全 文 ：第 27卷　第 2期
2011年 3月
福建师范大学学报 (自然科学版 )
Journal of Fujian Normal Univ e rsity ( Na tural Science Edition)
Vo l. 27　 No. 2
Ma r. 2011
文章编号: 1000-5277( 2011) 02-0109-05
铁钉菜乙酸乙酯提取物抗真菌活性的研究
冯美霞1, 2 , 林　勇3 , 刘艳如1 , 张　迪3 , 郑　怡1, 2
( 1. 福建师范大学生命科学学院 , 福建 福州　 350108;
2. 发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室 , 福建 福州　 350108;
3. 福建省农业科学院食用菌研究所 , 福建 福州　 350014)
　　摘要: 分别采用纸片法、 菌饼法及玻片法测定了铁钉菜乙酸乙酯提取物对 3种真菌的抑制作用 . 实验结
果表明: 乙酸乙酯提取物对 3种真菌具有普遍的抑制作用 , 对绿色木霉的抑菌圈达到 2. 60 cm; 经薄层层析
分离后 ,得到 7条层析带 , 用纸片法测定大部分分离带只对 1种真菌显示抑制活性 ,其中 Rf 0. 40带和 Rf 0. 50
带活性较强 , 它们对菌丝生长和孢子萌发也有抑制作用 , 抑制效果与浓度、 培养时间有关 . 此外 , 对 Rf 0. 40
带的 GC-M S分析表明 , 其组分中的化合物以酯、 烷为主 .
关键词: 铁钉菜 ; 乙酸乙酯 ; 薄层层析 ; 抗真菌
中图分类号: Q936　　　文献标识码: A
　收稿日期: 2010-07-05
　基金项目: 福建省科技厅重点项目 ( 2005N036) ; 福建省自然科学基金资助项目 ( 2009 J01126)
　通讯作者: 郑怡 ( 1959-　 ) , 教授 , 主要从事藻类生物技术研究 . zy718@ fjn u. edu. cn
Antifungal Activities of the Ethyl Acetate
Extracts from Ishige okamura Yendo
FENGMei-xia
1, 2
, LIN Yong
3
, LIU Yan-ru
1
, ZHANG Di
3
, ZHENG Yi
1, 2
( 1. College of Lif e Sciences, Fujian Normal University , Fuzhou 350108, China; 2. Fujian Key
Laboratory of Developmental and Neuro Biology , Fujian Normal University , Fuz hou 350108, China;
3. Institute of Edible Fungi , Fujian Academy of A gricultural Sciences , Fuzhou 350014, China )
Abstract: Ethyl acetate ex t racts of Ishige oamurai Yendo w ere tested for the ef ficacy a-
gainst three kinds of fungi by paper disc dif fusion method, co lony disc method and slide
method. The results indicated that ethyl acetate ex t racts could inhibi t all fungi tested and the
inhibi to ry zone of Trichoderma viride reached 2. 60 cm. Thin lay er ch romatog raphy ( TLC)
w as used to separate the ex t racts of ethyl acetate and each band w as examined for thei r anti-
fungal activi ties by paper disc dif fusion method. Of 7 bands, most exhibi ted inhibitory activi ty
only against one kind of fungus. Besides, of which bands o f Rf 0. 40 and Rf 0. 50 had st ronger
activi ty than others. The two bands sti ll inhibi t the mycelial g row th and spo re germina tion of
the fungi and thei r activ ities w ere related to concentration and cul ture time. Furthermo re, the
f raction Rf 0. 40 w as domina ted by ester and alky l through GC-M S analy sis.
