,杏香兔耳风与红背兔耳风之间亲缘关系近 ,而与铁灯兔耳风的亲缘关系则相对较远。
关键词:杏香兔耳风;红背兔耳风;铁灯兔耳风;ISSR分子鉴别
中图分类号:S338;Q943　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-2006(2008)03-0139-03
ISSRmolecularidentificationforthreespeciesinAinsliaea
WENQiang, YEJin-shan, YUHong, JIANGXiang-mei
(JiangxiAcademyofForestrySciences, JiangxiProvincialBio-techKeyLabforPlant, Nanchang330032, China)
Abstract:Threedifficultly-divisionalspecies, i.e., Ainsliaeafragrans, A.macroclinidioidesandA.rubrifoliawere
studiedusingtheISSRmolecularidentificationsystem.Twentyprimerswerescreenedoutfrom 100 ISSRUBC.They
couldgeneratereproduciblepolymorphicfragments.TheparticularbandswereexpandedtomaketheISSRfingerprintby
primerUBC807, UBC826, UBC834, UBC843, UBC853, andUBC895.Itcouldbeusedtodiscriminatethreespecies.
Furthermore, accordingtothealikecoeficientUPGMAshowedthattherelativerelationofA.fragransandA.rubrifolia
wascloserthanthatofA.fragransandA.macroclinidioide.Theresearchcouldberespondedfortheconservancyand
developmentofthechineseherbalmedicineresource, andprovidingatechnicalsupportofbuildingupthestablequality
evaluationsystemofchineseherbalmedicine.
Keywords:Ainsliaeafragrans;A.rubrifolia;A.macroclinidioides;ISSRmolecularidentification
　　收稿日期:2007-06-26　　　　修回日期:2007-12-01
　　基金项目:江西省财政厅科技专项资助(20060201);江西省科技厅社会发展项目(20061A0400700)
　　作者简介:温　强(1979—),男 ,助理研究员 ,主要研究方向为植物种质资源 , jxwenqiang@yahoo.cn。
　　引文格式:温 强 ,叶金山 ,于 宏 ,等.兔耳风属 3个近缘种ISSR分子鉴别 [ J] .南京林业大学学报:自然科学版 , 2008, 32(3):139-141.
　　杏香兔耳风 (AinsliaeafragransChamp)、红背兔耳风 (A.rubrifolia)和铁灯兔耳风 (A.
macroclinidioides)为菊科兔耳风属 3个近缘种 ,其极易混淆同时资源储量也渐枯竭 [ 1-6] 。近年来结合
PCR技术鉴别中药的研究得到极大发展 ,并正在逐渐成为中药鉴定的一种新方法[ 7-8] 。笔者利用 ISSR
技术[ 9-11]对杏香兔耳风 、红背兔耳风和铁灯兔耳风进行分子标记 ,旨在建立 3种原料药材的有效分子鉴
别体系 ,对保存和开发原料药材 ,稳定药材质量 ,保护新品种和知识产权等均具有重要意义 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
　　从保存在江西省林业科学研究院内的兔耳风属种质基因资源库中随机采集杏香兔耳风 、红背兔耳
风和铁灯兔耳风 3种植物的叶样 ,每种植物采集 10棵植株的叶样等量混合 ,组成代表该植物种的试样 ,
硅胶干燥后备用 。
1.2　总 DNA的制备与标定
总基因组 DNA采用改进的 CTAB高盐法提取 [ 12] 。 DNA大小及其完整性采用标准浓度的 λDNA/
HindⅢ和 Quantityone软件对电泳结果进行检测和标定。采用光谱 754紫外分光光度计测定各基因组
DNA的 OD260/280值 ,据此推知各总 DNA的含量。
1.3　试验设计与 PCR扩增
笔者参考油茶 ISSR体系建立的研究报道 [ 12] ,优化筛选兔耳风属植物的 ISSR-PCR体系 。主要包
括 Mg2+、dNTPs、DNA模板 、Taq酶 、引物 、退火温度等 6个 PCR关键因子的多水平的梯度筛选 ,当某因
子水平变化时 ,其他因子保持不变为二水平 ,总体积为 20μL。 PCR扩增反应在 PTC-200温度梯度
PCR仪(Bio-Rad公司)上进行。应用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 ,以 100bpDNALadderPlus
(BBI)为分子量标准 ,用 BIO-RAD凝胶成像仪观察拍照。
1.4　数据整理和统计分析
扩增谱带按 1/0进行数字化处理:显带记为 “ 1”, 缺失或模糊不清记为 “ 0”, 得到 1 /0矩阵在
