全 文 ：为８．９４，在高ｐＨ条件下，主药以分子形式存在，亲
脂性更强，随着ｐＨ的降低主要以离子形式存在，亲
水性更强。其次不同ｐＨ接受液可能会造成透皮皮
肤表面纹理的差异和表面角质层的破坏，进而影响
药物的皮肤透过量和透过速率。
由本研究数据可知自制３个批次乳膏（批号
２０１４０７１５，２０１４０７２０，２０１３０７２１）的平均含量分别为
９７．２％，符合乳膏含量的有关规定［５］（９５．０％～
１０５．０％），且累计渗透量和２４　ｈ皮肤滞留量与原研
制剂（兰美抒）无显著性差异（Ｐ＜０．０５）。
参考文献：
［１］　谢爱民，雍磊．特比萘芬乳膏与咪康唑霜治疗浅部真菌病临床
对比观察［Ｊ］．临床军医杂志，２００５，３３（５）：５５４－５５５．
［２］　Ｇｕｐｔａ　ＡＫ，Ｒｙｄｅｒ　ＪＥ，Ｌｙｎｃｈ　ＬＥ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｎｙｃｈｏｍｙｃｏｓｉｓ　ｉｎ　ａｄｕｌｔｓ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｐｏｐｕｌａ－
ｔｉｏｎｓ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００５，４
（３）：３０２－３０８．
［３］　国家食品药品监督管理局．国家药品标准［Ｓ］．ＷＳ１－（Ｘ－１１５）－
２００４Ｚ．
［４］　进口药品复核标准．ＪＸ１９９９０３６６．
［５］　日本药典委员会．日本药典［Ｓ］．ＪＰ１６，２０１１：１４７３．
［６］　余仕汝，高邵阳，朱红玲，等．盐酸特比萘芬乳膏含量测定方法
的改进研究［Ｊ］．药物分析杂志，２００８，２８（４）：６５６－６５７．
［７］　ＰＵＳＨＰＡ　Ｄ　ＧＯＳＷＡＭＩ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ＲＰ－ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎ　ｂｕｌｋ　ａｎｄ　ｉｎ　ｔａｂ－
ｌｅｔ　ｄｏｓａｇｅ　ｆｏｒｍ：Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ，
２０１３，５（Ｓｕｐｐｌ　３）：５３６－５４０．
［８］　肖学成，肖琴．盐酸特比萘芬乳膏体外透皮吸收研究［Ｊ］．医药
导报，２０１２，３１（３）：３６１－３６３．
［９］　Ｚｈａｎｇ　ＪＰ，Ｗｅｉ　ＹＨ，Ｚｈｏｕ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｔｈｏｓｏｍｅｓ，ｂｉｎａｒｙ　ｅｔｈｏ－
ｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅｓ　ｏｆ　ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ａ　ｃｏｍ－
ｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｐｈａｒｍ　Ｒｅｓ，２０１２，３５（１）：１０９－１１７．
［１０］Ａｌｂｅｒｔｉ　Ｉ，Ｋａｌｉａ　ＹＮ，Ｎａｉｋ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ａｎｄ　ｉｓｏ－
ｐｒｏｐｙｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｏｐｉｃａｌ　ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ　ｉｎ　ｈｕ－
ｍａｎ　ｓｔｒａｔｕｍ　ｃｏｒｎｅｕｍ，ｉｎ　ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ，２００１，２１９（１－
２）：１１－１９．
［１１］兰颐，王琼，安静，等．不同接受液对药物体外透皮试验的影响
［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１３，１９（１３）：７－１０．
［１２］刘俊红，王红，曲鹏飞，等．金黄膏中小檗碱体外透皮吸收研究
［Ｊ］．中成药，２０１４，３６（１）：６５－６９．
［１３］Ｓｉｍｏｎ　ＧＡ，Ｍａｉｂａｃｈ　ＨＩ．Ｔｈｅ　ｐｉｇ　ａｓ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｉｍａｌ
ｍｏｄｅｌ　ｏｆｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｎ：ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ａｎｄ
ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｓｋｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ａｐｐｌ
Ｓｋｉｎ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００，１３（２）：２２９－２３４．