Key words: Ishige oamurai Yendo; ethyl acetate; thin lay er chroma tog raphic analy sis;
antifungi
铁钉菜 ( Ishige oamurai Yendo) 为褐藻门 , 褐藻纲 , 索藻目 , 铁钉菜科 , 铁钉菜属的一个常见种 ,
广泛分布在我国东南沿岸 . 铁钉菜是重要的经济和药用海藻 , 近年来诸多学者对铁钉菜的活性物质如
多糖 [1 ]、 蛋白质 (凝集素 ) [ 2]及有机提取物 [3 ]等进行了研究 . 本文报道了铁钉菜乙酸乙酯提取物硅胶薄
层层析分离组分的抗真菌活性及有效组分的化学成分 , 为铁钉菜的天然活性物质开发利用提供参考 .
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　样品
铁钉菜 ( Ishige oamurai Yendo ) 采自福建省平潭县海域 .
1. 1. 2　供试真菌
圆弧青霉 (Penicill ium cyclopium )、绿色木霉 ( Trichoderma v iride )、 黑曲霉 ( Aspergillus niger ) ,
以上 3种真菌菌株由福建农林大学植保学院许文耀教授提供 , 本实验室保存 .
1. 1. 3　试剂
薄层层析硅胶 G60型 (化学纯 ) , 无水乙醇、 乙酸乙酯、 乙醚、 石油醚、 苯、 丙酮、 氯仿、 甲醇、
体积分数 2%碘配溶液 , 以上试剂均为分析纯 AR.
1. 1. 4　仪器
高速万能粉碎机、 SHB-Ⅲ B循环水式多用真空泵、 旋转蒸发器、 VD-650型桌上式洁净工作台、 电
热手提式压力蒸气灭菌器、 ZF-Ⅰ型三用紫外分析、 O LYMPU S CH-2型显微镜、安捷伦 6890 /5973n色
谱 -质谱联用仪 .
1. 2　实验方法
1. 2. 1　样品的处理
海藻采回后 , 用自来水洗去藻体表面的附生物、 盐分等杂质 , 置通风处阴干 , 用植物粉碎机粉碎
至 40目 , 保存于干燥器中备用 .
1. 2. 2　有机溶剂粗提物的制备
称取铁钉菜粉末 500 g, 加入 2 L无水乙醇 , 50℃下恒温浸提 3 d后过滤 ,滤渣再重复提取 1次 , 合
并 2次的提取液 , 真空旋转蒸干得到黑褐色的固体浸膏 , 即铁钉菜乙醇粗提物 , 称量 .
1. 2. 3　粗提物的萃取
在乙醇粗提物中加入 10倍的蒸馏水 , 充分溶解后 , 用乙酸乙酯萃取 , 得到低极性的乙酸乙酯相和
高极性的水相 , 分别蒸干 , 称量 .
1. 2. 4　硅胶薄层层析
层析板的制作: 称取薄层层析硅胶 5 g , 量取 15 mL质量分数为 0. 5%的羧甲基纤维素钠 , 倒入研
钵内研磨 10 min, 后铺板、 颠板、 在光线下观察 , 直至板均匀为止 , 常温下自然风干 . 之后烘箱中 100
℃下活化 30 min.
点样分离: 距离板下沿 1. 5 cm处画上 1条基线 , 然后将浸提液点到基线上 , 重复点样 , 把层析板
放入层析缸 , 展层剂乙酸乙酯相为 V (石油醚 )∶ V (丙酮 ) = 3∶ 1, 水相为 V (氯仿 ) ∶V (甲醇 ) =
2∶ 1[ 4] .用碘缸和石英紫外检测仪检测 ,刮取特征带 (特征带用层析后化合物移动的距离与展层剂移动
距离的比值 Rf 表示 ) , 合并同一实验条件下各个层析板相同的条带 . 其中乙酸乙酯相的特征带用乙酸
乙酯浸泡 , 分离 , 去除硅胶后旋转蒸发浓缩 , 得到乙酸乙酯相不同的薄层层析带样品 .