NTSYSpcVersion2.10软件中进行处理 [ 13] ,应用 SIMQUAL(SimilarityforQualitativeData)法计算铁灯兔
耳风 、杏香兔耳风和红背兔耳风 3个植物种间的遗传相似系数(F)。用 SAHN(SequentialAgglomerative
HieraricalNestedclusteranalysis)功能 ,根据 UPGMA(非加权成组配对)法进行聚类分析。其中:Nei＆Li
遗传相似系数计算公式为:F=2Ny/(Ni+Nj)(式中:Ny为试样 i和 j公共的条带数 , Ni为试样 i的总带
数 , Nj为试样 j的总条带数)。F值越大 ,其亲缘关系越近;F值越小 ,其亲缘关系越远 。另外根据相似
系数构建聚类图 。
2　结果与分析
2.1　总 DNA质量及 ISSR-PCR体系的建立
　　通过检测和比对得知 , 3种植物基因组 DNA大小约为 23kb;各总 DNA的 OD260 /280值在 1.67 ～
2.00,浓度约 30ng/μL。说明所提取基因组 DNA完整性较好 ,浓度和质量较高 ,适宜用作 ISSR-PCR
检测。通过单因素优化筛选出杏香兔耳风等 3个植物种 ISSR-PCR最佳反应条件为:在总体积为 20
μL的体系中 , DNA模板为 20 ng, Mg2+浓度为 2.0 mmol/L, dNTPs浓度为 0.25 mmol/L,引物浓度为
0.25μmol/L, Taq酶用量为 1U,退火温度为 52℃。优化扩增程序为:94℃预变性 3min;94℃变性 30s,
52℃退火 45s, 72℃延伸 90s,反应 45个循环;最后 72℃延伸 7min。
2.2　3种植物的 ISSR分子鉴别
采用优化好的 ISSR-PCR反应程序和反应体系 ,对 100条 ISSRUBC系列引物进行初步筛选 ,共获
得 32条谱带清晰 、产物丰富的引物 。用 32条初筛引物进一步进行复筛 ,得到 UBC807、UBC811等 20条
重复性好 、扩增谱带清晰 、特异性或多态性好的引物(图 1)。各引物扩增的总条带数在 3 ～ 14 ,扩增出
的 DNA条带大小在 150 ～ 2 000bp。
图 1　不同引物的扩增结果
Fig.1　Theresultsofamplificationfordifferentprimers
M.Marker;箭头示特异性扩增产物;引物自左向右每 10个 1组 ,分别为对铁灯兔耳风 、杏香兔耳风 、红背兔耳风的扩增;A图引物依
次为 UBC807、 811、 814、818、 826、831、834、 835、841、 843;B图引物依次为 UBC845、 853、854、 855、866、887、 889、895、 896、 900
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版)　　　　　　　　　　　　第 32卷　
表 1　兔耳风属 3个近缘种的 ISSR指纹鉴别图谱
　Table1　IdentifyingpatternofISSRfingerprintfor
3 speciesinAinsliaea
引物
Primers
铁灯兔耳风
A.macroclinidioides
杏香兔耳风
A.fragrans
红背兔耳风
A.rubrifolia
UBC807-800bp - + -
UBC826-950bp - - +
UBC826-700bp + - -
UBC834-650bp + - -
UBC835-1000bp - + -
UBC843-1800bp - - +
UBC843-600bp + - -
UBC853-1450bp - + -
UBC895-1500bp + - -
　　注:+表示有带, -表示无带。
　　利用复筛出的 20条引物对 3种植物进行 ISSR
-PCR扩增检测 。结果表明 , 20条引物中有 10条
引物可以扩增出能有效区分铁灯兔耳风 、杏香兔耳
风和红背兔耳风的特异谱带。其中引物 UBC807、
UBC826、UBC834、UBC843扩增谱带可一次性鉴定 3
种植物 。利用引物扩增特异性条带制成的指纹图谱
见表 1,完全可以用于 3个近源种的鉴定识别 。
2.3　聚类分析及亲缘关系分析
利用 NTSYSpcVersion2.10软件对扩增结果进
行统计分析 ,结果显示 ,铁灯兔耳风与杏香兔耳风的
相似系数为 0.614,而与红背兔耳风的相似系数为
0.579;红背兔耳风与杏香兔耳风的相似系数则达到
0.649,两者成组与铁灯兔耳风分离。即 3种植物中 ,铁灯兔耳风与杏香兔耳风亲缘关系较近 ,而与红背
兔耳风较远;杏香兔耳风与红背兔耳风亲缘关系很近 ,而与铁灯兔耳风较远 。
3　结　论
该研究利用 ISSR分子技术对兔耳风属内 3个易混淆近缘种杏香兔耳风 、红背兔耳风和铁灯兔耳风
进行标记 ,筛选引物获得的特异性的 ISSR指纹可以较好地将 3个种鉴别出来;此外通过聚类分析发现
杏香兔耳风与红背兔耳风具有较近的亲缘关系 ,而与铁灯兔耳风亲缘关系远 。筛选出的 20条扩增谱带
清晰 、特异性或多态性好的 ISSR引物 ,为后续 3种种内 、种间天然群体遗传结构分析建立了技术储备;
同时筛选出的 ISSR特异性扩增条带可为后续开发适合兔耳风属内多个药用植物种鉴别的精确 、快速 、
有效的特异性探针奠定技术基础。
[ 参 考 文 献 ]
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(责任编辑　王国栋)
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