［１４］梁颖，杨建新．４种透皮吸收促进剂对盐酸苯海拉明透皮性能
的影响［Ｊ］．中国药房，２００８，１９（３１）：２４１４－２４１６．
［１５］国家药典委员会．中国药典［Ｓ］．２０１０：附录ⅣＡ．
［１６］美国药典委员会．美国药典［Ｓ］．ＵＳＰ３５－ＮＦ３０，２０１２：４７８９．
［收稿日期］２０１４－１０－１２
［作者简介］王敏，女，硕士，主管药师，研究方向：临床药学，电话：０８９８－６８６２２５７６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｏｍｉｎ７７８８＠１６３．ｃｏｍ　［通讯作者］栗原博，男，教
授，博士生导师，电话：０２０－８５２２７７９１，Ｅ－ｍａｉｌ：Ｈｉｒｏｓｈｉ＿Ｋｕｒｉｈａｒａ＠１６３．ｃｏｍ
五指毛桃水提物对拘束应激性肝损伤的保护作用
王敏１，何蓉蓉２，李怡芳２，韩方璇１，覃业语１，栗原博２　 （１．海南省人民医院药学部，海南 海口５７０３１１；２．暨南大学中
药及天然药物研究所，广东 广州５１０６３２）
［摘要］　目的：研究五指毛桃水提物对拘束负荷诱发小鼠应激性肝损伤的保护作用。方法：将雄性昆明种小鼠随机分为正常
对照组，拘束应激模型组，破壁灵芝孢子粉（ＧＬ）组（５００　ｍｇ·ｋｇ－１）和五指毛桃水提物（ＲＦＨ）低、中、高剂量组（１２５，２５０及５００
ｍｇ·ｋｇ－１），共６组。连续灌胃给药４　ｄ后，除正常对照组外，其余各组小鼠拘束负荷１８　ｈ诱发小鼠应激性肝损伤，分别用赖
氏法测定小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）活性、硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛（ＭＤＡ）含量、Ｇｒｉｅｓｓ化学法测定一氧化
氮（ＮＯ）含量、荧光酶标仪测定肝组织抗氧化能力指数（ＯＲＡＣ）、ＨＰＬＣ法测定谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量、比色法测定谷胱甘肽过
氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）、谷胱甘肽硫转移酶（ＧＳＴ）活性。结果：与拘束应激模型组相比，五指毛桃水提物可以明显降低拘束负荷
小鼠血浆ＡＬＴ活性、肝组织 ＭＤＡ和ＮＯ含量，有效提高肝组织的ＯＲＡＣ指数、ＧＳＨ含量、ＧＳＨ－Ｐｘ和ＧＳＴ活性。结论：五
指毛桃水提物对拘束负荷诱发小鼠应激性肝损伤有一定的保护作用，其作用可能与缓解拘束负荷小鼠的氧化应激状态相关。
［关键词］　五指毛桃；拘束应激；肝损伤；保护作用
［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１５）０６－０５２２－０４　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１５．０６．１２
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｒａｄｉｘ　Ｆｉｃｉ　Ｈｉｒｔａｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ
ＷＡＮＧ　Ｍｉｎ１，ＨＥ　Ｒｏｎｇ－ｒｏｎｇ２，ＬＩ　Ｙｉ－ｆａｎｇ２，ＨＡＮ　Ｆａｎｇ－ｘｕａｎ１，ＱＩＮ　Ｙｅ－ｙｕ１，Ｈｉｒｏｓｈｉ　Ｋｕｒｉｈａｒａ２（１．Ｄｅｐａｒｔ－
ｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｈａｉｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｉｎａｎ　Ｈａｉｋｏｕ５７０３１１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄ－
ｉｃｉｎｅ　＆Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｊｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３２，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｆｉｃｉ　Ｈｉｒｔａｅ（ＲＦＨ）ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｍａｌｅ　ＫＭ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，
·２２５· 中国医院药学杂志２０１５年３月第３５卷第６期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｍａｒ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．６
５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＧＬ　ｇｒｏｕｐ，１２５　ｍｇ·ｋｇ－１　ＲＦＨ　ｇｒｏｕｐ，２５０　ｍｇ·ｋｇ－１　ＲＦＨ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＲＦＨ　ｇｒｏｕｐ．Ａｆｔｅｒ　ｏｒａｌ　ａｄｍｉｎ－
ｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＦＨ （１２５，２５０　ａｎｄ　５００　ｍｇ·ｋｇ－１）ｆｏｒ　４　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｄａｙｓ，ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ　ｆｏｒ　１８　ｈ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｓｔｒｅｓｓｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎ－
ｊｕｒｙ．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ａｓｓｅｓｓｉｎｇ　ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ．Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ（ＴＢＡＲＳ）ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ）ｉｎ　ｌｉｖｅｒ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＮＯ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ
Ｇｒｉｅｓｓ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｏｘｙｇｅｎ　ｒａｄｉｃａｌ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ（ＯＲＡＣ）ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＨ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＧＳＨ－Ｐｘ）ａｎｄ　ｇｌｕｔａ－
ｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｒａｄｉｘ　Ｆｉｃｉ　Ｈｉｒｔａｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ
ＡＬＴ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ，ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＭＤＡ　ａｎｄ　ＮＯ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ；ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＯＲＡＣ，ＧＳＨ，ＧＳＨ－Ｐｘ　ａｎｄ　ＧＳＴ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ，ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｗｉｔｈ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｍｏｄｅｌｓ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｒａｄｉｘ　Ｆｉｃｉ　Ｈｉｒｔａｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｅｘｅｒｔ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｉｅｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ｗｈｉｃｈ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｌｉｅｆ　ｏｆ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ　ｍｉｃｅ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｒａｄｉｘ　Ｆｉｃｉ　Ｈｉｒｔａｅ；ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ；ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ；ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ
　　应激反应是机体在负荷身心压力时表现出的一
种适应性生理过程［１］。拘束应激是目前被广泛采用
的一种模拟心理压力的应激模型，拘束形成损伤的