1. 2. 5　抗真菌活性测定
分别将铁钉菜乙酸乙酯相、水相及薄层层析带样品配成 0. 1 g· mL- 1 ,采用纸片法 [5 ]进行抗真菌活
性检测 ; Rf 0. 40和 Rf 0. 50带配成 0. 050 0, 0. 025 0, 0. 012 5 g· mL- 1 , 采用生长速率法、 载玻片法
测定菌丝生长和孢子萌发抑制活性 .
生长速率法 [6 ]: 在 PDA平板表面中心接种直径为 8 mm的供试真菌菌饼 ,然后用移液枪取 20μL铁
钉菜提取液 , 注射在菌饼周围 . 以等量的乙酸乙酯作为对照 , 每处理重复 3次 . 28℃恒温培养 , 观察
菌丝生长 , 测量直径 , 连续测量 3次 , 记录数据 . 按慕立义的方法计算抑制率 [ 7]:
菌丝生长抑制率= [1- (处理组生长直径 -菌饼直径 ) / (对照组生长直径 -菌饼直径 ) ] × 100% ,
载玻片孢子萌发法: 将活化后的供试真菌转移至 PDA斜面 , 28℃下培养至产孢子 . 用无菌水洗下
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孢子 , 用 4层纱布过滤 , 以血球记数板记数 , 并将孢子悬浮液稀释到每 m L 50 000个 , 放在 4℃冰箱备
用 . 在干燥洁净的试培养皿中滴加 50μL各种提取液 ,然后每管滴加 50μL配制好的孢子悬浮液 ,常温
培养 24 h , 显微镜下观察并记录孢子萌发情况 , 以等量的乙酸乙酯为对照 , 每处理重复 3次 . 按下面公
式计算抑制孢子萌发率:
抑制孢子萌发率= ( 1-处理萌发率 /对照萌发率 ) × 100% .
1. 2. 6　薄层层析组分的化学成分
采用色谱-质谱 ( GC-M S) 法对铁钉菜薄层层析组分进行化学成分分析 . 色谱柱为 HP-FFAP毛细
管柱 , 程序升温 70～ 290℃ , 炉温 40～ 220℃ , 进样口温度 250℃ . 质谱仪电子轰击能量 70 eV, 分流
进样 , 分流比 20∶ 1, 载气为氦气 , 进样量为 1. 0μL.
2　结果与分析
2. 1　铁钉菜萃取物抗真菌活性
采用纸片法测定了铁钉菜萃取物对 3种供试真菌的抑制活性 ,实验结果如表 1所示 ,铁钉菜水相提
取物对 3种供试真菌均无抑制作用 ,而乙酸乙酯萃取物对供试真菌均表现出抑制活性 ,这表明铁钉菜乙
酸乙酯萃取物中存在着具有抗真菌的活性成分 , 其中对绿色木霉菌丝的抑制最为明显 , 抑菌圈宽度达
到 2. 6 cm.
表 1　铁钉菜乙酸乙酯相和水相提取物的抗真菌活性
提取物 抑菌圈宽度 /cm圆弧青霉 黑曲霉 绿色木霉
乙酸乙酯相提取物 1. 35 1. 35 2. 6
水相提取物 - - -
　　　　　　　　注: “- ” 表示没有抑制效果 , 下同
2. 2　铁钉菜乙酸乙酯相的薄层层析带及其抗真菌活性
铁钉菜乙酸乙酯相经硅胶薄层层析 , 得到 Rf 0. 30、 Rf 0. 40、 Rf 0. 50、 Rf 0. 52、 Rf 0. 55、 Rf 0. 60、
Rf 0. 81共 7条不同的特征带 . 以纸片法测定的各分离带抗菌活性 , 结果表明 (表 2) , Rf 0. 50、 Rf 0. 52
对圆弧青霉有一定的抑制效果 , Rf 0. 30、 Rf 0. 81对黑曲霉表现出抗菌活性 , Rf 0. 40、 Rf 0. 50对绿色
木霉抑菌活性相对最强 ,抑菌圈宽度达到 2. 0 cm以上 ,而Rf 0. 60对 3种供试真菌均无抑制作用 .因此 ,
选用 Rf 0. 40和 Rf 0. 50两个活性较强的带进行抑制真菌菌丝生长和孢子萌发实验 .