可能机制有氧化应激［２］。研究结果表明，拘束致氧
化应激使肝脏脂质过氧化增加，抗氧化能力降低导
致肝炎［３］。因此，本实验利用小鼠拘束应激模型评
价天然产物对肝损伤保护作用，并探讨其作用机制。
五指毛桃又名南芪、五爪龙、五指牛奶、土北芪，
为桑科植物粗叶榕的干燥根，原植物分布在我国南
部及西南部地区，为华南地区较常用药用植物，具有
健脾利湿、益肺止咳、舒筋通络的功效，主要用于治
疗脾虚浮肿、食少无力、肝炎、风湿痹痛、肺痨咳嗽等
症，水煎剂临床使用是安全的［４］。近年来，五指毛桃
已有数篇有关化学成分、药理活性及其他方面的研
究报道发表，其主要成分有多糖、黄酮、多酚和氨基
酸等，并证明它具有抗氧化、免疫调节、抗炎镇痛、保
护胃黏膜、改善循环、抗心脑缺氧缺血及化学物质所
致肝毒性等作用［５］。因此，根据五指毛桃的以上作
用，本实验利用拘束应激小鼠模型探讨它的肝损伤
保护作用，旨在为五指毛桃作为药膳广泛应用提供
一定的实验依据。
１　材料
１．１　仪器　高效液相色谱系统包括 ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｌ－
６２００型输液泵，Ｌ－５０２０型柱温箱（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｌｔｄ，Ｊａ－
ｐａｎ），Ｎ２０００色谱数据工作站；ＭＫ３型酶标仪（Ｌａｂ－
ｓｙｓｔｅｍ，Ｈｅｌｓｉｎｋ，Ｆｉｎｌａｎｄ）；ＧＥＮｉｏｓ系列荧光酶标仪
及 Ｍａｇｅｌａｎ工作站（Ｔｅｃａｎ　Ｉｎｃ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒ－
ｌａｎｄ）；ＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸ　Ｔ８型组织匀浆机（ＩＫＡ
Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｓｔａｎｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；３－１８Ｋ型台式高速
冷冻离心机（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｔｔｉｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＢＳ２１０Ｓ
电子分析天平 （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｔｔｉｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＷＨ－
８６１型漩涡混合器（太仓市科教器材厂）；ｐＨ　Ｓ－２５型
酸度计（上海伟业仪器厂）。
１．２　药品与试剂　五指毛桃来源于广东省河源市五
指毛桃ＧＡＰ种植基地，经广州中医药大学中药鉴定
教研室鉴定为桑科植物粗叶榕（Ｆｉｃｕｓ　ｈｉｒｔａ　Ｖａｈｌ），五
指毛桃（Ｒａｄｉｘ　Ｆｉｃｉ　Ｈｉｒｔａｅ）的干燥根。五指毛桃提
液的制备：取五指毛桃药材，用１０倍体积的水浸泡１
ｈ，加热煮沸１　ｈ，趁热滤取药液；再加１０倍量水，煮沸
１　ｈ，合并两次滤液，浓缩至２　ｇ生药／ｍｌ备用，用时加
纯化水稀释至所需浓度。破壁灵芝孢子粉（Ｇａｎｏｄｅｒ－
ｍａ　Ｌｕｃｉｄｕｍ，ＧＬ），由芜湖仁德堂药业有限公司提供，
批号为２０１１０７０６。丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）、丙二醛
（ＭＤＡ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）、谷胱甘肽
硫转移酶（ＧＳＴ）及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（批号
２００６０１７），购自南京建成生物工程研究所。谷胱甘肽
（ＧＳＨ）为 Ｋｏｈｊｉｎ　Ｃｏ，Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）产品，辛烷
磺酸钠（ＳＯＳ）购自Ｔｏｋｙｏ　Ｋａｓｅｉ　Ｋｏｇｙｏ　Ｃｏ，Ｌｔｄ．（Ｔｏ－
ｋｙｏ，Ｊａｐａｎ），甲醇（色谱纯）为江苏汉邦科技有限公
司，６－ｈｙｄｒｏｘｙ－２，５，７，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－ｃｈｒｏｍａｎ－２－ｃａｒ－
ｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（Ｔｒｏｌｏｘ，为维生素Ｅ的水溶性衍生物）、２，
２′－ａｚｏｂｉｓ （２－ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐ　 ａｎｅ） ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
（ＡＡＰＨ）、荧光素钠（ｓｏｄｉｕｍ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）均购自 Ｗａｋｏ
Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）。
１．３　实验动物　清洁级昆明种小鼠，雄性，体质量
１８～２２　ｇ，７周龄，购自南方医科大学实验动物中
心，许可证号：ＳＣＸＫ粤２００６－００１５。饲养温度：（２３
±２）℃，照明时间：每天１２　ｈ（０７∶００—１９∶００）。小
鼠饲养１周后进行实验。
２　方法
２．１　动物分组与模型建立　动物按照实验动物随
机数字表分组方法随机分为正常对照组、应激模型
组、ＧＬ组（５００　ｍｇ·ｋｇ－１）、ＲＦＨ 低、中、高剂量组
（１２５，２５０，５００　ｍｇ·ｋｇ－１），每组１０只。给药剂量为
０．１　ｍｌ·（１０　ｇ－１），ｑｄ，正常对照组和拘束模型组均
灌胃同容量水溶液，给药第４天模型组和给药组小
鼠灌胃３０　ｍｉｎ后进行拘束应激实验。小鼠拘束装
置参照文献［６］为通风良好的５０　ｍｌ尖底聚丙烯塑
·３２５·中国医院药学杂志２０１５年３月第３５卷第６期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｍａｒ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．６
料离心管，给予一次性拘束１８　ｈ（１５∶００—０９∶００），
拘束期间内小鼠禁食禁水，正常对照组小鼠为非拘
束禁食禁水小鼠（图１）。
图１　对小鼠进行拘束的时间表
Ｆｉｇ　１　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｍｉｃｅ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ
２．２　赖氏法测定血浆 ＡＬＴ活性　参照试剂盒说
明书进行测定。
２．３　ＴＢＡＲＳ法测定肝组织 ＭＤＡ含量　参照试剂
盒说明书进行测定。用考马斯亮兰蛋白试剂盒测定
其蛋白含量。
２．４　Ｇｒｉｅｓｓ化学法［７］测定ＮＯ的含量　取１０％肝
组织的生理盐水匀浆液４０μｌ加至１６０μｌ　Ｇｒｉｅｓｓ试
剂中，混匀，静置２０　ｍｉｎ后，在５５０　ｎｍ处测定其紫
外吸光值，根据 ＮＯ标准（Ｙ＝０．０３３　Ｘ＋０．０４１　６，ｒ
＝０．９９９　８）曲线计算肝组织中ＮＯ的水平。
２．５　抗氧化能力指数（ＯＲＡＣ）的测定［８］　小鼠肝
组织的生理盐水匀浆液用３％高氯酸去蛋白，１５　０００
ｒ·ｍｉｎ－１，离心半径３０　ｃｍ，离心１５　ｍｉｎ后稀释到１０
ｇ·Ｌ－１进行实验。取９６孔板每个微孔中加入待测
样品溶液２０μｌ后，再加入上述磷酸钾缓冲液２０μｌ
和１４０μｌ　ＡＡＰＨ（终浓度为１２．８　ｍｍｏｌ·Ｌ
－１），最后
添加２０μｌ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（终浓度为６３　ｎｍｏｌ·
Ｌ－１）启动反应并迅速将酶标板置于预置温度为３７
℃的荧光酶标仪中开始测定。采用动力学方式，每
２　ｍｉｎ测定一个点，至荧光强度衰减为零为止。根
据荧光衰退曲线下积分面积，扣除无抗氧化剂的空
白曲线下面积，得出抗氧化剂的保护面积计算
ＯＲＡＣ的水平。
２．６　ＨＰＬＣ法测定肝组织的 ＧＳＨ 含量［９］　取肝
组织称重后按质量体积比１∶２０添加３％高氯酸，在
冰浴下以１０　０００　ｒ·ｍｉｎ－１，离心半径３０　ｃｍ的转速，
匀浆３０　ｓ并去蛋白。匀浆液在４℃条件下以１０　０００
ｒ·ｍｉｎ－１，离心半径３０　ｃｍ的速度，离心１０　ｍｉｎ，取出
上清液用０．４５μｍ微孔滤膜过滤后－２０℃保存用于
ＧＳＨ分析。ＧＳＨ测定使用日本Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ公
司Ｃｏｓｍｏｓｉｌ系列 ５Ｃ１８柱 （４．６　ｍｍ×１５０　ｍｍ，５
μｍ），流动相：９９　ｍｍｏｌ·Ｌ
－１磷酸盐缓冲液（ｐＨ２．５），
１％甲醇，２００　ｍｇ·Ｌ－１　ＳＯＳ，５　ｍｇ·Ｌ－１　ＥＤＴＡ，磷酸盐
缓冲液由磷酸二氢钠配制，用磷酸调ｐＨ 至２．５使
用。柱温：２５℃，流速：１　ｍｌ·ｍｉｎ－１，电压：６００　ｍＶ，
进样体积：２０μｌ。标准对照ＧＳＨ以０．１　ＮＨＣｌ溶解
并稀释后－２０℃保存。对照品储备液的制备过程
需要在低温条件下进行操作。
２．７　比色法测定肝组织的ＧＳＨ－Ｐｘ活性　根据试
剂盒说明书进行测定。
２．８　ＣＤＮＢ比色法测定肝组织的ＧＳＴ活性　根据
试剂盒说明书进行测定。
２．９　数据处理　实验数据以珔ｘ±ｓ表示，统计学处理
采用Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ－ｔｅｓｔ检验，Ｐ＜０．０５有统计学意义。
３　结果
３．１　对拘束负荷小鼠血浆 ＡＬＴ 活性及肝组织
ＭＤＡ含量的影响　如表１所示，与正常对照组相
比，拘束负荷诱发小鼠血浆 ＡＬＴ 活性和肝组织
ＭＤＡ含量显著升高（Ｐ＜０．０１）。５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＧＬ
对照组，１２５，２５０，５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＲＦＨ给药组均能显