表 2　铁钉菜乙酸乙酯相薄层层析带的抗真菌活性
薄层层析带 抑菌圈宽度 /cm圆弧青霉 黑曲霉 绿色木霉
Rf 0. 30 - 1. 50 -
Rf 0. 40 - - 2. 0
Rf 0. 50 - - 2. 5
Rf 0. 52 1. 60 - -
Rf 0. 55 1. 80 - -
Rf 0. 60 - - -
Rf 0. 81 - 1. 40 -
2. 3　Rf 0. 40和 Rf 0. 50带组分对真菌菌丝生长的抑制作用
采用菌丝生长速率法测定了 0. 050 0 , 0. 025 0, 0. 012 5 g· mL- 1的 Rf 0. 40和 Rf 0. 50带组分对 3
种供试真菌的抑制活性 , 结果见表 3, Rf 0. 40带组分对 3种供试真菌菌丝生长的作用效果不同 , 而
Rf 0. 50仅对绿色木霉、 圆弧青霉表现出抑制活性 . 其中 Rf 0. 40带对圆弧青霉、 黑曲霉 , Rf 0. 50对绿
色木霉、 圆弧青霉的抑制率均高于分离前的乙酸乙酯萃取物 , 这可能是由于萃取物中一些活性物质相
互拮抗或无活性物质干扰使得其表现较低活性 , 而经过薄层层析分离后这些物质相互分离 , 从而表现
较高活性 . 而与分离前的萃取物相比 , Rf 0. 40带对绿色木霉的抑制率降低了 50%左右 , 究其原因 , 可
111　第 2期　　　　　　　　　　　冯美霞等: 铁钉菜乙酸乙酯提取物抗真菌活性的研究
能是由于萃取物经薄层层析分离后 Rf 0. 40带中抑制活性物质含量降低所导致的 .
随着质量浓度的降低 , 大部分带组分的抑制效果也随之下降 . 有些组分高质量浓度对菌丝生长有
抑制作用 , 低质量浓度反而有一定的促进作用 , 如质量浓度为 0. 012 5 g· m L- 1时 , Rf 0. 40对绿色木
霉表现出 20% ～ 78%的促进率 , Rf 0. 50对圆弧青霉也有 13%～ 89%的促进效果 . 这种促进生长的现象
有可能是受试菌在低质量浓度药剂的逆境胁迫下的应激造成的 .
培养的时间不同 , 各带组分不同质量浓度对菌丝生长的作用也表现出差异 . 大部分组分抑菌活性
随着时间增加而降低 , 如 0. 012 5 g· mL- 1的 Rf 0. 50对绿色木霉 48 h的抑制率达 57. 5% , 96 h降为
2. 2% , 144 h后反而表现出促进作用 . 这可能与菌体在不同生长时期的生物量存在差异、 菌体对活性
物质的代谢等因素相关 .