著降低拘束负荷小鼠血浆 ＡＬＴ 活性和肝组织
ＭＤＡ含量（Ｐ＜０．０１）。
表１　ＲＦＨ对拘束负荷小鼠血浆ＡＬＴ活性和肝组织 ＭＤＡ
含量的影响（珚ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｔａｂ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＲＦＨ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｎ　ＡＬＴ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ａｎｄ　ＭＤＡ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ－ｓｔｒｅｓｓ　ｌｏａｄｅｄ　ｍｉｃｅ（珔ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
组别 剂量／ｍｇ·ｋｇ－１　 ＡＬＴ／Ｕ·ｍｌ－１　 ＭＤＡ／ｎｍｏｌ·ｍｌ－１
正常对照组 ２８．０８±４．３１　 １．８７±０．５３
拘束模型组 ８４．０６±７．６５ｂ　 ２．６２±０．２７ｂ
ＧＬ组 ５００　 ６５．３９±５．８１ｄ　 ２．０８±０．１６ｄ
ＲＦＨ　 １２５　 ３８．４７±９．７５ｄ　 ２．００±０．３９ｄ
２５０　 ３７．５９±６．０２ｄ　 １．８７±０．３２ｄ
５００　 ３４．３５±７．１０ｄ　 ２．１３±０．３４ｃ
注：与正常组比较，ａＰ＜０．０５，ｂ　Ｐ＜０．０１；与拘束模型组相比较，ｃ　Ｐ
＜０．０５，ｄ　Ｐ＜０．０１
３．２　对拘束负荷小鼠肝组织ＮＯ含量和ＯＲＡＣ指
数的影响　如表２所示，与正常对照组相比，拘束负
荷小鼠肝组织ＯＲＡＣ指数显著降低（Ｐ＜０．０１），而
ＮＯ含量显著升高（Ｐ＜０．０１）。５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＧＬ对
照组，１２５，２５０，５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＲＦＨ给药组均能显著
升高拘束负荷小鼠肝组织 ＯＲＡＣ指数，显著降低
ＮＯ含量（Ｐ＜０．０１）。
表２　ＲＦＨ对拘束负荷小鼠肝组织ＮＯ含量和ＯＲＡＣ指数
的影响（珚ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｔａｂ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＲＦＨ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｎ　ＮＯ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ
ａｎｄ　ＯＲＡＣ　ｖａｌｕｅｓ　ｉｎ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ－ｓｔｒｅｓｓ　ｌｏａｄｅｄ　ｍｉｃｅ（珚ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
组别 剂量／ｍｇ·ｋｇ－１　ＮＯ／μｍｏｌ·ｍｌ－１　 ＯＲＡＣ／Ｕ·ｍｌ－１
正常对照组 ７．６４±１．０４　 ２　４４３．４９±２００．２５
拘束模型组 １０．７６±１．０６ｂ　 １　０４４．５５±１５０．３５ｂ
ＧＬ组 ５００　 ７．４０±１．２８ｄ　 ２　０４１．４２±２５０．４５ｄ
ＲＦＨ　 １２５　 ７．４６±０．６８ｄ　 ２　１７７．８９±３４３．４６ｄ
２５０　 ７．４２±１．００ｄ　 ２　３６７．６７±２３０．８９ｄ
５００　 ７．３３±１．３０ｄ　 １　９０９．３２±１０８．４１ｄ
注：与正常组比较，ａＰ＜０．０５，ｂ　Ｐ＜０．０１；与拘束模型组相比较，ｃ　Ｐ
＜０．０５，ｄ　Ｐ＜０．０１
３．３　对拘束负荷小鼠肝组织 ＧＳＨ 含量和 ＧＳＨ－
Ｐｘ、ＧＳＴ活性的影响　如表３所示，与正常对照组
·４２５· 中国医院药学杂志２０１５年３月第３５卷第６期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｍａｒ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．６
相比，拘束负荷小鼠肝组织ＧＳＨ 含量显著降低（Ｐ
＜０．０５），５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＧＬ对照组，１２５，２５０，５００　ｍｇ·
ｋｇ－１　ＲＦＨ给药组对拘束负荷小鼠肝组织 ＧＳＨ 含
量的降低均有一定的改善作用（Ｐ＜０．０５）。同时，
实验中我们还观察到拘束负荷小鼠肝组织ＧＳＨ－Ｐｘ
和ＧＳＴ活性显著降低（Ｐ＜０．０１），５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＧＬ
对照组，１２５，２５０，５００　ｍｇ·ｋｇ－１　ＲＦＨ给药组对拘束
负荷小鼠肝组织ＧＰＸ和ＧＳＴ活性的降低均有一定