表 3　铁钉菜薄层层析带对真菌菌丝生长的相对抑制率 %
提取物 绿色木霉 圆弧青霉 黑曲霉
48 h 96 h 144 h 48 h 96 h 144 h 48 h 96 h 144 h
Rf 0. 40( 0. 050 0 g· m L- 1 ) 11. 4 13. 3 10. 8 35. 9 13. 1 10. 8 50. 0 30. 9 16. 0
Rf 0. 40( 0. 025 0 g· m L- 1 ) 12. 5 9. 1 2. 9 38. 1 34. 8 2. 9 30. 0 23. 2 13. 3
R f0. 40( 0. 012 5 g· m L- 1 ) - 20. 0 - 48. 7 - 78. 6 15. 3 6. 2 3. 5 20. 0 11. 9 10. 0
Rf 0. 50( 0. 050 0 g· m L- 1 ) 77. 5 67. 2 52. 1 18. 7 13. 3 2. 1 - - -
R f0. 50( 0. 025 0 g· m L- 1 ) 62. 5 24. 1 15. 7 - 8. 6 - 6. 8 - 3. 7 - - -
Rf 0. 50( 0. 012 5 g· m L- 1 ) 57. 5 2. 2 - 83. 9 - 13. 0 - 16. 3 - 18. 9 - - -
乙酸乙酯萃取物 50. 0 35. 7 22. 7 12. 3 10. 2 5. 4 5. 2 3. 3 2. 5
　　　　注: 负值表示促进作用
2. 4　Rf 0. 40和 Rf 0. 50带组分对真菌孢子萌发的影响
如表 4所示 , Rf 0. 40、 Rf 0. 50带组分的不同质量浓度对 3个供试菌株的孢子萌发均有一定的抑制
作用 , 且抑制活性随着质量浓度的降低而减弱 .
Rf 0. 40、 Rf 0. 50对圆弧青霉、 绿色木霉孢子的抑制活性较强 , 抑制率均高于粗提物 , 且各不同质
量浓度对绿色木霉孢子萌发均表现出极强的抑制效果 , 抑制率为 72%～ 96% , 提高了 30%左右 . 对黑
曲霉的抑制率在 0. 050 g· mL- 1时与粗提物相当 , 但在 0. 025 g· mL- 1时提高了 47%以上 , 而在 0. 012
5 g· mL- 1时反而又低于粗提物 . 分析其原因可能是由于萃取物中存在一些与其中某种抗菌活性成分
相拮抗的成分 , 在拮抗成分质量浓度较高的时候相应的抗菌成分的活性就受到抑制 , 但当质量浓度下
降到一定程度时这种拮抗作用就减弱或者消失 , 相应的抗菌成分的活性就得以表现 , 进而表现为总体
抗菌活性的提高 .
表 4　铁钉菜薄层层析带对真菌孢子萌发的抑制率 %
提取物 d(绿色木霉 ) /( g· m L- 1 ) d(圆弧青霉 ) /( g· mL- 1 ) d(黑曲霉 ) /( g· m L- 1 )
0. 050 0. 025 0 0. 012 5 0. 050 0. 025 0 0. 012 5 0. 050 0. 025 0 0. 012 5
LRf 0. 40 93 86 25 95 88 82 85 72 53
Rf 0. 50 78 42 34 96 81 72 89 86 72
乙酸乙酯萃取物 66 36 32 65 57 37 86 25 92
2. 5　铁钉菜乙酸乙酯薄层层析 Rf 0. 40带成分分析
通过 GC-M S手段分析了铁钉菜乙酸乙酯薄层层析分离组分中抑菌效果较好的 Rf 0. 40条带 , 发现
主要成分为 2-丁氧基乙醇 ( 69. 57% )、 十六烷 ( 0. 52% )、 二十烷 ( 1. 36% )、 二十三烷 ( 1. 40% )、 十
七烷 ( 1. 45% )、 2, 6, 10, 14-四甲基十六烷 ( 1. 14% )、 十四羧酸 ( 1. 54% )、 1, 2-二丁基邻苯二甲
酸酯 ( 0. 63% )、 十九烷 ( 0. 48% )、 十六烷酸 ( 9. 97% )、 三甲基三硅烷 ( 0. 40% ) , 这表明 Rf 0. 40条
带中的化合物以酯、 烷为主 (见图 1) .