的改善作用（Ｐ＜０．０５）。
表３　ＲＦＨ对拘束负荷小鼠肝组织ＧＳＨ含量和ＧＰＸ、ＧＳＴ
活性的影响（珚ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｔａｂ　３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＲＦＨ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｎ　ＧＳＨ　ｃｏｎ－
ｔｅｎｔｓ，ＧＰＸ　ａｎｄ　ＧＳＴ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ－ｓｔｒｅｓｓ　ｌｏａｄｅｄ　ｍｉｃｅ
（珚ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
ＧＳＨ
／μｇ·ｇ－１
ＧＳＨ－ＰＸ
／Ｕ·ｍｇ－１
ＧＳＴ
／Ｕ·ｍｇ－１
正常对照组 １８．０５±２．４１　 ６６５．７２±８８．１３　 ４４１．００±６６．６３
拘束模型组 ７．５７±４．７４ａ ４１７．６７±８３．００ｂ　３３１．２０±６３．８０ｂ
ＧＬ组 ５００　 １３．７０±８．１２ｃ　 ６６９．５６±８５．８２ｄ　４４６．４２±９５．５４ｃ
ＲＦＨ　 １２５　 １４．４５±６．３２ｄ　 ６６７．２３±７１．０１ｄ　４１３．２３±４８．２１ｃ
２５０　 １５．４１±５．８０ｄ　 ７００．５１±１３９．８３ｄ　４４１．２５±４３．１３ｄ
５００　 １７．３４±６．６６ｄ　 ７０２．３６±１００．１２ｄ　４９４．０７±５８．１５ｄ
注：与正常组比较，ａＰ＜０．０５，ｂ　Ｐ＜０．０１；与拘束模型组相比较，ｃ　Ｐ＜０．０５，
ｄ　Ｐ＜０．０１
４　讨论
肝损伤是多因素参与的一个复杂病理过程，在
其病变过程中多种酶、自由基以及脂质过氧化反应
均发生着较大变化。通过本实验我们发现小鼠拘束
负荷１８　ｈ后血浆 ＡＬＴ活性明显升高的同时，脂质
过氧化产物 ＭＤＡ含量也显著增高，表明拘束负荷
引起的肝损伤过程可能与机体氧化应激状态相关。
五指毛桃中的多糖、黄酮、多酚和氨基酸具有较强的
清除自由基能力，有良好的抗氧化应激活性［５］。有
研究证明五指毛桃水煎剂是通过抑制细胞内的自由
基，抗脂质过氧化起到可卡因所致急性肝损伤保护
作用［１０］。本实验研究也发现，在拘束负荷应激条件
下，五指毛桃水提物给药后能显著改善小鼠血浆
ＡＬＴ活性和 ＭＤＡ含量，表明五指毛桃水提物可以
通过缓解应激负荷引起的脂质过氧化状态，改善肝
损伤的程度。此外，拘束模型组引起的小鼠肝组织
ＯＲＡＣ指数，ＧＳＨ含量、ＧＳＨ－Ｐｘ和ＧＳＴ活性明显
降低，而五指毛桃水提物能显著提高小鼠肝组织
ＯＲＡＣ和ＧＳＨ含量，改善ＧＳＨ－Ｐｘ和ＧＳＴ活性下
降的趋势。同时，拘束负荷小鼠肝组织 ＮＯ显著升
高，而五指毛桃水提物对改善拘束负荷小鼠肝组织
的ＮＯ含量有一定的作用，减少氧化应激状态对机
体功能的影响。拘束应激也可以使自然杀伤细胞和
Ｔ淋巴细胞失活，从而影响机体免疫功能［１１－１２］。免
疫功能低下是肝组织损伤诱因之一［１３－１４］。研究［１５］
表明五指毛桃具有提高免疫功能低下小鼠的细胞免
疫和体液免疫功能，因此五指毛桃对拘束应激性小
鼠肝脏损伤的保护作用，也可能通过提高免疫力以
保护肝脏，但其作用机制有待进一步研究。
综上所述，五指毛桃水提物对拘束负荷诱发小
鼠应激性肝损伤有一定的保护作用，其作用可能与
缓解拘束负荷小鼠的氧化应激状态相关。近年来从
天然资源中寻找活性物质用于防止疾病和维持机体
健康已成为人们关注的话题，因此五指毛桃水提物
具有较好的研究开发前景。
参考文献：
［１］　Ｒｏｓｃｈ　ＰＪ．Ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｍｅｍｏｒｙ　ｌｏｓｓ：ｓｏｍｅ　ｓｐｅｃｕｌａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｓｏ－
ｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｅｓｓ　Ｍｅｄ，１９９７，１３（１）：１－６．
［２］　何蓉蓉，姚新生，栗原博．拘束应激动物模型的研究现状与应用
［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２００８，１４（１１）：８０－８３．
［３］　王敏，王大平，王文芳，等．保利甘胶囊对拘束负荷引起小鼠肝
损伤的保护作用［Ｊ］．中药新药与临床药理，２００９，２０（５）：４１２－
４１５．
［４］　李明，陈志维，黎玉翠，等．ＨＰＬＣ测定五指毛桃中补骨脂素和
芹菜素的含量［Ｊ］．中药新药与临床药理，２００９，２０（１）：５３－５４．
［５］　林慧，梅全喜，曾聪彦，等．五指毛桃化学成分及其药理活性研
究概况［Ｊ］．今日药学，２０１２，２２（８）：４８４－４８６．
［６］　Ｙａｍａｏｋａ　Ｙ，Ｋａｗａｋｉｔａ　Ｔ，Ｎｏｍｏｔｏ　Ｋ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａ
ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕ－ｚｈｏｎｇ－ｙｉ－ｑｉ－ｔａｎｇ （Ｊａｐａｎｅｓｅ
ｎａｍｅ：Ｈｏｃｈｕ－ｅｋｋｉ－ｔｏ），ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｕｓｃｅｐ－
ｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，
２０００，４８（１）：３５－４２．
［７］　郑荣波，黄晓丹，何蓉蓉，等．决明子提取物对链脲佐菌素诱发
糖尿病小鼠晶状体氧化应激状态的影响［Ｊ］．中国实验方剂学
杂志，２０１２，１８（９）：２３３－２３７．
［８］　续洁琨，姚新生，栗原博．抗氧化能力指数 （ＯＲＡＣ）测定原理
及应用［Ｊ］．中国药理学通报，２００６，２２（８）：１０１５－１０２１．
［９］　ＨＥ　Ｒｏｎｇ－ｒｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｍｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｃｏｎｇ－ｚｈｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃ－
ｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｐｐｌｅ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｓｔｒｅｓｓ－ｐｒｏｖｏｋｅｄ　ｉｎｆｌｕ－
ｅｎｚａ　ｖｉｒａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｅｓｔｒａｉｎｔ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ａｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，
２０１１，５９（８）：３７３０－３７３７．
［１０］蔡青圆，陈虎彪，赵中振，等．五指毛桃拮抗毒品可卡因的肝
毒性作用及其活性成分研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００７，３２
（１２）：１１９０－１１９３．
［１１］Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ，Ｍａｔｓｕｎａｇａ　Ｋ．Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｅｒ
（ＮＫ）ｃｅｌｓ　ｔｏ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｓｔｏｒａ－
ｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｉｎｉｃｓ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ
Ｂｉｏｔｈｅｒ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ，１９９８，１３（４）：２７５－２９０．
［１２］Ｇｅｌｄｅｒｍａｎ　ＫＡ，Ｈｕｌｔｑｖｉｓｔ　Ｍ，Ｈｏｌｍｂｅｒｇ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｔ　ｃｅｌ　ｓｕｒｆａｃｅ
ｒｅｄｏｘ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　Ｔ　ｃｅｌ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ
［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００６，１０３（３４），１２８３１－１２８３６．
［１３］Ｓｃｈｅｐｅｔｋｉｎ　ＩＡ，Ｑｕｉｎｎ　ＭＴ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｍａｃｒｏ－
ｐｈａｇｅ　ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．Ｉｎｔ
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００６，６（３）：３１７－３３３．
［１４］王娟弟，李平，李玉民．肝损伤治疗药物的研究进展［Ｊ］．中国
医院药学杂志，２０１３，３３（１８）：１５２８－１５３０．
［１５］周添浓，王艳，刘丹丹，等．五指毛桃不同提取物补益作用的实
验研究［Ｊ］．中药材，２００９，３２（５）：７５３－７５７．
［收稿日期］２０１４－０４－０３
·５２５·中国医院药学杂志２０１５年３月第３５卷第６期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｍａｒ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．６