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图 1　铁钉菜乙酸乙酯薄层层析 Rf 0. 40带总离子流
3　讨论
前人研究证实了海藻中含有丰富的活性物质 ,不仅具有抗细菌活性 [8- 9 ] ,而且也有良好的抗真菌活
性 [10 ] . 早期的海藻抗菌活性多以有机溶剂粗提物对多种海藻的抗菌活性进行筛选 , 以期找到抗菌活性
强的种类或有效的提取溶剂 [10 ] .之后研究者开始用不同极性的溶剂萃取 ,通过薄层层析进行初步分离 ,
然后测定各分离组分 (带 )的抗菌活性 , 如徐年军等 [8 ]、 林雄平等 [4 ]对一些海藻的萃取相采用薄层层析
分离 ,并测定了不同层析带的抑细菌活性 ,分离的组分抗菌活性均强于分离前的粗提物 ;欧阳桐娇等 [6 ]
对铁钉菜乙醇提取物采用薄层层析法进行分离 , 分离的组分虽然都有一定的抗菌活性 , 但没有分离前
粗提物的活性高 ; 张迪等 [3 ]以铁钉菜氯仿相进行薄层层析分离 ,得到的 6条带对不同的细菌和真菌有一
定的抑制活性 .本实验用铁钉菜的乙酸乙酯相提取物进行薄层层析得到了 7条带 ,它们在对菌丝生长和
孢子萌发具有不同程度的抑制作用 . 以上这些研究为海藻抗菌成分的进一步分离和纯化提供了重要的
参考资料 .
在抗菌实验中 , 检测抗菌活性的方法有纸片法、 菌饼法 (菌丝生长速率法 )、 玻片法 (孢子萌发
法 ) ,但在海藻的抗菌研究中多以纸片法测定 [ 3- 5, 8 ] , 其它两种方面报导的还很少 . 本实验采用以上 3种
抗菌活性检测方法 , 均显示了不同程度的抑制活性 , 增加了海藻抗菌活性物质的检测效率 , 为海藻抗
菌物质研究的实验方法提供了借鉴 .
在对真菌丝生长抑制实验中 , 不同的处理质量浓度下 , 相同薄层层析组分对同一供试真菌会表现
出不同的作用效果 , 既有抑制真菌菌丝生长又有促进真菌菌丝生长的 , 这种促进生长的现象有可能是
供试真菌在低质量浓度药剂的逆境胁迫下的应激造成的 . 随着培养时间的不同 , 大部分组分的抑菌活
性会随时间的增长而降低 , 这与江茂生等 [10 ]报道的艾蒿乙醇提取物对植物病原菌抑制率存在随处理时
间延长而下降的趋势相类似 , 分析其原因可能与菌体在不同生长时期的生物量存在差异、 菌体对活性
物质的代谢等因素相关 .
名组分对供试真菌孢子的萌发有很强的抑制作用 ,且抑制效果一般随着质量浓度的降低而减弱 .但
在 0. 050 g· mL- 1时 ,经薄层层析分离的的组分对黑曲霉的抑制率与萃取物相当 , 而在 0. 025 g· mL- 1
时反而提高了 47%以上 .这可能是由于萃取物中存在着一些与其中某种抗菌活性成分相拮抗的成分 ,在
拮抗成分质量浓度较高的时候相应的抗菌成分的活性就受到抑制 , 但当质量浓度下降到一定程度时这
种拮抗作用就减弱或者消失 ,相应的抗菌成分的活性就得以表现 ,进而表现为总体抗菌活性的提高 .由
此可知 , 粗提物的抗菌活性来自于多种抗菌成分共同作用的结果 .
通过 GC-M S分析 , Rf 0. 40条带的主要成分为 2-丁氧基乙醇 , 相对含量较高达到了 69. 57% , 其具
有辅助乳化和助溶的效果 , 有一定的毒性 , 推测其抗菌活性可能主要来自于 2-丁氧基乙醇 . 至于单一
物质抗菌效果如何 , 有待今后将活性组分进一步分离纯化 , 获得单一组分 , 结构鉴定后并加以活性验
证 .
(下转第 132页 )
113　第 2期　　　　　　　　　　　冯美霞等: 铁钉菜乙酸乙酯提取物抗真菌活性的研究
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(责任编辑: 陈　静 )
(上接第 113页 )
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(责任编辑: 余　望 )
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